蔗糖酶的分离提纯
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蔗糖酶的分离提纯
【实验目的】
1．了解蔗糖酶分离提纯的方法。
2．掌握离心技术、电泳技术、层析技术、膜分离技术和分光光度法。
【实验原理】
蔗糖酶[Ec 3．2．1．26]习惯命名β--D--Fructofuranosidase系统命名：β--D—Fructofuranosideffructonydrolase。
蔗糖酶是一种水解酶，能使蔗糖水解为果糖和葡萄糖。它所催化的反应是：
H OH OH H
蔗糖
+
H OH OH H
葡萄糖 果糖
蔗糖酶的分布相当广，在微生物、植物及动物中都有它的存在。在微生物中，酵母中的含量很丰富。在研究中用的最多的是面包酵母和啤酒酵母。
我们实验室的研究表明采用菌体自溶法破碎酵母细胞，采用乙醇分级和DEAE--纤维素柱层析两步分离提纯步骤，就可制备纯度较高的蔗糖酶制剂，而且收率也较好。从酵母中制备蔗糖酶，材料来源十分方便，而且以自己提纯的酶制剂进行蔗糖酶的性质、动力学研究也十分方便。
【实验材料、仪器和试剂】
1．实验材料和试剂
(1)0．2％葡萄糖标准液；(2)3，5-二硝基水杨酸试剂；(3)新鲜啤酒酵母；
(4)甲苯；(5)乙酸钠；(6)稀乙酸溶液；(7)95％乙醇；(8)DEAE--纤维素；(9)0.5mol／L NaOH；(10)0.5mol／L HCl；(11)0.005mol／L，pH6.0的磷酸钠缓冲液；(12)含O.15mol／L NaCl的O.005mol／L，pH6.0的磷酸钠缓冲CH2OH H OH H H OH CH20H
O 蔗糖酶 液；
(13)5％蔗糖；(14)测定蛋白质浓度试剂；(15)聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂
2．仪器
(1)恒温水浴；(2)烧杯、量筒、移液管、容量瓶、玻棒；(3)冰盐浴；
(4)离心机；(5)721型分光光度计；(6)柱层析装置；(7)天平；(8)pH计；
(9)滴管、试管和血糖管；(10)秒表
【实验操作】
一、葡萄糖浓度标准曲线的制作
1．取10支血糖管，按下表加入0．2％葡萄糖溶液、水及3，5一二硝基水杨酸试剂：
N0 含糖量
(mg) O．2％葡萄糖
标准液(mL) 水
(mL) 3,5--二硝基水杨
酸试剂(mL) OD540
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
2.4
2.8
3.2
3.6 0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8 2
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2 3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
上述试剂混匀后，在沸水浴中加热5min，取出立即冷却，以蒸馏水稀释至25mL，摇匀，于540nm测光密度。
2．以葡萄糖含量(mg)为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制标准曲线。
二、蔗糖酶的分离提纯
1．蔗糖酶粗品的制备
(1)自溶
称取10克干酵母，放在200mL的烧杯中，加30mL蒸馏水搅成糊状，再加入1.5克乙酸钠。然后在35℃水浴中搅拌30min，此时会观察到菌体自溶的现象。
(2)提取及粗酶的制备
往上述自溶液中加60mL蒸馏水，将烧杯用表面皿或玻璃纸盖好，于35℃保温过夜。第二天，将自溶液于4500r／min离心20min。取出离心管，小心将上清液倒入烧杯中，弃沉淀。得到的上清液就是无细胞抽提液，即粗酶液（E1）。
量出粗酶液体积，记录。取2mL作为待测活力和蛋白浓度的样品（4℃保存）。 2．乙醇分级
将粗酶液用稀醋酸调pH至4.5。
(1)32％乙醇饱和度
按下面的公式算出使粗酶液的乙醇浓度达32％时所需乙醇体积。
X1/（V+X1）=O.32
式中X1为所需乙醇体积，V为粗酶液的体积。然后再按X1／0.95换算出使乙醇浓度(按体积)达32％时所需95％乙醇的体积。
把粗酶液和量好体积的95％乙醇在冰盐浴中预冷(0～2℃)。小心缓慢滴加乙醇，同时不断搅拌，一定注意不要使乙醇局部过浓，否则会引起酶变性失活。
在滴加乙醇过程中，酶液渐渐变混浊，滴加结束后，于3000r／min离心5min。上清转移到另一烧杯中待用，弃去沉淀。
