新测序常见问题分析

基因组测序数据分析中常见问题及解决策略基因组测序是一项重要的技术，已经广泛应用于生物医学研究、疾病诊断和个体化治疗等领域。

然而，基因组测序数据分析过程中常会遇到一些问题，正确解决这些问题对于准确地分析基因组数据至关重要。

本文将探讨基因组测序数据分析中常见的问题，并提出解决策略。

一、质量控制问题质量控制是基因组测序数据分析的第一步，主要目的是检查测序数据的质量，并去除质量较差的数据。

常见的质量控制问题包括低质量碱基、接头污染和重复序列等。

针对这些问题，可以采取以下策略。

首先，使用质量评估工具（如FastQC）检查测序数据的质量分布。

对于低质量碱基，可以通过Trimming或过滤掉具有低质量碱基的序列来解决。

接头污染可以通过使用Trimming工具删除接头序列来解决。

对于重复序列，可以利用特定软件（如Prinseq）去除这些序列，以保证数据的准确性和可靠性。

二、序列比对问题在基因组测序数据分析中，序列比对是其中一个关键步骤，目的是将测序数据与参考基因组进行比对，并得到每个位置的reads覆盖度。

常见的问题包括参考基因组选择和序列比对比对率等。

针对这些问题，可以考虑以下解决策略。

首先，对于参考基因组的选择，应根据具体研究目的和样本特点选择最适合的参考基因组。

对于高变异的样本，可以选择一致性较高的参考基因组进行比对。

其次，比对率低的问题可以通过选择合适的比对工具来解决。

目前常用的比对工具包括Bowtie、BWA等，根据具体情况选择适合的工具进行比对。

三、变异检测问题基因组测序数据分析的主要目的之一是检测样本中的变异，包括单核苷酸变异（SNV）、插入缺失变异（Indel）等。

常见的变异检测问题包括假阳性和假阴性。

针对这些问题，可以考虑以下策略。

首先，采用多个变异检测工具进行分析，不仅能够减少假阳性结果的产生，更能提高结果的准确性。

其次，对于假阴性结果，可以根据实验的目的进行进一步的验证，如采用Sanger测序等验证方法来提高结果的可信度。

测序常见问题分析与解答1、DNA测序样品用什么溶液溶解比较好?答：溶解DNA测序样品时，用灭菌蒸馏水溶解最好。

DNA的测序反应也是Taq酶的聚合反应，需要一个最佳的酶反应条件。

如果DNA用缓冲液溶解后，在进行了测序反应时，DNA溶液中的缓冲液组份会影响测序反应的体系条件，造成Taq酶的聚合性能下降。

有很多客户在溶解DNA测序样品时使用TE Buffer。

的确，TE Buffer能增加DNA样品保存期间的稳定性，但TE Buffer对DNA测序反应有影响，根据我们的经验，我们还是推荐使用灭菌蒸馏水来溶解DNA测序样品。

2、提供DNA测序样品时，提供何种形态的比较好？答：我们推荐客户提供菌体，由我们来提取质粒，这样DNA样品比较稳定。

如果您要以提供DNA样品，我们也很欢迎，但一定要注意样品纯度和数量。

提供的测序样品为PCR产物时，特别需要注意DNA的纯度和数量。

PCR产物应该进行切胶回收，否则无法得到良好的测序效果。

有关DNA测序样品的详细情况请严格参照“DNA测序样品准备及注意事项”部分的说明。

3、提供的测序样品为菌体时，以什么形态提供为好？答：一般菌体的形态有：平板培养菌、穿刺培养菌，甘油保存菌或新鲜菌液等。

我们提倡寄送穿刺培养菌或新鲜菌液。

平板培养菌运送特别不方便，我们收到的一些平板培养菌的培养皿在运送过程中常常已经破碎，面目全非，需要用户重新寄样。

这样既误时间，又浪费客户的样品。

一旦是客户非常重要的样品时，其后果更不可设想。

而甘油保存菌则容易污染。

制作穿刺菌时，可在1。

5ml的Tube管中加入琼脂培养基，把菌体用牙签穿刺于琼脂培养基(固体)中，37℃培养一个晚上后便可使用。

穿刺培养菌在4℃下可保存数个月，并且不容易污染，便于运送。

4、与测序引物有关的问题：答：对于通用测序引物，只要正确使用，一般不会有太大问题，测序引物问题主要发生在客户自己提供的PCR引物上。

应该明确的一点是并不是所用的用于PCR的引物都可以用来作测序，以下几种PCR引物将是不适合用作测序引物的：(1)简并引物，简并引物必然要在测序模板上有多个结合位点，直接影响测序结果。

