实验题目 金黄色葡萄球菌的分离和鉴定之青柳念文创作
一、实验目标
金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的分泌物中都可找到.因而，食品受其污染的机会很多.近些年来，美国疾病节制中心陈述，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌.金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生困难，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒，占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占到45%，我国每一年发生的此类中毒事件也非常多.为节制金黄色葡萄球菌的对人的危害，我们要分离出它们并研究.
二、实验原理
典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8um左右，显微镜下摆列成葡萄串状.金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性.金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长杰出，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37°C，最适生长pH7.4,干燥环境下可存活数周.平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1—2mm.血平板菌落周围形成透明的溶血环.金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10—15%NaCl肉汤中生长.可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气.甲基红反应阳性，V—P反应弱阳性.许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶.金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感.对碱性染料敏感，十万分之一的龙胆紫液即可抑制其生长.
三、实验资料和设备
牛肉膏蛋白胨培养基（13%NaCl）：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠130g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，121℃灭菌20min后倒平板.
肉汤培养基：酵母膏5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml，121℃灭菌20min.
甲苯胺兰-DNA平板
磺胺类药物、革兰氏染液
显微镜、超净工作台、水浴锅、培养皿、锥形瓶、移液器、灭菌锅、培养箱、试管、载玻片、接菌环.
四、实验方法
金黄色葡萄球菌的分离：
实验六 金黄色葡萄球菌检验（第二篇）
1 目的
1.1 了解金黄色葡萄球菌检验原理
1.2 掌握金黄色葡萄球菌鉴定要点和检验方法
2 原理
葡萄球菌在自然界分布极广，空气、土壤、水、饲料、食品(剩饭、糕点、牛奶、肉品等)以及人和动物的体表粘膜等处均有存在，大部分是不致病，也有一些致病的球菌。金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属一个种。可引起皮肤组织炎症，还能产生肠毒素。如果在食品中大量生长繁殖，产生毒素，人误食了含有毒素的食品，就会发生食物中毒，故食品中存在金黄色葡萄球菌对人的健康是一种潜在危险，检查食品中金黄色葡萄球菌及数量具有实际意义。
金黄色葡萄球菌能产生凝固酶，使血浆凝固，多数致病菌株能产生溶血毒素，使血琼脂平板菌落周围出现溶血环，在试管中出现溶血反应。这些是鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标。
3 材料
3.1 样品
奶、肉、蛋、鱼制品和饮料等。
3.2 菌种
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
藤黄八叠球菌（Sarcina lutea）
3.3 培养基与试剂
7.5%氯化钠肉汤、血琼脂平板、Baird-parker氏培养基、无菌盐水、兔血浆、革兰氏染色液。
3.4 其它
显微镜、温箱、离心机、无菌吸管、无菌试管、 无菌平皿、均质器、 载玻片、L型涂布棒、酒精灯、接种环等。
4 流程
5 步骤
5.1 一般培养
称取25g固体样品，加入225mL无菌生理盐水，制成混悬液(液体样品可不稀释)。吸取5mL上述混悬液，接种于7.5%氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤50mL培养基内，同时挑取混悬液或液体样品直接在血平板和Baird-Parker平板划线分离。同时将对照菌种在上述两种平板上作划线分离接种。置36±1℃温箱培养24h。
5.2 分纯培养
将上述血平板和Baird-Parker平板上挑取可疑菌落,先观察对照的菌落特征,再观察被检样品的菌落.,并挑取可疑菌落在血平板上进行分离纯化。若无菌落生长，可用也增菌培养物在上上述平板上划线分离，在36±1℃温箱培养24h后再分离纯化，挑取可疑菌落及对照菌种进行革兰氏染色及血浆凝固酶试验。
金黄色葡萄球菌检测方法
一．材料与方法
1、材料
①培养基：7.5%NaCl肉汤培养基，血琼脂平板培养基（按常规方法制作）
②试剂：7.5%NaCl肉汤培养基，革兰氏染色，血琼脂平板，Baird-Parker琼脂平板，生理盐水，兔血浆（1：4），
③器材：温箱，显微镜，天平，均质器，载玻片，L型涂片棒，三角瓶，刻度吸管，平皿，试管及试管架，研磨，1ml注射器，
④实验动物：健康的小白鼠
2、方法
待检样品25g+225ml灭菌生理盐水
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直接计数法 增菌培养方法
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Baird-Parker琼脂平板 7.5%NaCl肉汤培养基
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血平板 血平板
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↓
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涂片染色镜 溶血观察 动物接种试验 血浆凝固试验
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↓
报告
1、样品的采集
称取25g火腿肠，切碎搅匀（用灭菌研钵研磨），置于250ml锥形瓶中，加入225ml灭菌生理盐水，制成1：10样品混悬液，混匀后作用20分钟，随机取10ml离心。
2、增菌及分离培养
①增菌培养方法：吸取5ml上清液，接种于7.5%NaCl肉汤培养基内，置于（37±1℃）恒温箱中培养24h，划线接种入血平板，（37±1℃）恒温箱中培养24h。
②直接计数方法：吸取上述悬液，进行10倍递增稀释，根据样品污染情况，选择不同浓度的稀释液各1ml，分别加入3个Baird-Parker琼脂平板，每个平板的接种量分别为0.3ml、0.3ml、0.4ml。用灭菌L型涂布棒涂布整个平板，置于（37±1℃）恒温箱中培养24h。之后分别对3个平板上生长的周围有浑浊带的黑色菌落进行计数。转接入血平板，（37±1℃）恒温箱中培养24h。
第 页 共 页 金黄色葡萄球菌定性检验原始记录表
样品名称 样品编号
检验项目 金黄色葡萄球菌定性检验 检验日期
检验地点 BSL-2实验室 温湿度
（℃，RH%）
检验依据 GB 4789.10—2016
判定依据
检验仪器 生化培养箱 均质器 电子天平
生物安全柜 显微镜
检验试剂 Baird-Parker平板、血琼脂平板、磷酸盐缓冲液或无菌生理盐水等。
样品制备 □固体和半固体样品：无菌称取25g样品，置于盛有225mL7.5%氯化钠肉汤的无菌均质袋内，拍击式均质器均质1min～2min。
□液体样品：吸取25mL于样品置于盛有225mL7.5%氯化钠肉汤的无菌锥形瓶（瓶内可置适当数量的无菌玻璃珠），振荡混匀。
检验程序
1 将上述样品匀液于36℃±1℃培养18～24h； 增菌 ℃ h
2 将增菌后的培养物，分别划线接种到血平板和Baird-Parker平板，血平板36℃±1℃培养18～24h，
Baird-Parker平板36℃±1℃培养24～48h； 血平板 ℃ h
Baird-Parker平板 ℃ h
3 初步鉴定，金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上呈圆形，表面光滑、凸起、湿润、菌落直径为2mm～3mm，颜色呈灰黑色至黑色，有光泽，常有浅色（非白色）的边缘，周围绕以不透明圈（沉淀），其外常有一清晰带。在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。 初步鉴定结果
4 确证鉴定，挑取上述可疑菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验，同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤作为对照。记录结果，报告，符合初步鉴定和确证鉴定可判定为金黄色葡萄球菌。 确证鉴定结果
报告
