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免疫组化一抗二抗原理一、免疫组化技术原理免疫组化技术是一种重要的生物化学检测方法，通过使用一抗和二抗的相互作用，来检测目标物质在细胞或组织中的分布和定量。
其原理主要包括以下几个步骤：1. 抗原表达和固定：首先，需要提取或制备出待检测物质的抗原，并将其固定在载玻片或微孔板上。
2. 样品处理：将待检测的细胞或组织样品处理，使其表达出目标物质。
3. 一抗处理：将经过特异性识别的一抗加入样品中，一抗能够与目标物质发生特异性结合，并形成抗原-抗体复合物。
4. 二抗处理：加入与一抗来源物种不同的二抗，二抗能够与一抗发生特异性结合，并进一步增强抗原-抗体复合物的信号。
5. 检测信号放大：通过连接二抗的酶标记物或荧光标记物，可以进一步放大信号。
6. 显色或荧光检测：通过加入适当的显色剂或荧光探针，可以将特定信号转化为可见的颜色或荧光。
7. 显微镜观察：使用显微镜观察和分析样品中的标记信号分布情况，从而确定目标物质的位置和数量。
二、免疫组化技术应用免疫组化技术广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域。
具体应用包括：1. 细胞和组织定位：通过标记特定抗原或蛋白质，可以确定其在细胞或组织中的定位，帮助研究者了解其功能和相互作用。
2. 疾病诊断：免疫组化技术可以检测疾病标志物，如癌症标志物、病毒抗原等，用于早期诊断和病情监测。
3. 药物研发：免疫组化技术可用于评估药物在细胞或组织中的靶点表达和药效。
4. 免疫组织化学：通过标记细胞或组织中的特定分子，可以帮助鉴定组织类型、识别病理变化以及评估治疗效果。
5. 免疫组化芯片：免疫组化芯片技术结合了高通量技术和多路复用的优势，可以快速、准确地检测多个标志物，有望在个性化医疗中得到广泛应用。
三、免疫组化技术的发展前景随着生物技术和分子生物学的不断发展，免疫组化技术也在不断创新和改进。
未来的发展方向主要包括：1. 自动化和高通量：通过引入自动化设备和流程，提高实验的标准化和效率，同时实现多个标志物的高通量检测。
免疫组化免疫组化是组织化学的一种，它是利用已知的特异性抗体或抗原能特异性结合的特点，通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂，如酶、金属离子、同位素等，显示一定的颜色，并借助显微镜观察其颜色的变化，从而在抗原抗体结合部位确定组织、细胞结构的化学成份或化学性质。
免疫组化试剂盒：Vector Laboratories公司VECTASTAIN@ ABC免疫组化试剂盒：Vector公司于1977年率先开发出了生物素-亲和素系统，该产品系列是检测方法上的重要革命。
其后，公司发展出ABC技术（Avidin : Biotinylated Enzyme Complex Technology，亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术），并建立了著名的VECTASTAIN®ABC系统，目前，该系统被视为最灵敏、最可靠与最有效的染色系统，并被广泛应用于免疫组织化学、免疫电镜、原位杂交与凝集素化学中。
ABC技术利用生物素和卵白素具有极高亲和性的生物学特征，将卵白素和生物素化辣根酶按照一定的比例混合，形成ABC复合物。
该法亦被称作三步法，第一步为biotin化二抗和一抗结合，第二步为avidin（亲和素，A液）和二抗上的biotin结合，第三步为HRP偶联的biotin（B液）和avidin结合，而HRP再催化底物显色完成染色。
试剂盒组份：2ml试剂A（Avidin DH溶液）2ml试剂B（生物素化的酶）1ml生物素化的二抗（1.5mg anti-IgG/0.5mg anti-IgM抗体/2.1mg通用抗体）3ml阻断血清其中standard试剂盒只含有试剂A和试剂BVECTASTAIN®ABC系列产品VECTASTAIN®ABC-HRP Kits（辣根过氧化物酶）最通用的系统，使用范围广VECTASTAIN®ABC-AP Kits（碱性磷酸酶）灵敏度较高，染色密度较低，适于形态学染色非常重要的组织VECTASTAIN®ABC-GO Kits（葡萄糖氧化酶）灵敏度较低，适用于组织内源性HRP或AP 含量比较高的组织，常与HRP或AP系统配合进行双染。