DNA测序过程可能遇到的问题及分析对于一些生物测序公司（如Invitrogen等），我们的菌液或质粒经过PCR和酶切鉴定都没问题，但几天后的测序结果却无法另人满意。

为什么呢？PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N值。

这是由于Taq酶能够在PCR反应的末端非特异性地加上一个A碱基，我们所用的T载体克隆PCR产物就是应用该原理，通常PCR产物结束的位点，PCR产物测序一般末端的一个碱基为A（绿峰），也就是双脱氧核甘酸ddNTP终止反应的位置之前的A,A后的信号会迅速减弱。

N值情况一般是由于有未去除的染料单体造成的干扰峰。

该干扰峰和正常序列峰重叠在一起，有时机器377以下的测序仪无法正确判断出为何碱基。

有时，在序列的起始端的小片段容易丢失，导致起始区信号过低，机器有时也无法正确判读。

在序列的3’端易产生N值。

一个测序反应一般可以读出900bp以上的碱基（ABI3730可以达到1200bp），但是，只有一般600bp以前的碱基是可靠的，理想条件下，多至700bp的碱基都是可以用的。

一般在650bp以后的序列，由于测序毛细管胶的分辩率问题，会有许多碱基分不开，就会产生N值。

测序模板本身含杂合序列，该情况主要发生在PCR产物直接测序，由于PCR产物本身有突变或含等位基因，会造成在某些位置上有重叠峰，产生N值。

这种情况很容易判断，那就是整个序列信号都非常好，只有在个别位置有明显的重叠峰，视杂合度不同N值也不同。

测序列是从引物3’末端后第一个碱基开始的，所以就看不到引物序列。

有两种方法可以得到引物序列。

1.对于较短的PCR产物（<600bp），可以用另一端的引物进行测序，从另一端测序可以一直测通，可以在序列的末端得到该引物的反向互补序列。

对于较长的序列，一个测序反应测不通，就只能将PCR产物片段克隆到载体中，用载体上的通用引物(T7/SP6)进行测序。

载体上的通用引物与所插入序列间有一段距离，因此就可以得到完整的引物序列。

DNA测序常见问题分析及解决办法总结PCR类型测序模板注意事项PCR类型测序模板注意事项•总反应体积建议为50uL或100uL，扩增结束后取3ul用1%左右的琼脂糖电泳检测，应为单一的条带。

3ul样品总量不低于50ng(非常小的PCR产物可以酌情减小)，PCR产物产量过低说明PCR扩增结果不是很理想，应改进条件重新扩增。

•对于有杂带和扩增弥散的PCR产物，需经琼脂糖电泳将目的片段切下来并回收，建议将PCR 产物作克隆后进行测序。

有杂带的和扩增弥散的PCR产物即使通过琼脂糖电泳纯化，测序仍有可能出现双峰等异常结果。

•经上述检测合格的PCR产物，需经过琼脂糖电泳纯化去除未反应的引物，dNTP，引物二聚体等影响测序反应的组分。

有多种纯化方法可供选择，Promega，Qiagen和生工等公司都有相应的产品可供选择。

纯化后的PCR产物经电泳检测估计总量应不低于200ng/Kb(非常小的PCR产物可以酌情减小)。

•与质粒模板相比，PCR产物彼此间差异很大，因此，每个PCR模板应尽可能提供相应的PCR 退火温度和PCR产物的长度，以供测序时参考。

•PCR模板一般不应短于200bp，过短的PCR产物应经克隆后进行测序。

•纯化好的PCR产物应溶于双蒸水中，TE缓冲液会严重影响测序反应。

•若让公司对PCR产物进行纯化，PCR产物需满足∶总量不低于1ug/kb，片段长度不低于200bp •各种PCR测序模板均应提供相应的测序引物，并尽可能提供引物的全序列，并将引物浓度准确稀释到5pmole/ul 。

