疏水吸附层析

生物分离与纯化技术模拟试卷十一答案

考试学科 生物分离与纯化技术 组、命题教师 课题组 考场 考号

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一、名词解释（每小题3分，共15分）

1．盐析：是利用不同物质在高浓度的盐溶液中溶解度的差异，向溶液中加入一定量的中性盐，使原溶解的物质沉淀析出的分离技术。

2．洗脱：利用适当的溶剂，将树脂吸附的物质释放出来，重新转入溶液的过程。

3．树脂的再生：就是让使用过的树脂重新获得使用性能的处理过程，树脂的再生反应是交换吸附的逆反应。

4．疏水层析：是利用表面偶联弱疏水性基团（疏水性配基）的疏水性吸附剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行分离纯化的层析技术。

5．过滤介质：是指能使固一液混合料液得以分离的某一介面，通常指滤布或膜过滤中所用的膜。

二、单选题（每小题1分，共15分）

1．微滤膜所截留的颗粒直径为( A )

A ～10μm B ～μm C <2nm D < 1nm

2．关于分配柱层析的基本操作错误(D )。

A装柱分干法和湿法两种

B分配柱层析法使用两种溶剂，事先必须先使这两个相互相饱和

C用硅藻土为载体，需分批小量地倒入柱中，用一端是平盘的棒把硅藻压紧压平

D分配柱层析适用于分离极性比较小、在有机溶剂中溶解度大的成分，或极性很相似的成分。

3．在酸性条件下用下列哪种树脂吸附氨基酸有较大的交换容量 （ C）

A．羟型阴 B．氯型阴 C．氢型阳 D．钠型阳

4．下列哪项不是常用的树脂再生剂（ D ）

A 1％～10％HCl B H2S04、 C NaCl、 D 蒸馏水

疏水作用层析

实验概要

通过实验了解疏水作用层析的原理与方法。

实验原理

疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团，我们把这些疏水性基团称为疏水补丁，疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。不同的分子由于疏水性不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同，疏水作用层析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的。疏水作用层析的基本原理如图所示。

溶液中高离子强度可以增强蛋白质和多肽等生物大分子与疏水性层析介质之间的疏水作用。利用这个性质，在高离子强度下将待分离的样品吸附在疏水性层析介质上，然后线性或阶段降低离子强度选择性的将样品解吸。疏水性弱的物质，在较高离子强度的溶液时被洗脱下来，当离子强度降低时，疏水性强的物质才随后被洗脱下来。

Phenyl-SepharoseTM 6 Fast Flow 是疏水性层析介质的一种，这种层析介质是以交联琼脂糖为支持物，交联琼脂糖支持物与苯基共价结合。苯基作为疏水性配体，可以与疏水性物质发生疏水作用。Phenyl-SepharoseTM 6 Fast Flow结构示意图如下。

主要试剂

1. 疏水层析介质：Phenyl-SepharoseTM 6 Fast Flow

2. 溶液A：0.1M Na2HPO4, pH7.0

3. 溶液B：0.1M Na2HPO4,pH7.0，1.7M (NH4)2SO4 4. 蛋白质样品溶于溶液B

主要设备

层析柱（1.6X20cm）；恒流泵；梯度混合器；试管及试管架；紫外分光光度计

实验步骤

1. 层析介质准备：Phenyl-SepharoseTM 6 Fast Flow疏水层析介质保存在20%乙醇中，取出层析介质后，倾出乙醇溶液。加入溶液A，溶液的体积约占总体积的1/4。

2008-6 Volume 8

疏 水 层 析 填

料

疏水层析，是根据不同的蛋白与疏水表面产生的相互作用的差异，进行蛋白分离的一种方法。一般而言，离子强度（盐浓度）越高，物质所形成的疏水键越强。影响疏水作用的因素包括：盐浓度，温度，pH，表面活化剂和有机溶剂。疏水层析的应用与离子交换层析的应用刚好互补，因此，可以用于分离离子交换层析很难或不能分离的物质。