免疫组化ABC试剂盒(VECTOR)操作流程一、工作液准备1、封闭血清（黄色小瓶子）：3滴原液+10mL的缓冲液混合，装入黄色的大瓶子；2、生物素二抗（蓝色小瓶子）：1滴原液+10mL的缓冲液混合，装入蓝色的大瓶子；3、ABC复合物：2滴A液加入10mL的缓冲液混合后，加入2滴B液混匀后装入标有ABC 的大瓶子。
此处反应需要30min。
1滴大概50uL4、试剂（自备）二甲苯、PBS缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、一抗稀释液：3%BSA in TBS，pH7.4DAB工作液：1ml PBS加入50ul DAB stock solution 、50ul Hydrogen Peroxide solution充分混匀二、步骤1.脱蜡和水化脱蜡前，应将组织切片在室温中放置60min或60℃恒温箱中烘烤20min。
1）组织切片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min；2）无水乙醇中浸泡5min；3）95%乙醇中浸泡5min；4）70%乙醇中浸泡5min；2.PBS洗两次各5min。
3.抗原修复，用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片。
煮沸热修复电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织切片加热10~15min，必须等缓冲液冷却后，方能将切片取出。
4.PBS洗5min。
5.用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10min，PBS洗3次，每次2min。
6.滴加封闭血清工作液，室温封闭20min，以减少非特异背景，无需冲洗只需吸去多余血清。
7.滴加一抗，室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45min）。
8.PBS洗3次每次2min。
9.滴加生物素二抗工作液，室温度孵育30min。
10.PBS洗3次每次2min。
11.滴加ABC复合物（提前30min，A液与B液等量混合），室温孵育30min。
12.PBS洗3次每次2min。
13.DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。
⼆步法抗兔、⿏通⽤型免疫组化检测试剂盒FOR RESEARCH USE ONLY.Code No:GK500705Storage: Store vial at 2-8.℃Intended UseChemMate? EnVision? Detection Kit, Peroxidase/DAB, Rabbit/Mouse, is intended for use inimmunocytochemistry together with the TechMate? and Autostainer Instruments. The kit is employed in atwo-step procedure where the first step is incubation of the tissue with an optimally diluted primary rabbit ormouse antibody, and the second step is incubation with the ChemMate? EnVision?/HRP , Rabbit/Mouse(ENV) reagent of the kit. This reagent is a peroxidase-conjugated polymer, which also carries antibodies torabbit and mouse immunoglobulins. The reaction is visualized by the ChemMate? DAB+ Chromogen alsoincluded in the kit.Reagents Materials providedBottle A ChemMate? DAKO EnVision?