引物浓度的换算关系∶总ng数 = pmole x 分子量/1000由于PCR产物测序相对较难，为使您能拿到一个好的结果，请尽量满足上述要求。

DNA测序常见问题分析及解决办法总结测序常见问题分析序列中出现N值的常见原因：通常有以下几种情况将造成测序结果中N值较多：•PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N值。

DNA测序技术的使用中常见问题DNA测序技术是一项重要的科学工具，被广泛应用于生物医学研究、进化学、司法科学等领域。

然而，在使用DNA测序技术的过程中，常常会遇到一些问题。

本文将介绍DNA测序技术使用中常见的问题，并提供相应的解决方案。

1. 样品质量问题在DNA测序之前，样品质量是至关重要的。

低质量的样品会导致测序结果的偏差和错误。

常见的样品质量问题包括样品的纯度不高、浓度不足或者样品受到了污染。

解决方案：- 提高样品纯化方法：使用恰当的纯化试剂和技术来提高样品的纯度，例如使用芳香族化合物或异维酮类物质。

- 检测样品浓度：使用光谱法或者比色法来测量样品中DNA的浓度，确保其符合测序要求。

- 避免样品污染：在样品处理过程中，严格遵守无菌操作规程，使用经过无菌过滤器过滤的试剂和器具。

2. 序列读取长度问题DNA测序技术可以产生从数十个碱基对到上百万个碱基对的序列。

然而，部分DNA测序技术的读取长度有限，这可能影响到某些研究或应用的结果。

解决方案：- 选择合适的测序方法：不同的测序方法具有不同的读取长度，选择适合自己研究目的的测序方法，以满足相关的研究需求。

- 使用测序技术的新发展：不断发展的测序技术，如第三代测序技术，具有较长的读取长度和更高的准确性，可以解决传统测序方法的限制。

3. 突变检测问题DNA测序技术不仅可以用于确定特定序列的顺序，还可以用于检测和鉴定突变。

然而，突变的检测可能受到多种因素的影响，如检测方法的灵敏度和特异性、突变类型的多样性等。

解决方案：- 选择合适的突变检测方法：不同的突变具有不同的检测方法，如SNP分析、插入和缺失突变的分析等。

选择合适的方法来检测特定类型的突变。

- 结合多种检测方法：结合使用不同的突变检测方法可以提高突变检测的准确性和可靠性。

- 验证突变结果：通过使用其他独立的测序技术或方法来验证突变结果，以确保结果的可靠性。

4. 数据分析问题DNA测序技术生成的数据量巨大，数据分析是一个复杂而耗时的过程。

1 、为什么开始一段序列的信号很杂乱，几乎难以辨别这主要是因为残存的染料单体造成的干扰峰所致，该干扰峰和正常序列峰重叠在一起；另外，测序电泳开始阶段电压有一个稳定期，所以经常有20-50 bp 的紧接着引物的片段读不清楚，有时甚至更长。

2 、为什么在序列的末端容易产生 N 值，峰图较杂由于测序反应的信号是逐渐减弱的，所以序列末端的信号会很弱，峰图自然就会杂乱，加上测序胶的分辨率问题，如果碱基分不开，就会产生 N 值，正常情况下ABI377测序仪能正确读出500个碱基的有效序列。

3 、测序结果怎么找不到我的引物序列如果找不到测序所用的引物序列。

这是正常的，因为引物本身是不被标记的，所以在测序报告中是找不到的；如果找不到克隆片段中的扩增引物，可能是您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近，开始一段序列很杂，几乎难以辨别，有可能看不清或看不到扩增引物；另外插入片段的插入方向如果是反的，此时需找引物的互补序列。

4 、测序结果怎么看不到我克隆的酶切位点可能的原因同上，您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近，开始一段序列很杂，几乎难以辨别，有可能看不清或看不到酶切位点。

