鱼组织线粒体基因组提取方法的改进

mt DNA的分离及纯化按戴建华等报道的方法，就具体情况稍加改进，步骤如下（除特别说明，均在4℃下完成）：1.1 取新鲜肝组织，放在缓冲液A（0.25M 蔗糖，0.01M Tris·Hcl，0.001M Na2-EDTA，pH8.0）中漂洗2~3次，尽可能去除表面血污、结缔组织及脂肪组织后剪碎。

按组织重﹕缓冲液A=1﹕5~10加入缓冲液A，用玻璃匀浆器冰浴匀浆。

1.2 1000 g•min-1离心15min；取上清液；15000 g•min-1离心20min，弃上清，沉淀用缓冲液B （0.25M 蔗糖，0.05M Tris·Hcl，0.007M Mg Cl2，p H7.5）洗涤，按0.5m L•g-1肝的比例加入缓冲液B 悬浮沉淀后加入DNase I 至终浓度为100 µg•m L-1，30℃下作用30min。

1.3 冰浴冷却，加入2倍体积的DNase I反应终止液（0.25M蔗糖，0.1M Na2-EDTA，pH8.0）。

15000g•min-1离心20min。

沉淀用DNaseI反应终止液洗涤一次，重复离心。

1.4 按0.5 m L•g-1肝加入缓冲液C（0.1M Nacl，0.05M Tris·Hcl，0.01M Na2-EDTA，p H8.5）悬浮沉淀，加入SDS至终浓度为1%~1.5%，吸打混匀后37℃保温15min。

1.5 用等体积的苯酚，苯酚/氯仿（1:1），氯仿/异戊醇（24:1）各抽提一次。

取水相，加0.2 倍体积1M Na Ac和2倍体积的预冷无水乙醇，混匀后放在4℃冰箱中过夜。

1.6 15000g•min-1离心30min后去上清；沉淀用70%乙醇洗涤2次，干燥，TE（0.01M Tris·Hcl，0.001M Na2-EDTA，pH8.0）溶解。

1.7 加入预处理的RNase I 至终浓度为50µg•m L-1，37℃保温1h。

动物线粒体D NA 提取的原理和方法*X夏玉玲 刘彦群 鲁 成X X (西南农业大学蚕学与生物技术学院农业部蚕桑学重点实验室 重庆 400716)摘 要 从动物线粒体的特征、线粒体的鉴定方法、提取线粒体D NA 各步骤等原理出发,比较了目前常用的几种提取线粒体D N A 的方法,提出动物线粒体D N A 提取的几点关键步骤,并提出一套优化的操作流程。

关键词 线粒体 线粒体D N A 提取方法线粒体是存在于绝大多数真核细胞内的一种基本的重要的细胞器。

它是细胞进行氧化磷酸化的场所。

线粒体基因组不仅是研究D N A 结构与复制转录的良好模型,也是研究真核细胞核酸与蛋白质合成非常合适的模型系统。

线粒体基因组与核基因组的同源基因结构对比也被广泛应用于核基因和核外基因的进化研究中。

由于线粒体基因在真核生物具有高保守性,所以它已成为了研究物种进化的一种常用的标记,并为线粒体起源提供有价值的线索[1]。

动物线粒体D NA 具有分子量小、结构简单、母性遗传和进化速度快等特点,已广泛应用于动物群体遗传学和进化生物学等领域的研究[2]。

进行动物线粒体D NA 方面意义重大,现将线粒体D N A 的提取的原理和方法介绍如下:1 提取动物线粒体D N A 的原理1.1 线粒体的特征线粒体是由内外两层膜组成,外膜光滑,内膜向内回旋折叠,形成许多横隔。

线粒体中含有多种氧化酶,在此进行TCA 循环、呼吸连电子传递和氧化磷酸化等产能作用,并传递和储存所产生的能量,是细胞的动力工厂和生物氧化的主要场所。

线粒体的形状、大小、数目和组成,在不同生物、不同组织以及生活于不同条件下的细胞中变化很大。

线粒体的外型呈多样化,绝大多数类型细胞呈圆形、卵原形,也有呈杆状的。

其体积大小不等,一般直径比较一致,为0.5~1.0L m,长度为1~5L m,最长可达到7L m 。

线粒体的数目与生物种类、组织、细胞类型和细胞生理功能变化有关。

锥虫和有的真菌只有一个线粒体,大多数动物的肝脏细胞含有上千个线粒体,生殖细胞如卵母细胞可达到30万个线粒体,家蚕的每个后部丝腺细胞只有2~4个线粒体[13],而有的细胞根本没有线粒体;在细胞生命活动旺盛时,它的数量多,在衰老时,数量少,有时可能消失;新生细胞比衰老细胞或病变细胞的线粒体多。