/HRP , Rabbit/Mouse (ENV)5 mL, ready-to-useDextran coupled with peroxidase molecules and goat secondary antibody molecules against rabbit andmouse immunoglobulins. In buffered solution containing stabilizing protein and preservative.Bottle B ChemMate? Substrate Buffer2*6.25 mLBuffered solution containing hydrogen peroxide and preservative.Bottle C ChemMate? DAB+ Chromogen1*0.25mL, 50 x concentrated3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride in organic solvent. The colour of this reagent may vary from strongviolet to colourless without having any influence on the performance of the kit.Precautions ：1. Bottle A , ChemMate? EnVision?/HRP , Rabbit/Mouse (ENV), contains material of animal origin and it cannot be excluded that trace amounts of human material could be present due to manufacturing procedures. As with any product derived from biological sources, proper handling should be used.2. Do not expose Bottle C , ChemMate? DAB+ Chromogen or the Substrate Working Solution (CHROM) to strong light.3. Bottle C , ChemMate? DAB+ Chromogen contains 1.5% 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride, and is labelled: Harmful.Storage ：Store the kit at 2-8 . The prepared Subs ℃trate Working Solution (CHROM) should be stored at 2-8 and used℃within 5 days.Quality Control ： Each staining run should include a known positive control specimen to ascertain a proper performance of all the applied reagents. If the positive control specimen fails to demonstrate positive staining, labelling of test specimens should be considered invalid. A negative control reagent should be used with each specimen to identify any non-specific staining. If non-specific staining cannot be clearly differentiated from the specific staining, the labelling of the test specimen should be considered invalid.Please contact us for more information about this product.EnVision? Detection Kit,Peroxidase/DAB, Rabbit/Mouse⼆步法抗兔/⿏通⽤型免疫组化检测试剂盒剂型：⼯作液编号：GK500705适⽤：⼀抗为兔抗或⼩⿏抗的免疫组化检测储存：2-8℃该试剂盒是⼀个特别敏感的⼆步法免疫组化试剂盒，适合与兔抗抗体或⼩⿏抗抗体配⽤。
