疏水层析原理

疏水层析洗脱条件

疏水层析洗脱条件是指在疏水层析过程中，用适当的条件将目标化合物从固相疏水材料中洗脱出来。具体条件包括以下几个方面：

1. 洗脱缓冲液pH值：洗脱缓冲液的pH值通常在目标化合物的等电点附近进行，以保证其在其电荷状态中最容易从固相疏水材料中解离出来。

2. 洗脱缓冲液的浓度：洗脱缓冲液的浓度可以通过试错法进行优化，以获得最佳的洗脱效果。

3. 洗脱缓冲液的流速：通常情况下，洗脱缓冲液的流速可以在1-3 mL/min之间，以保证洗脱过程的充分与均一。

4. 洗脱缓冲液中添加的有机溶剂：对于一些亲水度较高的化合物，可以在洗脱缓冲液中适量添加一些有机溶剂，如甲醇、乙醇等，以提高洗脱效率。

5. 洗脱缓冲液的温度：温度对疏水层析的洗脱效果也有影响，较高的温度可以促进目标化合物的解离和扩散，但同时也可能造成不必要的带电物质的失活和杂质的增加。因此，温度的选择需要综合考虑。

总的来说，不同的目标化合物和固相疏水材料可能需要不同的洗脱条件，需要经过实验优化才能获得最佳结果。

疏水作用层析

实验概要

通过实验了解疏水作用层析的原理与方法。

实验原理

疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团，我们把这些疏水性基团称为疏水补丁，疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。不同的分子由于疏水性不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同，疏水作用层析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的。疏水作用层析的基本原理如图所示。

溶液中高离子强度可以增强蛋白质和多肽等生物大分子与疏水性层析介质之间的疏水作用。利用这个性质，在高离子强度下将待分离的样品吸附在疏水性层析介质上，然后线性或阶段降低离子强度选择性的将样品解吸。疏水性弱的物质，在较高离子强度的溶液时被洗脱下来，当离子强度降低时，疏水性强的物质才随后被洗脱下来。

Phenyl-SepharoseTM 6 Fast Flow 是疏水性层析介质的一种，这种层析介质是以交联琼脂糖为支持物，交联琼脂糖支持物与苯基共价结合。苯基作为疏水性配体，可以与疏水性物质发生疏水作用。Phenyl-SepharoseTM 6 Fast Flow结构示意图如下。

主要试剂

1. 疏水层析介质：Phenyl-SepharoseTM 6 Fast Flow

2. 溶液A：0.1M Na2HPO4, pH7.0

3. 溶液B：0.1M Na2HPO4,pH7.0，1.7M (NH4)2SO4 4. 蛋白质样品溶于溶液B

主要设备

层析柱（1.6X20cm）；恒流泵；梯度混合器；试管及试管架；紫外分光光度计

实验步骤

1. 层析介质准备：Phenyl-SepharoseTM 6 Fast Flow疏水层析介质保存在20%乙醇中，取出层析介质后，倾出乙醇溶液。加入溶液A，溶液的体积约占总体积的1/4。

疏水层析原理

疏水层析是一种常用的色谱分析技术，其原理基于样品分离时固定相与移动相之间的亲疏水性差异。疏水层析中，固定相通常是一种非极性材料，如疏水性树脂或疏水性硅胶。移动相则是一种有机溶剂，如甲醇或乙腈，其疏水性介于固定相和要分离的样品之间。

在疏水层析柱中，样品溶液由于亲疏水性差异而与固定相发生不同程度的相互作用。亲疏水性强的物质会与固定相发生较强的相互作用，停留时间相对较长，而亲疏水性弱的物质则会较快地通过固定相，停留时间较短。

疏水层析的分离原理可解释为两种相互竞争的作用力。一方面，固定相表面具有较大的亲疏水性，使得亲疏水性强的物质更容易与其发生相互作用，并在固定相上停留。另一方面，移动相中的有机溶剂对固定相表面也有一定的亲疏水性，这种亲疏水性决定了溶剂与固定相之间的相互作用力。当亲疏水性强的物质进入移动相后，相互作用力较弱，从而更容易通过固定相。

在实际应用中，疏水层析常用于分离极性较强的化合物，如多肽、核苷酸、脂肪酸等。通过调整移动相和固定相的亲疏水性，可以实现对不同化合物的选择性分离。

总而言之，疏水层析利用样品与固定相之间亲疏水性差异实现分离。疏水性强的物质在固定相上停留时间较长，而疏水性弱的物质则更容易通过固定相。通过调整移动相和固定相的亲疏水性，可以实现对不同化合物的选择性分离。

2008-6 Volume 8

疏 水 层 析 填

料

疏水层析，是根据不同的蛋白与疏水表面产生的相互作用的差异，进行蛋白分离的一种方法。一般而言，离子强度（盐浓度）越高，物质所形成的疏水键越强。影响疏水作用的因素包括：盐浓度，温度，pH，表面活化剂和有机溶剂。疏水层析的应用与离子交换层析的应用刚好互补，因此，可以用于分离离子交换层析很难或不能分离的物质。

Chisso公司生产的疏水层析填料，有三种类型：CellfineTM Butyl, Phenyl 和Octyl，分别为在多孔的交联纤维素颗粒上通过一个短接头，共价键和丁基，苯基或者辛基的层析填料。结构见下图：

填料的疏水性按丁基、苯基、辛基，疏水性程度依次增大。通常，CellfineTM Octyl对疏水性蛋白的吸附性会强于CellfineTM Butyl对疏水性蛋白的吸附。然而，蛋白被吸附的越厉害，也就越难洗脱。CellfineTM Phenyl，具芳香族物质的特性，因此，在某些情况下，可以更好地吸附丁基和辛基等脂肪族所不能吸附的物质。在使用疏水层析分离物质时，没有通法，只能根据待分离物质的特性，筛选合适的填料，摸索优化其分离纯化的条件。

三种疏水层析填料的疏水性差异（左图）

色谱柱： x 150 mm

柱体积：8 ml

流动相： – 0.0M Ammonium

Sulfate

in 0.01M

phosphate, pH

流 速： ml/min

样 品：5 mg/3 ml–

100 μl

2008-6 Volume 8

Asahipak NH2P 色谱柱（氨基柱）

Asahipak NH2P色谱柱是Shodex公司生产的用于分析糖类物质的正相柱。Asahipak NH2P色谱柱，是以聚合物为基材的氨基柱，化学稳定性良好，在pH2-13的条件下均可使用。与硅胶基材的氨基柱相比，聚合物基材的氨基柱Asahipak NH2P，可以很好地实现硅胶基材氨基柱的各种应用；对流动相的耐受性更好，使用寿命更长久；另外，Asahipak NH2P可用于定量分析；还可以用碱性溶剂冲洗。