Chisso公司生产的疏水层析填料，有三种类型：CellfineTM Butyl, Phenyl 和Octyl，分别为在多孔的交联纤维素颗粒上通过一个短接头，共价键和丁基，苯基或者辛基的层析填料。结构见下图：

填料的疏水性按丁基、苯基、辛基，疏水性程度依次增大。通常，CellfineTM Octyl对疏水性蛋白的吸附性会强于CellfineTM Butyl对疏水性蛋白的吸附。然而，蛋白被吸附的越厉害，也就越难洗脱。CellfineTM Phenyl，具芳香族物质的特性，因此，在某些情况下，可以更好地吸附丁基和辛基等脂肪族所不能吸附的物质。在使用疏水层析分离物质时，没有通法，只能根据待分离物质的特性，筛选合适的填料，摸索优化其分离纯化的条件。

三种疏水层析填料的疏水性差异（左图）

色谱柱： x 150 mm

柱体积：8 ml

流动相： – 0.0M Ammonium

Sulfate

in 0.01M

phosphate, pH

流 速： ml/min

样 品：5 mg/3 ml–

100 μl

2008-6 Volume 8

Asahipak NH2P 色谱柱（氨基柱）

Asahipak NH2P色谱柱是Shodex公司生产的用于分析糖类物质的正相柱。Asahipak NH2P色谱柱，是以聚合物为基材的氨基柱，化学稳定性良好，在pH2-13的条件下均可使用。与硅胶基材的氨基柱相比，聚合物基材的氨基柱Asahipak NH2P，可以很好地实现硅胶基材氨基柱的各种应用；对流动相的耐受性更好，使用寿命更长久；另外，Asahipak NH2P可用于定量分析；还可以用碱性溶剂冲洗。

几种生物大分子分离柱的介绍

在过去的三十年中，分离生物大分子的各种技术和方法得到了不断的发展。随着各种介质的完善和商品化，使以填料为核心的柱层析技术在天然产物等粗提后的纯化中起到了重要作用。

1 疏水作用柱层析(Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC)

HIC是以蛋白质的疏水性为分离基础的。具体说就是一种通过表面疏水性差异来分离蛋白质的柱层析方法。

疏水键的形成对于非极性基双方无特异性要求，不同蛋白质表面及内部疏水区的多少、大小、强弱、分布及空间位阻效应各不相同，这也是HIC分离蛋白质的根本所在。在20种氨基酸中有8种是疏水性氨基酸，其强弱顺序为Trp、Ile、Phe、Pro、ValLeu、Met、Ala。当介质和上样蛋白浓度不变时，影响HIC的因素较多，主要有①盐类，其作用是使暴露出界面的非极性基，使容易形成疏水作用，其次是增加水相极性，提高界面的表面张力，盐浓度越高，促疏水作用越强。一般常采用的促疏盐为(NH4)2SO4。②混溶有机溶剂，作用是使界面张力减弱，减少疏水作用。③温度，当体系温度由4℃升高到25℃时，疏水作用力增加20%～30%，这主要是由于动能增大，提高表面张力，一般当温度降低，可增大盐浓度，使疏水作用不降低。④pH，当pH≈pI时可消除表面电荷的相斥作用，同时表面活性剂与变性剂也对其有影响。

HIC适用范围广，原则上可用于所有蛋白质纯化，处理量大，特别是从大体积样品中提取低含量的目标蛋白显优势，可取代传统的盐析沉淀技术。HIC对DNA及小牛血清(其中的白蛋白、免疫球蛋白、氨基酸等成分)去除率较高，尤其是对细胞DNA一步去除率可达90%以上。原则上HIC可放在纯化工艺的任何位置，但大部分放在前面。由于它也属吸附型柱层析，尤其是对蛋白质空间内部的疏水作用可使此步损失较大，对蛋白质的结构也有微细作用。

2凝胶过滤柱层析(Gel Filtration Chromatography，GFC)