免疫组化实验报告及流程试剂：即用型免疫组化Elivision plus 试剂盒（鼠|兔）（迈新KIT-9901）（迈新KIT-9902）二抗批号1203209901效期201301120502405C 效期201304试剂A：增加剂试剂B：酶标羊抗鼠兔抗IgG聚合物DAB显色试剂盒（迈新KIT 0031）溶液：蒸馏水、（PH7.25~7.35）、柠檬酸（PH6.0）、乙醇（无水、95%、85%、75%）、二甲苯、双氧水、苏木素等溶液配制：1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC1 37mmol/L，KCl2.7mmol/L ,Na2HPO4 3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L.2. 0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。
3. 3%蒸馏水或甲醇H2O2溶液，用30%H2O2和蒸馏水或甲醇溶液配制。
仪器：移液器、微波炉、微波修复盒、玻璃器皿等。
流程简介样本来源：迈新阳性片抗体（简称）：CD34 (兔源)浓度选用：CD34 1:200免疫组化染色步骤1.石蜡切片脱蜡至水，二甲苯（两缸5min、5min）、梯度酒精（无水、95%、85%、75%）每缸5min，PBS冲洗3次，每次三分钟。
2.微波修复，高火2~3min，中火5min，低火5min，冷却至室温，PBS冲洗3次，每次三分钟3.3%双氧水阻断内源性过氧化物酶室温（18~30度）10~30min。
PBS冲洗3次，每次三分钟。
4.5%BSA孵育30min5.滴加一抗（客户自选），4度过夜。
PBS冲洗3次，每次三分钟。
6.除去PBS，每张切片滴加50ul聚合物增加剂A,室温孵育20min，PBS冲洗3次，每次三分钟。
7.除去PBS，每张切片滴加50ul试剂B酶标羊抗鼠兔抗IgG聚合物，室温孵育30min，PBS冲洗3次，每次三分钟。
8.除去PBS，每张切片滴加50ul新鲜配制的DAB,镜下观察。
免疫组织化学技术一，流程图:二，详细操作：（一）制作石蜡切片(详见后面的材料)（二）脱蜡,透明,水化1）脱蜡前先60度烘片30-40min;2）二甲苯脱蜡透明：将切片置于二甲苯中(3缸），各15min。
注意：若标本放入二甲苯后出现水雾或标本不呈现透明色，说明脱水没有脱干净，可重新放置二甲苯中；液体一定要没过标本3)梯度乙醇入水:将切片依次置入100％乙醇，95%乙醇,90%乙醇，80％乙醇,70%乙醇中，纯水(自己接）,各5min；（三）抗原修复操作：1)6min45s烧开修复液(柠檬酸0。
2g+柠檬酸三钠1.5g蒸馏水稀释至500mL，PH为6。
0）2）将组织放入修复液置于微波炉中焖5分钟3）将修复液1min20s再烧开4）组织再焖5分钟5）取出烧杯,使液体和组织自然冷却6）PBS冲洗3分钟1次,0.1％triton 10min（破坏细胞膜），PBS冲洗3分钟1次（四）孵育操作:1）阻断内源性过氧化物酶:将切片置于3%过氧化氢10min，PBS冲洗3分钟x3次；2）封闭（非特异性染色阻断剂）：每个脑片35ul山羊血清，室温下孵育30分钟（注意:此步操作后不用PBS冲洗）;3）加一抗(PCNA兔抗大鼠）:滴加适当比例稀释的一抗工作液（1:200比较好)2h，PBS冲洗3分钟⨯ 3次；加完一抗后，最好4度冰箱过夜，注意标本要保持湿度，可放在湿盒，第二天在37度或者室温复温30-40min，复温也要放在湿盒内4）加二抗(生物素标记的羊抗兔IgG复合物）：室温孵育10分钟，PBS冲洗3分钟⨯ 3次；5)加链霉菌抗生物素蛋白—过氧化物酶：室温孵育10分钟，PBS冲洗3分钟⨯ 3次；（五）显色1）DAB染色：每个脑片35ul新鲜配制的DAB显色液，室温孵育10—20s（颜色有变就好,条件要自己摸）→大量自来水冲洗。
2）苏木素复染：苏木素染色30s（可以用塑料架子浸泡或者枪头滴）→自来水冲洗→PBS溶液返蓝10-20min(还可以浸泡10min的纯水）3）脱水，透明,封片：梯度乙醇脱水→二甲苯透明2—3分钟→中性树胶封片(现用电吹风吹干片,直接用中性树脂封片，晾干,观察片有脏时,可以用二甲苯擦洗背面）备注:1、PBS配制：团队常用一包PBS粉末，配制2000ml纯水，加6ml 的NAOH,PH在7。
