蔗糖酶的离子交换层析纯化

实验报告

课程名称：生物化学实验（甲） 指导老师：

成绩：__________________

同组学生姓名：

一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填）

三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填）

五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理

七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得

离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶

一、实验目的和要求：

1、学习离子交换层析的基本原理；

2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术；

3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法。

二、实验内容和原理：

1、离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）

离子交换层析是常用的层析方法之一。它是以离子交换剂为固定相，根据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换剂与流动相中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。这些过程都是可逆的。在某一pH值的溶液中，不同的蛋白质所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就有区别。当洗脱液的pH改变或者盐的离子强度逐渐提高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，达到分离的目的。

离子交换剂是由基质、电荷基团（或功能基团）和反离子构成。

基质————电荷基团————反离子

专业：

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学号：

单克隆抗体分离纯化中的离子交换层析介质

离子交换层析介质在生物技术制药中应用广泛。可以设计层析工艺中的各个

步骤中使用，如：捕获，中度纯化、精细纯化等步骤。在抗体纯化工艺中广泛使用

的三步法：protein A捕获-阳离子交换-阴离子交换。

2.1. 阳离子交换CEX层析介质

在抗体纯化工艺中，CEX一般使用吸附模式（Bind-and-Elute BE）。阳离子

交换可以去除HCP、脱落的Protein A以及部分高分子量的聚体等杂质。Protein A

的PI在5.1；而单克隆抗体的PI一般在4-9，大部分在PI超过6.0。更改上样的pH

可以使脱落的Protein A的或Protein A的降解片段在流穿中去除，也可在上样后

的中间清洗步骤中去除。文献报道阳离子交换的载量（Protein A捕获洗脱样品）在几十mg/ml 以上。并且收率较高均>98%. Sp Sepharose FF 是在生物制药中使

用非常广泛的一类阳离子交换介质。琼脂糖为生物兼容性层析介质，这类介质是纯

化工艺中初步分离粗的混合物的首选。此时良好的分辨率与高流速的结合是非常重

要的。这些介质的常规线流速是100至400cm/h。

2.2. 阴离子交换AEX层析介质

阴离子交换在抗体纯化工艺中可以去除DNA、病毒、Protein A脱落、内毒

素、部分聚体以及酸性的HCP。

在抗体工艺中AEX层析一般采用流穿模式（Flow-through FT），既上样过

程中抗体在穿透峰，杂质吸附在层析介质上。对于PI比较高的抗体分子，pH在7-

8.0左右时，抗体流穿。而DNA、内毒素以及病毒等可以吸附在层析介质上。文献

报道，阴离子交换的载量在140mg/ml 以上。根据抗体的性质，选择适当的pH，在低电导下，抗体流穿。典型的结果：收率99%，DNA<10pg，protein A<10ppm.

Q Sepharose FF 是在生物制药中使用非常广泛的一类阳离子交换介质。琼脂糖为

离子交换层析

1、定义

离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。

2、发展

1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。本世纪40年代，出现了具有稳定交换特性的聚苯乙烯离子交换树脂。50年代，离子交换层析进入生物化学领域，应用于氨基酸的分析。目前离子交换层析仍是生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。常用的离子交换剂有：离子交换纤维素、离子交换葡聚糖和离子交换树脂 。

3、基本信息

离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阳离子交换树脂；而带有负电荷的称之阴离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。

4、具体操作

预处理和装柱

对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带H+或OH-的交换剂型。阴离子交换剂常用“碱-酸-碱”处理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，使最终转为-H-型交换剂。

洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度。已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡。为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱，同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。 柱子装好后再用起始缓冲液淋洗，直至达到充分平衡方可使用。

Ｖｏ１．２８　ＮＯ．４　２００２　０８　华东理工大学学报　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅａｓｔ　Ｃｈｉｎａ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　３４１　文章编号：１００６—３０８０（２００２）０４　０３４１—０５　

离子交换层析分离纯化重组人血清白蛋白　

朱家文　，　武　斌　，　陈　葵　，　（１．华东理工大学化学工程研究所，上海２００２３７；２．湖　罗凌丽　，　周　武　，　李水龙　南岳阳中湘康神药业集团有限公司，湖南４１４０００）　摘要：通过层析实验，比较了几种阴离子交换剂在不同温度、ｐＨ值、离子强度、进样流速、进样　浓度下对人血清白蛋白的吸附与脱附性能，研究了它们对人血清白蛋白和卵清蛋白的分离能力，并　考察了柱层析过程中吸附栽体对重组人血清白蛋白和杂蛋白的分离选择性。实验结果表明：牌号为　ＤＥＡＥ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ的栽体不仅对重组人血清白蛋白具有良好的分离度，而且有较高的回收率。　关键词：人血清白蛋白；吸附；离子交换层析；阴离子交换剂；穿透曲线；分离度　中图分类号：Ｑ５０３；Ｑ５５　文献标识码：Ａ　

Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌ　ｂｕｍｉｎ　ｂｙ　Ｉｏｎ　Ｅｘｃｈａｎｇｅ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　

ＺＨＵ　Ｊｉａ—ｗｅｎ　，　Ｂｉｎ　，ＣＨＥＮ　Ｋｕｉ　，ＬＵＯ　Ｌｉｎｇ　ｌｉ　，ＺＨＯＵ　Ｗｕ　，ＬＩ　Ｓｈｕｉ—ｌｏｎｇ　（１．Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ　ＥＣＵＳＴ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２００２　３　７，Ｃｈｉｎａ；　２．Ｙｕｅｙａｎｇ　Ｚｈｏｎｇｘｉａｎｇ　Ｋａｎｇｓｈｅｎ　Ｐｈａｒｒｒｔａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｇｒｏｕｐ　Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｈｕｎａｎ　４１４０００，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｌｕｔｉｏｎ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　Ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ（ＨＳＡ）ａｎｄ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＨＳＡ　ｕｎｄｅｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｏｐｅｒａｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｓｕｃｈ　ａｓ　ｐＨ，ｉｏｎｉｃ　ｓｔｒｅｎｇｔｈ　ｏｆ　ｂｕｆｆｅｒ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ｆｌｏｗ　ｒａｔｅ　ａｎｄ　ｃｏｎ—　ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｅｅｄ　ｗｅｒｅ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ　ｉｎ　ｆｉｘｅｄ　ｂｅｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｗｉｔｈ　ｔｈｒｅｅ　ｋｉｎｄｓ　ｏｆ　ａｎｉｏｎ　ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｇｅｌ　ｂｅａｄｓ　ａｓ　ｓｕｐｐｏｒｔｓ．Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＨＳＡ　ａｎｄ　ｏｖａｌｂｕｍｉｎ　ｉｎ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｗａｓ　ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈｕｍａｎ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ　ａｎｄ　ｈｙｂｒｉｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｂｙ　ａｎｉｏｎ　ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｗｅｒｅ　ｄｉｓ—　ｃｕｓｓｅｄ．Ｉｔ　ｗａｓ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ　ｓｈｏｗｎ　ｔｈａｔ　ｈｉｇｈ　ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＨＳＡ　ｗｅｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｉｎ　ｆｉｘｅｄ　ｂｅｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｗｉｔｈ　ＤＥＡＥ—Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ　ａｓ　ｓｕｐｐｏｒｔ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｈｕｍａｎ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ；ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ；ｉｏｎ　ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ａｎｉｏｎ　ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｇｅｌ　ｂｅａｄｓ；ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ　ｃｕｒｖｅ；ｒａｔｅ　ｏｆ　ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