通常我们会尽量选择距离酶切位点远点的引物，当然，若是样品出现意外原因，如空载、载体自连等，克隆的酶切位点也是看不到的。

5 、你测出的结果与我预想的不一致，给我的结果与我需要的序列有差距，这是怎么回事首先，我们会核实给您的测序结果是否对应您的样品编号，如果对应的是您的样品，由于不知您的实验背景，测得的序列是否与您预想的结果一致我们无法判断，我们能做到的是检查发送给您的测序结果和您提供来的样品是否一致。

6 、序列图为什么会有背景噪音(杂带)是否会影响测序结果序列图的背景杂带是由荧光染料引起，如果太强会影响测序结果，要看信噪比，我们给的结果信噪比大都在98%以上。

7 、测序结果为什么与标准序列有差别原因可能有：样品个体之间的差别、测序准确率的问题，自动测序仪分析序列的准确并非100%，建议至少测一次双向，通过双向测序可以最大限度减少测序的错误。

高通量测序数据分析的常见问题解决方案高通量测序技术的快速发展为生物学和医学研究提供了前所未有的机会，但也带来了庞大的数据量和复杂的数据处理分析问题。

在高通量测序数据分析过程中，研究人员常常面临着各种挑战和困惑。

本文将介绍几个常见的问题，并提供相应的解决方案和建议。

问题一：数据质量控制与预处理在高通量测序数据分析的初步阶段，对数据的质量进行控制和预处理是至关重要的一步。

面临的主要问题包括测序质量评估、读长过滤、去除接头序列和低质量碱基。

这些步骤可以通过各种质量评估工具和软件来完成，如FastQC、Trimmomatic和FASTX-Toolkit等。

这些工具能够帮助我们准确评估数据的质量，并对数据进行过滤和修剪，以提高下游分析的准确性和可靠性。

问题二：序列比对将测序数据与参考基因组进行比对是高通量测序分析的重要步骤之一。

然而，由于测序错误、基因组变异和工艺偏差等因素的影响，序列比对常常面临多种挑战。

为了解决这些问题，我们可以使用一些经典的比对软件，如Bowtie、BWA和STAR等。

此外，考虑到基因组的重复区域和变异位点的存在，使用序列比对软件时要注意参数的设置和选择，以获得更准确和可靠的比对结果。

问题三：基因表达差异分析高通量测序技术广泛应用于基因表达差异分析，寻找与生物学过程或疾病相关的差异表达基因。

然而，在进行差异分析时，我们需要考虑数据的标准化、差异表达基因的筛选和功能注释等问题。

为了解决这些问题，我们可以使用一些经典的差异分析工具，如DESeq2、edgeR和limma等。

此外，结合生物学知识和数据库，进行功能注释和富集分析也是解读差异表达基因的重要方法。

问题四：变异检测与注释高通量测序数据还可以用于检测基因组变异，包括单核苷酸多态性（SNP）、插入/缺失（INDEL）和结构变异等。

变异检测面临的主要问题包括测序错误、基因组重复区域和复杂变异的检测等。

为了解决这些问题，我们可以使用一些常用的变异检测工具，如GATK、SAMtools和VarScan等。

DNA测序常见问题解析DNA测序常见问题解析⼀．引物问题Q：为什么我在测序报告上找不到我的引物序列？A：这⾥分以下⼏种情况：1. PCR引物作为测序引物进⾏测序时，所测序列是从引物3'末端后第⼀个碱基开始的，⽽且刚刚开始的碱基由于在⽑细管电泳中不能很好地分离⽽导致准确性下降，所以找不到您的引物序列。