即用型第二代免疫组化EliVision TM plus广谱试剂盒Data sheet: 40405a适用于一抗：产品编号:Mouse/Rabbit KIT-9901/9902/9903前言即用型第二代免疫组化E liVision TM plus广谱试剂盒在第一代E liVision TM试剂盒基础上，将多个抗鼠和抗兔的IgG分子与辣根过氧化物酶聚合，所形成的聚合物直接与一抗结合，从而放大了抗原抗体结合的信号。
此试剂盒是基于聚合物技术的新一代免疫组化非生物素检测系统，放大功率更高，操作简便，背景更清晰，鼠、兔抗体均适用，核定位更强。
应用范围适用于免疫组织化学方法以显示抗原的分布，适用于常规福尔马林固定石蜡包埋切片、冰冻切片、培养固定的细胞涂片，以及新鲜制备的血涂片等，尤其适合于生物素含量较高的组织细胞或因抗原修复后内源性生物素背景影响的免疫组化研究。
试剂盒组成试剂A: Polymer Enhancer 6.0ml/18ml/110ml 试剂B: Polymerized HRP-Anti Mouse/Rabbit IgG 6.0ml/18ml/110ml试剂盒规格及贮存条件规格：6ml(120片)/18ml(360片)/110ml(2200片)贮存条件：本试剂盒宜4℃保存，稳定期1年免疫组化染色步骤1.石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4)冲洗三次，每次3分钟（3x3`）。
2.根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。
3.如果有必要，每张切片加1滴或50μl的3%H2O2，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。
PBS冲洗3x3`。
4.除去PBS液，每张切片加1滴或50μl的第一抗体(用户自选)，室温下孵育60分钟或4℃过夜，建议参见每种抗体的说明书。
5.PBS冲洗3x5`。
除去PBS液，每张切片加1滴或50μl聚合物增强剂(试剂A)，室温下孵育20分钟。
PBS冲洗3x3`。
6.除去PBS液，每张切片加1滴或50μl酶标抗鼠/兔聚合物（试剂B），室温下孵育30分钟。
(HopeBiot) 镇江厚普生物科技有限公司Zhenjiang Hope Biotechnology Co.，Ltd订货电话：*************传 真：*************网 站：http:// E-mail ：*******************Histostain-Plus Kits免疫组化染色试剂盒货号：SP-9002简介: 本试剂盒为美国ZYMED 公司SP 系列试剂盒，全称为过氧化物酶标记的链霉卵白素（Streptavidin/Peroxidase ）染色试剂盒。
由美国ZYMED 公司于1986年首建。
由于链霉卵白素的分子量是60kDa ，有四个亚基和生物素结合，等电点为6.5，所以该方法具有灵敏度高、特异性强、背景清晰、成本低廉的优点，是理想的免疫组化染色方法。
包装：试剂（无色液体）： 3％ H 2O 2去离子水， 6ml ；试剂A （蓝色液体）：封闭用正常山羊血清工作液， 6ml ；试剂B （黄色液体）：生物素化山羊抗小鼠IgG 二抗工作液， 6ml ；试剂C （橙色液体）：辣根酶标记链霉卵白素工作液（S-A/HRP ），6ml 。
标本染色步骤：1， 石蜡切片，常规脱蜡至水。
2， 蒸馏水冲洗，PBS 浸泡5分。
（如需采用抗原修复，在此步骤后进行） 3， 3％ H 2O 2去离子水（无色液体）孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶活性。
4， 滴加试剂A （蓝色液体）室温孵育10-15分钟，倾去，勿洗。
5， 滴加适当比例稀释的一抗，37℃孵育2-3小时或4℃过夜。
6， PBS 冲洗，3分钟×3次。
7， 滴加试剂B （黄色液体），室温或37℃孵育10-15分钟。
8， PBS 冲洗，3分钟×3次。
9， 滴加试剂C （橙色液体），室温或37℃孵育10-15分钟。
10，PBS 冲洗，3分钟×3次。
11，显色剂显色DAB 。
12，自来水充分冲洗。
免疫组化原理步骤及试剂免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种广泛应用于生物医学领域的实验技术，用于检测组织切片中特定抗原的分布和表达水平。
它结合了免疫学和组织学的原理，能够在组织切片上定位和检测抗原，并通过染色方法将抗原可视化，从而实现对抗原的定性和定量分析。
免疫组化实验的步骤通常包括固定、脱脂、抗原修复、抗体和检测步骤。