(2)47.5％的乙醇饱和度
按下式算出使酶液乙醇浓度达47．5％时所需乙醇的量
X2/(V+X2)=0.475
式中X2为所需乙醇体积，V为粗酶体积。再按X2／0.95算出需95％乙醇的体积。按下式可算出使乙醇浓度达47．5％时所需补加的95％乙醇体积。
X2/0.95-X1/0.95=使乙醇浓度达47．5％时需补加的95％乙醇体积
按前述方法，继续补加乙醇，使乙醇浓度达47.5％于3000r／min离心3min，弃去上清会得少量沉淀。将沉淀用10mL pH6.0的0.005mol／L磷酸钠缓冲液溶解，并对该液透析过夜或酌情缩短时间，中间换一次透析液。离心，则得到进一步纯化的酶。
量出酶液体积，取出2mL，待测活力和蛋白浓度。其他酶液准备上柱。
3．DEAE一纤维素柱层析
(1)DEAE一纤维素处理
在使用前，将市售的DEAE一纤维素按下述方法处理：用去离子水浸泡过夜，用浮选法除去过细部分，留下30min沉积部分，重复几次。然后用0.5mol／L NaOH，水，0.5mol／L HCl，水，0.5mol／L NaOH，水，交替浸泡。其中NaOH浸泡2～4小时，HCl浸泡半小时，每次抽滤后用水洗至中性。最后用0.005mol／L，pH6．0的磷酸钠起始缓冲液平衡。
再生方法：用过的DEAE一纤维素可再生重复使用。但要先用0.5mol／L
NaOH+0.5mol／LNaCl浸泡后再按常规处理。
DEAE一纤维素离子型。
水：R--N(CH3)2+H20==eR—N+(CH3)2H·OH-
HCI：R—N+(CH3)2HOH-+HCl=R—N+(CH3)2HCl-+H20
NaOH：R—N+(CH3)2H·Cl-+NaOH=R—N+(CH3)2H·OH-+Na+ (2)装柱
本实验使用的层析柱规格为1．8cm(内径)×15cm(高)。
把柱子垂直固定好，可用一千锤校正，按柱层析原理部分所述方法，把DEAE一纤维素装柱。床高距柱顶2～3cm为宜。用起始缓冲液洗柱，平衡过夜。注意控制流速，防止柱流干。
(3)上样
乙醇分级的酶液，经对起始缓冲液透析，离心后，按层析原理部分所述方法上样。（注意：流速要尽量慢，使目的酶和DE52充分吸附）
样品上完后，用起始缓冲液(130mL)洗柱。流出液流出速度为4mL／5min左右。
(4)洗脱
用含0.15mol／L NaCl的0.005mol／L pH6.0的磷酸钠缓冲液洗脱。洗脱速度4mL／5min。收集20管即可结束。(3～4mL／管)。
每隔一管测定活力，确定酶活力峰位置，合并，量出体积。测合并后制剂的活力和蛋白浓度。
三、蔗糖酶的活力及蛋白浓度测定
1．蔗糖酶活力规定
在本实验的条件下，每3min释放lmg还原糖所需的酶量定义为一个活力单位。
2．操作
(1)样品的稀释
取0.2mL无细胞抽提液(E1)用pH4.6，0.2mol／L NaAc缓冲液稀释40倍；取0.2mL乙醇分级酶液(E2)用上述缓冲液稀释80倍；DEAE--纤维素柱层析酶液(E3)根据情况稀释。
(2)反应
取两支试管分别加入2mL稀释的酶液。一支做对照，加0.5mL 1moL／L
NaOH，摇匀，使酶失活；另一支做测定管。然后把两支试管和5％的蔗糖溶液放在35~C水浴中预热恒温。
分别取2mL 5％的蔗糖加入上述两试管中，并正确计算时间，3min于测定管中加入0.5mL1mol／L NaOH，摇匀，终止反应。
从反应混合物中取出0.5mL溶液放入血糖管中，加入3mL 3，5一二硝基水杨酸试剂和1.5mL水，摇匀。于沸水浴中煮沸5min后立即用冷水冷却，加蒸馏水稀释到25mL刻度，摇匀，于540nm测光密度。
在葡萄糖标准曲线上找到所测光密度对应的葡萄糖含量，然后按下面活力计算公式计算酶活力。
3．酶活力计算公式 蔗糖酶活力单位：葡萄糖毫克数×9×酶的稀释倍数
式中9=4.5/0.5，因酶反应液的总体积是4.5mL，而用3，5一二硝基水杨酸试剂显色时仅取0.5mL。
4．蛋白浓度测定
E1稀释20倍；E2稀释4倍；E3不稀释。
Bradford法测蛋白浓度(见附注1)
四、酶纯度鉴定
聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定E1、E2和E3的纯度。具体操作(见附注2)。
【结果的处理】
样品 样品总体积
ml 总活力 蛋白浓度
mg/ml 总蛋白量
mg 比活
u/mg 提纯倍数
无细胞抽提液(E1)
乙醇分级
E2)
DEAE一纤维素柱层析
(E3)