（1）对于较短的PCR产物（<600 bp），可以⽤另⼀端的引物进⾏测序，从另⼀端测序可以⼀直测到序列的末端，就可以在序列的末端得到您的引物的反向互补序列。

（2）对于较长的序列，⼀个测序反应测不到头，因此就只能将您的PCR产物⽚段克隆到适当的载体中，⽤载体上的通⽤引物进⾏测序。

由于载体上的通⽤引物与您的插⼊序列之间还有⼀段距离，因此就可以得到您的完整的引物序列。

（3）由于在测序的起始端总会有⼀些碱基⽆法准确读出，因此，您如果想得到您的PCR产物的完整序列，最好克隆后进⾏测序。

2. 有时质粒做模板进⾏测序时，由于某些原因，质粒上没有插⼊外源⽚段，为空载体，所测的序列完全为载体序列，此时也找不到引物序列。

3. 找不到克隆⽚段的扩增引物。

发⽣这种情况原因有2个：（1）您在构建质粒时采⽤的⼯具酶的酶切位点距离您的测序引物太近，由于荧光染料的⼲扰在序列开始的部分会不⼗分准确。

⽐如pBluescript Ⅱ KS这个质粒如果采⽤Sac I做⼯具酶，采⽤T7引物测序：那么从T7引物末端到Sac I的酶切位点只有6个bp，这样酶切位点后的扩增引物序列在测序报告上很可能不完整。

解决的办法是采⽤M13 Forward引物来测序，这样可以保证Sac I的位点和之后的引物序列都可以完整的出现在报告中。

（2）您的插⼊⽚段的插⼊⽅向是反的，这时您不妨找⼀下您引物的反向互补序列。

或者您插⼊的⽚段可能不是您的⽬的⽚段，⽽是由于⾮特异性扩增出来的⽚段，还有可能您送过来的样品被污染。

Q：测序发现引物有突变或缺失是什么原因？A：测序发现引物区有突变，主要考虑三个⽅⾯的原因：测序，PCR/克隆过程，引物本⾝。

测序常见问题及解决策略一、PCR常见问题1.假阴性，不出现扩增条带PCR出现假阴性结果，可从以下几个方面来寻找原因：1）模板：①模板中有杂蛋白；②模板中有Taq酶抑制剂；③在提取制备模板时丢失过多；④模板核酸变性不彻底。

2）酶：酶失活或反应时忘了加酶。

3）Mg2+浓度：Mg2+浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

4）反应条件：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。

5）靶序列变异：靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

2.假阳性假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

常见原因有：1）引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。

靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。

需重新设计引物。

2）靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。

这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。

二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。

可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。

3.出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。

二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。

三是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。

大规模基因测序数据分析中的常见问题与解决方法研究随着高通量测序技术的快速发展，大规模基因测序数据的产生量也在不断增加。

这些测序数据在疾病研究、药物开发以及个性化医学等领域发挥着重要作用。

然而，对这些海量的数据进行分析和解读在实践中面临着一系列的挑战。

本文将针对大规模基因测序数据分析中常见的问题，探讨一些常见的解决方法。

1. 数据预处理问题在大规模基因测序数据分析中，数据预处理是一个必不可少的步骤。

然而，由于测序技术本身的限制以及实验条件的误差，测序数据往往存在一些噪声和错误。

因此，数据的质量评估和过滤是非常重要的。

其中常见的问题包括低质量碱基的过滤、测序错误的校正以及去除接合克隆等。

针对这些问题，研究人员可以采用一些常见的解决方法。

例如，可以使用质量评估工具来检测数据中的低质量碱基，并将其从数据集中去除。

此外，也可使用纠错算法来校正测序错误，并且可以根据测序深度和特定的应用需求来制定去除接合克隆的策略。

2. 数据分析和解读问题在大规模基因测序数据中，数据的分析和解读是一个十分复杂的过程。

研究人员面临诸如基因表达分析、变异检测和功能注释等问题。

这些问题在一定程度上影响着基因组学研究的准确性和可靠性。

为了解决这些问题，研究人员通常采用一系列的分析工具和方法。

例如，对于基因表达分析，可以使用差异表达基因检测方法，如DESeq和edgeR。

对于变异检测，可以使用一些常见的算法和工具，如GATK和SAMtools。

在功能注释方面，可以使用数据库和软件工具，如DAVID和EnrichR。

3. 数据管理和存储问题大规模基因测序数据的处理和存储需要大量的计算资源和存储空间。

而且，数据的管理和存储也面临着一些挑战，如数据安全性、数据共享以及数据备份等问题。

为了解决这些问题，研究人员可以采用一些有效的数据管理和存储策略。

例如，可以使用云计算平台来提供高性能的计算和存储资源，以应对数据处理和存储的需求。

此外，也可以建立数据共享和备份机制，以确保数据的安全性和可靠性。

测序常见问题分析1.图谱无信号1.1、质粒培养，转化或其他随机原因使质粒上引物序列发生变化，导致无结合位点1.1.1同一模板两端引物测序均无信号，浓度不好安排重抽，反之停止实验，建议客户确认后重新送样1.1.2同一模只一端无信号，确认不是空载体，安排重新实验或换同序列其他引物，两次测序无信号则停止实验，客户要求测通的安排单向测通。