下面将详细介绍每个步骤的操作和常用试剂。
1.组织固定：组织固定的目的是保持组织结构完整并固定细胞的抗原。
常用的固定试剂包括10%中性缓冲福尔马林（10% neutral buffered formalin，NBF）和乙醇等。
2.脱脂：脱脂是将组织切片中的脂质去除，以提高抗体对抗原的结合效率。
常用的脱脂试剂包括二甲苯、甲醛和乙醚等。
3.抗原修复：抗原修复是为了使被固定的组织恢复原样，增强抗原的可检测性。
抗原修复的方法包括热处理、酶解法和pH调整等。
常用的抗原修复试剂包括热解剂例如EDTA缓冲液、Tris-EDTA缓冲液，酶解剂例如胰蛋白酶和蛋白酶K，以及甲酸、盐酸等酸性溶液。
4.抗体：5.检测：检测步骤用于将抗原-抗体复合物可视化。
这通常通过染色方法完成。
常用的染色方法包括免疫酶标记、免疫荧光和免疫金标记等。
免疫组化实验所需的试剂种类繁多，下面列举一些常用的试剂：1. NBF（10% neutral buffered formalin）：用于组织固定，保持组织形态完整。
2.二甲苯：用于脱脂步骤，去除组织中的脂质。
3.甲醛：用于脱脂步骤。
4.乙醚：用于脱脂步骤。
5.EDTA缓冲液：用于抗原修复的热解剂。
6. Tris-EDTA缓冲液：用于抗原修复的热解剂。
7.胰蛋白酶：用于抗原修复的酶解剂。
8.蛋白酶K：用于抗原修复的酶解剂。
9.盐酸：用于抗原修复的酸性溶液。
10.一抗：选择特异性良好的一抗抗体，常用的有多克隆和单克隆抗体。
11.二抗：用于检测一抗结合的抗体，常用的二抗有反兔、反小鼠或反人的多克隆抗体。
E-mail:Website: 2-step plus Poly-HRP Anti Rabbit/Mouse IgG Detection SystemCat. No: E-IR-R211Size: 3 mL/ 6 mL/ 18 mL产品编号产品名称 3 mL 6 mL 18 mL Storage E-IR-R211A 3% H2O2 3 mL 6 mL 18 mL 2~8°CE-IR-R211B Polymer Helper (Ready-to-Use) 3 mL 6 mL 18 mL 2~8°CE-IR-R211C Polyperoxidase-anti-Mouse/Rabbit IgG (Ready-to-Use) 3 mL 6 mL 18 mL 2~8°C说明书一份产品简介Elabscience 公司最新推出的二步法免疫组化试剂盒，将二抗的单价Fab 片段和过氧化物酶HRP 聚合在一起，替代传统方法中的二抗和三抗，直接放大抗原抗体结合的信号，既保留了抗体特异性结合抗原的能力，又可有效地避免聚合分子过大而造成的空间位阻。
与传统的SP三步法相比，此试剂盒具有简单、快速、敏感等特点，试剂盒不再使用生物素，避免了由于内源性生物素所造成的背景染色。
本产品可用于检测一抗是Rabbit和Mouse来源的单克隆抗体或多克隆抗体，本品独特的聚合物辅助剂有利于大分子的检测系统更好地结合所检测的一抗分子。
此检测系统是目前已知的灵敏度最高的免疫组化检测系统。
使用说明1.脱蜡、水化组织切片。
2.根据所应用的抗原抗体要求，对组织切片进行抗原修复。
3.加E-IR-R211A 3% H2O2，孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶。
4.PBS或TBS 冲洗，3分钟×3次。
5.滴加适当稀释的一抗，室温或37°C孵育1~2小时或4°C过夜（后37°C复温30 min），PBS 或TBS冲洗，3分钟×3次。
小鼠TNF TNF--α免疫组化试剂盒免疫组化试剂盒该试剂盒以HRP 标记的链霉亲和素复合物（HRP Streptavidin Conjugate，HRP-SA）为基础，可用于检测细胞、组织内的特异性TNF-α抗原。
该试剂盒具有灵敏度高、特异性强、定性定位准确、背景清晰。
在所用的TNF-α一抗与相应靶抗原结合后，用生物化二抗与一抗特异性结合，最后加入HRP-SA，形成抗原—特异一抗—生物素化二抗—HRP-SA 复合物，显微镜下观察成像。