鱼类线粒体DNA研究新进展一、本文概述线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）作为生物体内的一种重要遗传物质，近年来在鱼类研究中逐渐展现出其独特的价值和潜力。

鱼类线粒体DNA研究新进展不仅深化了我们对鱼类遗传多样性的理解，还为鱼类遗传育种、系统发生、种群遗传结构分析等领域提供了有力的工具。

本文旨在综述近年来鱼类线粒体DNA研究的新进展，探讨其在鱼类生物学中的应用前景，以期为鱼类遗传资源保护和可持续利用提供理论支持和实践指导。

本文将首先回顾线粒体DNA的基本结构和特点，然后重点介绍鱼类线粒体DNA的提取方法、测序技术及其在鱼类遗传多样性、系统发生和种群遗传结构分析中的应用。

还将讨论鱼类线粒体DNA在遗传育种和遗传资源保护中的潜在应用价值，并展望未来的研究方向和挑战。

通过本文的综述，希望能够为从事鱼类线粒体DNA研究的学者提供有益的参考和启示，共同推动鱼类线粒体DNA研究的深入发展。

二、鱼类线粒体DNA的结构与功能鱼类线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是一种双链、闭合环状的分子，通常大小为16-20千碱基对（kb），是细胞器中唯一的DNA分子。

鱼类mtDNA的结构主要包括重链（H链）和轻链（L链），其中H链编码了大部分基因，而L链则编码了剩余的少数基因。

这些基因主要编码线粒体氧化磷酸化系统的13个蛋白质亚基，以及2个rRNA和22个tRNA，这些成分共同构成了线粒体的核糖核蛋白体，负责线粒体内蛋白质的合成。

鱼类线粒体DNA的功能主要体现在以下几个方面：mtDNA是鱼类线粒体遗传信息的载体，通过母系遗传的方式传递给后代，因此，在鱼类遗传学和进化生物学研究中，mtDNA被广泛应用为分子标记。

mtDNA编码的蛋白质是线粒体氧化磷酸化系统的重要组成部分，这些蛋白质参与线粒体的能量代谢过程，对鱼类的生命活动起着至关重要的作用。

mtDNA的突变和变异也被广泛用于鱼类种群遗传结构、遗传多样性和系统发育等研究。

中国水产科学 2012年11月, 19(5): 1068−1073 Journal of Fishery Sciences of China研究论文收稿日期: 2012−01−23; 修订日期: 2012−04−25.基金项目: 广东省重大科技计划项目(2009B030600002); 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(2010ZD01,2011YD03); 广东省科技计划项目(2011B031100001); 广东省自然科学基金资助项目(9451030002002475).作者简介: 孔啸兰(1986−), 女, 硕士研究生, 研究方向: 渔业生态保护. E-mail: weilankong.2005@ 通信作者: 李纯厚, 研究员. E-mail: scslch@DOI: 10.3724/SP.J.1118.2012.01068福尔马林固定鱼类标本DNA 提取方法的优化孔啸兰1,2, 陈作志1, 林琳1, 李纯厚1, 梁沛文11. 中国水产科学研究院 南海水产研究所, 农业部南海渔业资源开发利用重点实验室, 广东 广州 510300;2. 上海海洋大学 水产与生命学院, 上海 201306摘要: 气候变化和人类活动胁迫致使许多海洋鱼类种群结构发生了显著变化。

为了摸清鱼类种群结构对气候变化和人类胁迫活动的响应机理, 利用福尔马林固定标本研究较早年代海洋鱼类DNA 是一种有效的途径。

为了解决福尔马林固定鱼类样本DNA 提取质量差的难题, 以福尔马林固定近50年的金线鱼(Nemipterus virgatus )标本为例, 研究DNA 提取过程中多个因素对DNA 提取产量的影响。

以取样部位、除甲醛处理、消化时间、抽提方法为考察因素, 以DNA 提取浓度为评价指标, 通过SPSS 软件设计L 8(4×24)正交实验。

结果, 得到的最优处理组为: 肌肉组织样品经GTE 缓冲液浸泡与酒精梯度处理后, 90℃水浴30 min, 真空干燥处理, 加入裂解液与蛋白酶K, 55℃水浴消化3 h, 试剂盒法提取DNA 。