反之建议客户单向测通1.1.3客户提供序列我司合成引物，二次实验仍无信号则停止实验，建议客户提供载体图谱或目的基因我处给他设计引物测序1.1.4客户提供序列我司设计并合成引物核实设计无误可安排重新实验，仍不成功则停止实验，请客户确认提供的序列是否和模板相匹配1.1.5我司设计并合成的步行引物核实设计无误可安排重新实验，仍不成功可重设引物或换另一端测通。

1.1.6某一通用引物测序无信号先查看当天该引物的其他实验或近期该引物的实验情况，均无信号则换管引物重新实验，当天该引物的其他实验有成功的，该反应重做1.1.7一订单多样品用同一对引物测序，某条引物测序均无信号，若为客户提供引物则停止实验。

若为通用引物有同序列其他引物，在确认不是空载载体的情况下，安排换引物试作三至四个反应，效果好全部安排用该引物测序；效果不好都停止实验。

客户要求测通的安排单向测通，反之建议单向测通。

1.1.8重摇重抽测序无信号则取消，建议重新提供样品1.1.9客户提供质粒直接测序无信号则停止实验，建议客户提供新鲜菌液1.1.10用PCR引物测序无信号可换备用引物测序，无备用引物停止实验，建议用载体上引物测序。

1.2、PCR 产物1.2.1同一模板两端引物测序均无信号则停止实验，建议客户克隆后测序1.2.2 同一模只一端无信号，安排重新实验, 仍无信号则停止实验，客户要求测通的安排单向测通，反之建议步行测通2. 图谱信号弱可参考原始峰图，对不能出报告的峰图的处理如下：2.1 同一模板某一端，可安排提高浓度梯度重新实验2.2 某一模板或一订单多个模板中的一个模板2.2.1 鉴定浓度正常可安排提高浓度梯度重新实验，效果仍不好可作弱stop处理2.2.2 一次抽提出的质粒亮度弱，可安排重新抽提质粒后测序2.2.3 二次抽提出的质粒亮度弱，可停止实验，建议重新提供样品3 双峰3.1 PCR 产物测序3.1.1 引物不纯，引物客户提供该结果可出，引物我司合成安排重合引物3.1.2 引物特异性差，有双或多结合位点，可换备用引物测序，无备用引物即出结果3.1.3 polyT/A/G/C 出结果，单向建议客户换另一端测序。

测序常见问题解答1.为什么提供新鲜的菌液？如何提供新鲜的菌液？2. DNA测序样品用什么溶液溶解比较好？3. 提供DNA测序样品时，提供何种形态的比较好？4. 提供的测序样品为菌体时，以什么形态提供为好？5. PCR产物直接测序有什么要求？6. 为什么PCR产物直接测序必须进行Agarose胶纯化？7. 如何进行PCR产物纯化？8. 对于测序用的质粒DNA的要求有哪些？9. 如何鉴定质粒DNA浓度和纯度？10. 对测序引物的要求有哪些？11. 为什么测序引物必须特异地与DNA模板结合？12. 测序结果有很多套峰（出现很多N)，还照常收费，为什么？13. 为什么用PCR产物测序时，经常会出现套峰现象？14. 出现套峰的原因是什么？15. 测序结果不到800 Bases，还照常收费了，为什么？16. 为什么在测序报告上找不到引物序列？17. 在测序结果上，找不到测序用引物后面的序列，为什么？18. 怎样使用擎科提供的测序报告？19. PCR片段直接测序和PCR片段经克隆后测序的结果有何区别？20. 测序结果和文献资料不一样，为什么？21. 我的基因序列与标准序列为什么有差别？22. DNA片段很长，一个反应读不到头，怎么办？23. 测序完成后，测序样品和引物将如何处理（或保存)？24 怎样选择（设计）测序用引物？25. 觉得你给我的结果完全不是我需要的序列？26. 我的样品上有一个杂合位点，为什么在你们的报告上看不到杂合的信号？27. 超过6Kb的DNA片断如何进行测序？28. 全自动荧光测序的准确性如何？29. 用测序的方法检测点突变可靠吗？30. 我要求5’到3’正向测序，为什么你们给我的序列是反的？31. 我的样品在你们所说的可靠范围内有一处存在疑问，能否重新测一次？32. 我的样品你们已经测通了，但为什么在overlap区有这么多的错配，给出的全序列和单个报告也存在差异，我该相信谁？33. 你们为什么在primer walking时总将引物设计的那么靠前？34. 我有一个4KB的PCR片段，希望你们帮我测通。