试剂盒所含试剂试剂盒所含试剂：：试剂A 通透液：0.1% Triton-X 100 10 mL（选用）试剂B 封闭缓冲液（封闭用） 20 mL试剂C （原装进口分装）已稀释的即用型TNF-α一抗（2.5ml） 试剂D （原装进口分装）生物素化羊抗兔IgG 1支（浓度1.5 mg/mL，稀释比为1:300~1:500）50 μL+抗体稀释液20ml 试剂E HRP-SA 复合物1支（浓度1 μM，稀释比1:50~1:200）100 μL 试剂F DAB 显色液 5ml用户自备试剂用户自备试剂：：1． 10mM TBS（pH7.2~7.4）三羟基氨基甲烷1.21g氯化钠7.6g加蒸馏水800mL，浓盐酸调pH 值至7.2~7.4，最后定容至1000mL TBS-T：TBS+Tween 20（0.05%体积比）2．抗原修复液（依检测抗原不同而选择不同的修复液）10mM pH6.0 柠檬酸缓冲液柠檬酸0.38g柠檬酸三钠2.45g加蒸馏水900mL，浓盐酸调pH 值至6.0，最后定容至1000mL或：0.5M EDTA 修复液（pH8.0）EDTA·2H2O 186.1g柠檬酸三钠2.45g加蒸馏水700mL，用10mM NaOH 调pH 值至8.0，最后定容至1000Ml3. 缓冲甘油封固剂10 mL4. Tween 20 5 mL石蜡包埋组织切片免疫染色石蜡包埋组织切片免疫染色实验步骤实验步骤（（建议方案建议方案）：）：石蜡包埋组织切片3~4μm 厚度1.烤片： 将待做切片置于切片架上，于60℃恒温烤箱中至少烤1 hr；2.脱蜡： 切片放入盛有二甲苯的容器中脱蜡3次（即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），每次10 min；3.水化： 切片经下行酒精水化，无水乙醇5min，95%乙醇2次（每次2min），85%乙醇2 min；75%乙醇2min，自来水冲洗，ddH2O 洗2×2min；4.抗原修复： 根据抗体说明书推荐方法进行抗原修复，常采用高压、微波（温度达到98~100℃）或酶消化修复法，室温自然冷却，自来水冲洗，ddH2O 洗2×2min，TBS 洗涤（2×2min）（具体修复方法见附1）* 注：有些抗原勿需修复，直接进入第5步封闭。
II 型胶原免疫组化试剂盒型胶原免疫组化试剂盒（（IHC ） Collagen II IHC Assay说明书修订日期说明书修订日期：：2015.07.13Cat number ：KGA357 Store at 2-8℃ for 6 monthsFor Research Use Only （科研专用）一、试剂盒说明本试剂盒可用于免疫组织化学方法以显示人、大、小鼠来源的组织样本Collagen II 抗原分布。
本试剂盒适用于常规福尔马林固定石蜡包埋切片、冰冻切片、培养固定的细胞涂片等。
凯基即用型一步法免疫组化检测试剂盒与常规免疫组化染色试剂盒相比，具有高灵敏性、高特异性及操作简便的优点。
多个HRP 聚合物直接与二抗相连，大大放大了抗原抗体结合的信号，减少了孵育步骤，孵育时间缩短为10分钟。
试剂盒不含有生物素，完全避免了内源性生物素造成的背景影响。
试剂盒提供的DAB 显色试剂为增强型显色试剂，且自带稀释液，避免了由于水质的不同对DAB 显色造成的影响；与一般DAB 试剂相比，增强型的稳定性显著提高，显色更醒目，敏感性更高。
二、试剂盒组份组份Cat ：KGA357 50 tests 备注 Collagen II 兔多抗 50 µl 2-8℃/-20℃ 增强剂3 ml HRP 聚合物 (即用型)3 ml 2-8℃试剂A ：20×DAB 底物缓冲液A 160 µl 试剂B ：20×DAB 底物缓冲液B 160 µl 试剂C ：20×DAB 底物缓冲液C160 µl2-8℃，避光备注备注：：抗体在2-8℃可以保存6个月个月，，长期保存可以分装保存于-20℃。
三、试剂盒以外自备试剂和仪器二甲苯、乙醇、蒸馏水或去离子水、3%H 2O 2-甲醇、10%山羊血清封闭液、10 mM PBS （pH 7.4）、免疫组化笔、苏木素染液、封片胶、显微镜四、使用注意事项1. 检测标本时需同时做阴性对照和阳性对照。
免疫组化实验试剂耗材大全华越洋---------------------------- 0.1%胰蛋白酶消化液waryong 10ml 110多聚甲醛merk 25g 504%多聚甲醛waryong 500ml 22010X多聚赖氨酸waryong 10ml 260抗荧光衰减封片剂waryong 25ml 230防脱载玻片waryong 50片310mayer'苏木素染液（免疫组化）waryong 100ml 410封闭用正常绵羊/山羊/兔/人血清waryong 10ml 75弗氏不完全佐剂sigma 10ml 180弗氏完全佐剂sigma 10ml 200柠檬酸钠缓冲液0.01mol/L