结核分枝杆菌的分子生物学鉴定

结核分枝杆菌的鉴定要点

结核分枝杆菌是一种引起结核病的病原体，它有着很高的致病性和感染性。为了正确认识和鉴定结核分枝杆菌，以下是一些重要的鉴定要点：

1. 镜检-结核分枝杆菌可以通过显微镜下观察到。使用酸性染色法，如抗酸染色和荧光染色可以使细菌显现出红色（抗酸染色）或绿色（荧光染色）。

2. 培养-分枝杆菌在固体或液体培养基上生长缓慢，通常需要2-6周的时间才能形成可见的菌落。固体培养基上的菌落呈干燥而扁平的形态，有橘黄色的色素。液体培养基上的培养物通常呈黄绿色或橙黄色。培养时应该注意对临床样本进行适当的稀释以避免过多的其他细菌的干扰。

3. 生化鉴定-利用一系列特殊的生化试剂，可以鉴定结核分枝杆菌的生化反应。这些试剂包括硝基硝酸盐、尼龙红、呋喃四羧酸等。结核分枝杆菌在这些试剂的作用下具有独特的反应形式，可以通过观察颜色变化或者气体产生等判断。

4. 分子生物学鉴定-利用PCR（聚合酶链式反应）及其变体技术，可以对结核分枝杆菌的特定基因进行检测和鉴定。这些特定基因包括IS6110序列和16S rRNA基因等。分子生物学鉴定方法通过特定的引物和核酸杂交可以迅速、准确地确认分枝杆菌的存在。

5. 药敏试验-由于结核分枝杆菌对抗结核药物的敏感性存在变异，药敏试验可以帮助确定分枝杆菌的抗药性。该试验通过将分枝杆菌分离株培养在含有不同抗结核药物浓度的培养基上，观察菌落的生长情况，从而确定其对抗结核药物的敏感性。

总之，结核分枝杆菌的鉴定是一项复杂而关键的工作。通过镜检、培养、生化鉴定、分子生物学鉴定和药敏试验等多种方法的综合应用，可以准确、快速地确定结核分枝杆菌的存在及其特性，为结核病的诊断和治疗提供有力的依据。

(1)小量提取细菌基因组总DNA

a.挑LB平板上新鲜活化的单菌落于5mL LB培养基中，25℃震荡培养24 h；

b.转移3mL菌液于5mL离心管中，4℃，12000r/min，离心5min，弃掉上清；

c.将细菌沉淀物用0.5mol/L NaCl洗一次，尽量空干上清液；

d.将沉淀重悬于1mL 50mmol/L Tris (pH 8.0)缓冲液中，然后加入0.2mL新鲜配置的溶菌酶溶液(10mg/mL in 0.25mol/L Tris，pH8.0)和0.8mL 0.25mol/L的EDTA溶液，混匀后于37℃处理1 h，再加入200μL 10%SDS溶液，混匀后放置于55℃处理5min；

e.加入等体积的酚-氯仿(1:1)，盖好上下颠倒混匀3min，12000r/min，离心10min；

f.转移上相至新的离心管中，重复上个步骤直到无白色变性蛋白层出现；

g.取上清，加入3μL 10mg/mL的去DNase的RNase溶液，37℃水浴1h；

h.重复步骤e；

i.在上相中加入1/10体积的3mol/L NaAc(pH 5.2)和2倍体积的冷无水乙醇，-20℃放置30min；.

j.4℃，12000r/min离心10min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗两次，干燥后溶于100μL的TE中，-20℃保存备用。