测序常见问题分析主讲人: 张隽辉LOGO1. 序列结构对测序的影响图例：poly结构原因: 主要原因是在polyT结构后,测序酶容易在模板上 滑动，导致随后的峰型变乱 或者移码 解决办法: 此类样品通过对其反向互补序列进行测序，通过 拼接可以得到模板全长序列.图例：重复结构原因: 重复结构会导致测序复制框的滑移，另外测序试剂采用 了I, U 代替G, T, 与模板结合能力较弱, 测序酶很难延伸, 信号会迅速衰减或峰谱很乱 解决办法： 使用反向引物对模板进行测序，测到重复序列反向互 补位置时，即可完成模板全长的拼接,一般测A\C重复 序列比G\T要容易一些图例：回文结构位点94至137碱基前后互补, 形成回文结构，该结构导致 后面的信号衰减，出现错误的判读。

图例: 特殊结构现象: 信号在73bp（信号峰图2700处）突然中断， 测序PCR反应终止原因: 变性后的单链在该处很可能互补或在全序列中有大的 特殊结构，造成严重的二级结构，使dNTP 和 ddNTP不 能和模板结合, 测序酶无法正常延伸 解决方法: 酶切,做亚克隆测序2.测序常见图谱分析图例:双克隆1现象: T载体序列峰图正常, 连接位置处出现套峰原因: 1.有插入片段的载体和空载体同时存在 2.PCR产物用T载体进行连接时,其片段能以正反两个方向 插入T载体 解决办法： 重新挑取单克隆备注: 重新进行PCR反应或者酶切鉴定仅能证明该克隆含有插入片段， 并不足以证明模板的单一图例:双克隆2现象: 载体序列及插入片段前半部分峰图单一,套峰出现在插入片段中间原因: 1. pcr产物不纯,且产物的引物结合区以及峰图单一的序列 都一样 2. 部分模板碱基发生突变,双峰出现的位点是由碱基突变 的位置决定的,有时会一端正常一端双峰(插入片断超过一 个反应测序长度(800~900bp)), 或者两个反应都双峰 解决方法: 重新挑单克隆图例:非特异扩增现象: 峰图起始即双峰原因及解决方法: 1. 对于质粒样品, 引物在序列上有两个结合位点(载体上 和插入片段上),换一个引物测序 2.对于PCR产物,有两个模板,且两个模板都能和引物结合 扩增, 换引物或克隆测序图例:等位基因双模板现象:序列的80bp到120bp之间有两套峰存在，没有发生移码突变解决方法: 采取克隆的方法将两套模板分开，分别进行测序图例：碱基缺失碱基缺失常见在PCR产物中，特别是从基因组中扩增得到的PCR片段， 上图的186位缺失两个连续的T。

一代测序常见问题及解决策略测序常见问题及解决策略一、PCR常见问题1.假阴性，不出现扩增条带PCR出现假阴性结果，可从以下几个方面来寻找原因：1）模板：①模板中有杂蛋白；②模板中有Taq酶抑制剂；③在提取制备模板时丢失过多；④模板核酸变性不彻底。

2）酶：酶失活或反应时忘了加酶。

3）Mg2+浓度：Mg2+浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

4）反应条件：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。

5）靶序列变异：靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

2.假阳性假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

常见原因有：1）引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。

靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。

需重新设计引物。

2）靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。

这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。

二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。

可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。

3.出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。

二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。

三是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。