PH6.0 waryong 1L 10DAB amresco 1g 13520XDAB显色液 A，B液各1.5ml waryong 3ml 95NBT amresco 100mg 95BCIP amresco 100mg 310BCIP/NBT底物显色试剂盒waryong 25ml 210PBST(PH7.4)抗体稀释液waryong 1ml 25一抗稀释液waryong 100ml 390HRP标记抗体稀释液waryong 100ml 390AP标记抗体稀释液waryong 100ml 390荧光抗体稀释液waryong 50ml 110免疫组化名称规格价格Super Polymer-二步法IHC试剂盒3ml35818ml1598兔Streptavidin-HRP试剂盒3ml19818ml998鼠Streptavidin-HRP试剂盒3ml19818ml998兔∕鼠通用型Streptavidin-HRP试剂盒3ml25818ml1198山羊抗兔IgG,Biotin(IHC工作液)3ml6818ml298山羊抗鼠IgG,Biotin(IHC工作液)3ml6818ml298山羊抗兔∕鼠IgG,Biotin(IHC工作液)3ml9818ml498 Streptavidin-HRP(IHC工作液)3ml9818ml49860ml258 AEC底物显色试剂盒20ml98 BCIP∕NBT碱性磷酸酶显色试剂盒(40x)40ml198 BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂40ml229改良型苏木素(IHC常用复染试剂)10ml68柠檬酸缓冲液(IHC抗原修复液,100x)100ml68EDTA缓冲液(IHC抗原修复液，50x)100ml68封闭用正常山羊血清工作液(免疫组化封闭液)10ml68内源性过氧化物酶封闭液10ml68内源性碱性磷酸酶封闭液10ml68Biotin标记抗体稀释液20ml中性树胶100g98水性封片剂10ml98 Super Polymer-二步法IHC试剂盒（带DAB显色液）3ml39818ml1698兔Streptavidin-HRP试剂盒（带DAB显色液）3ml25818ml1098鼠Streptavidin-HRP试剂盒（带DAB显色液）3ml25818ml1098兔∕鼠通用型Streptavidin-HRP试剂盒（带DAB显色液）3ml29818ml1298。
免疫组化的过氧化氢酶标二抗稀释方法说实话免疫组化的过氧化氢酶标二抗稀释方法这事儿，我一开始也是瞎摸索。
我试过好几种比例去稀释那个二抗，最初根本摸不着头脑。
我就按照试剂盒上大概给的一个范围，先随便选了个中间值，想着应该不会差太多。
结果发现显色效果不太理想，还有挺多背景色的。
这可把我给愁坏了，就像你炒菜盐放错了量，整道菜的味道就不对了。
然后我就开始尝试调整比例。
我把二抗的浓度降低了一些，就像你在咖啡里少加一点糖，想看看会有啥变化。
结果背景色好像是减少了一点，但是阳性信号也变得很弱。
这就像你想让画的颜色淡一点，结果把颜色都快刷没了。
后来听一个经验比较丰富的师兄说，这个稀释比例和很多因素都有关系呢，比如说组织的类型，样本的大小之类的。
他说如果是那种比较小而且不太厚的组织切片，二抗的浓度可以相对低一点。
我当时就像是抓住了一根救命稻草，回去又按照他的建议重新做了一次。
这一次我根据我的组织切片情况，认真地思考调整了二抗的稀释比例。
我在调整比例的时候特小心，就像给一个挑剔的孩子做饭，少一点多一点都不行。
我用微量移液器慢慢地吸取二抗再加入到稀释液里，每一步都检查好几遍，生怕量错了。
而且在稀释的时候我还特别注意混合的均匀性，就像你搅拌面糊要搅得特别匀一样，我轻轻摇晃那个装着二抗和稀释液的试管好多次。
不过我到现在也不能说完全确定一个很精准的比例适合所有情况，只能说要根据自己的实际试验情况不断地去调整。
就像走一条陌生的路，你得一边走一边看路标。
我觉得还有一点就是要做好每次实验的记录，要是这次做错了，下次好歹知道自己错在哪。
反正这个二抗稀释方法呀，就是个慢慢摸索不断积累经验的过程，你得耐着性子多试几次才行。
还有啊，在操作二抗的时候速度也得快一些儿，不能让它在常温下暴露太长时间，就好比是冰淇淋拿出来就得赶紧吃，不然化了就不好了。
再有就是二抗的保存也挺重要，要是保存不当，可能它的活性就受影响了，那稀释出来也不一定能用得好。
我曾经有一次用了一瓶保存很久而且保存条件不太好的二抗，怎么稀释效果都不行。