(2) PCR扩增16S rDNA序列

a. 以上述细菌基因组总DNA为模板，.扩增所用引物为，

上游引物：5’-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3’； （27F）

下游引物：5’-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3’。（1492R）

b. PCR反应体系参见PCR扩增试剂盒说明书

c. PCR反应条件也主要参考说明书

94℃预变性5min，94℃ 45s，56.2℃ 45s，72℃ 90s，30个循环；

72℃ 10min，4℃保温。

d. PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测

基因芯片检测临床标本结核分枝杆菌

目的：评价基因芯片檢测技术在结核病诊断中的效果。方法：收集我院2012年4月至2013年6月符合标准的432例进行基因芯片耐药基因技术检测，同时进行传统比例法药物敏感试验，后者作为金标准，对两组检测结果进行比较评价。结果：基因芯片技术检测结核菌异烟肼耐药性的灵敏度和特异度分别为78.13%和89.88%，与金标准差异有统计学意义（P＜0.01）；基因芯片技术检测结核菌利福平耐药性的灵敏度和特异度分别为86.57%和91.95%，与金标准差异有统计学意义（P＜0.01）；基因芯片技术检测结核菌同时耐异烟肼和利福平（耐多药）的灵敏度和特异度分别为70.11%和90.14%，与金标准差异有统计学意义（P＜0.01）。结论：基因芯片检测技术是一种快捷、简便、灵敏度高的方法，对于结核菌耐药性的检测具有很好的效果，但直接用于临床标本检测结核菌的耐药性不够理想。

标签：基因芯片；结核分枝杆菌；耐药性

结核病是一种严重危害人类健康的慢性传染病，曾一度得到控制，但20世纪80年代以来，全球呈现“复燃”的趋势，随着人类免疫缺陷病毒的出现，耐多药菌株的产生，耐药结核病控制工作面临着严峻的挑战。为了进一步推进耐药结核病防治工作，医务工作者开展了大量基因芯片检测技术的研究，试图以基因芯片快速检测技术替代耗时的传统检测方法。本研究以传统的比例法药物敏感试验为金标准，评估基因芯片技术检测临床各种标本中结核分枝杆菌对异烟肼、利福平耐药性的灵敏度和特异度，了解基因芯片技术在临床的应用价值，从而为耐多药结核病患者提供有效的抗结核治疗方案。

1资料与方法

1.1一般资料

选取我院2012年4月至2013年6月住院和门诊患者，收集患者留取的各种标本共计1350份，每份标本直接行基因芯片技术检测和罗氏培养，剔除了非结核分枝杆菌（NTM），对基因芯片技术检测阳性同时罗氏培养阳性的标本共计432份纳入进一步研究。432份阳性标本直接行基因芯片技术耐药基因检测和比例法药物敏感试验，了解结核分枝杆菌对异烟肼和利福平的耐药情况。432例标本中，男304例，女128例；年龄12～82岁；收集标本中痰液324份，纤刷物78份，脓性分泌物16份，多浆膜腔积液10份，脑脊液2份，尿沉渣2份。

结核杆菌的分离鉴定程序

结核杆菌是引起结核病的病原体，它具有一定的耐受性和生存能力，在环境中也能存活一段时间。尤其是在人类或动物呼吸系统中，更容易繁殖和生长。因此，对于病例的确诊和隔离，准确地进行结核杆菌的分离鉴定是非常关键的。

结核杆菌的分离鉴定主要是通过在培养基上进行生长，然后再进行染色和细菌形态观察等方式，来对结核杆菌进行识别。下面是结核杆菌的分离鉴定程序：

1.患者样本采集：在最初的诊断过程中，医护人员会采集患者咳痰、血液、脑脊液等样本。在采样前，需要对采样器具进行消毒，避免其他细菌的污染。而且，为了确保样本的准确性，需要注意采集样本的时间和方法。

2.样本处理：对采集的样本进行初步处理，如制备，洗涤等。主要是把可能与结核杆菌结合的物质分离出来，使得结核杆菌更容易被发现。 3.分离培养：将分离处理后的样本放入含有结核杆菌培养基的培养皿中，进行培养和生长。培养的时间与培养基的类型有关，一般需要进行数天至数周的培养，以保证结核杆菌得到完全的生长。

4.染色：将已经生长的结核杆菌进行染色。这个步骤可以让结核杆菌的细胞壁被标记出来，使得结核杆菌更容易被检测出来。染色的方法包括酸杂染色和抗酸染色，常用的方法是抗酸染色的方法。

5.细菌形态观察：观察染色后的细菌形态，一般可通过显微镜进行观察。在此步骤中，还需要对细菌的数量和形态进行观察，以判断细菌的种类。

6.生化反应检测：针对染色后形态不同而无法判断的菌株，可以进行生物化学反应检测。这个方法可以通过菌株对某些物质的反应，来判断该菌是否为结核杆菌。

总的来说，对于结核杆菌的诊断和治疗，分离鉴定是非常关键的一个步骤。通过以上步骤的操作，不仅可以诊断出患者是否患有结核病，还可以帮助医护人员判断结核杆菌对药物的敏感性，并选择最合适的药物来进行治疗。因此，结核杆菌的分离鉴定工作显得异常重要。