西太平洋放线菌的分离筛选

杀灭水产病源菌的放线菌筛选及放治试验从海洋或淡水体的污泥中分离水生放线菌，以鳗弧菌和肠型点状气单孢菌，这两种典型病害菌为指示菌，筛选杀菌放线菌，并初步鉴定。

1.指示菌：鳗弧菌和肠型点状气单孢菌中科院水生生物研究所提供大肠杆菌和金黄色葡萄球菌实验室保存种2.放线菌株分离纯化：从不同地区海洋或淡水体的污泥样品，取3g加入30mL无菌去离子水中，震荡20-30min，梯度稀释至10-2、10-3、10-4 ，涂布于高氏1号平板（培养基中加入0.0075℅重铬酸钾，抑制细菌和真菌），28℃培养7d.挑不同形态的单菌落到高氏1号斜面培养，将菌落在平板上反复划线纯化得纯培养物，4℃冰箱保存。

分离出86株淡水放线菌和77株海洋放线菌。

3.放线菌株的筛选：3.1初筛：将纯化菌株接种于改良黄豆粉琼脂培养基上，28℃培养8d.用无菌钻孔器打成5mm的琼脂块。

取指示菌0.1ml涂布于普通琼脂平板，挑取打好的放线菌琼脂块反贴到已涂指示菌的平板上，鳗弧菌和肠型点状气单孢菌在28℃培养，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在37℃培养24h，进行抑菌圈的观察和测量。

琼脂扩散法抑菌试验表明：19株淡水放线菌具有抑菌活性，32株海洋放线菌具有活性，故海洋放线菌产生抗菌物质比例高。

对初筛活性强的7株海洋和3株淡水放线菌加入复筛。

3.2复筛：有较强抗菌能力的放线菌接种于改良黄豆粉液体培养基中，28℃140r/min培养8d，取指示菌0.05ml涂布于普通琼脂平板，用无菌打孔器在培养基上打孔，取放线菌培养液0.05ml注入孔中，培养24h，进行抑菌圈的观察和测量。

获得较好的海洋放线菌4株，淡水放线菌2株，其抗菌活性测定结果表：六株放线菌抗菌活性测定结果（抑菌圈直径） mm鳗弧菌肠型点状大肠杆菌金黄色葡菌株产气单胞菌萄球菌1 18 17 15.5 19.52 18 18 16 183 15 15 16 184 10 8 -（无抗） 165 13 14 - 14.56 15 15 - 184.六株放线菌的初步鉴定：4.1形态和培养特征观察：分别接种于高氏1号培养基上，插片，28℃培养3 7 15 30d，取出插片，观察气生菌丝（包括颜色，是否产色素）基内菌丝（包括颜色，是否产色素）是否产生横隔断裂等特征，并观察它们的生长情况，取成熟期的特征作为分类依据。

放线菌筛选的一般方法1.放线菌样本的收集：可以从自然环境中收集土壤、植物、水体等样本，也可以从实验室中保存的菌种库中选取菌种作为筛选对象。

2.放线菌的分离：将收集到的样本通过稀释涂布、均匀涂布等方法进行分离。

将分离出的放线菌菌落定植于选择性培养基上，利用差异营养需求、抗生素抑制等原理，筛选出纯培养基。

3.放线菌培养：将分离出的纯净菌株接种到适宜的培养基上进行培养，包括液体培养和固体培养。

液体培养可以用于代谢产物的筛选，固体培养主要用于菌株保存和鉴定。

4.代谢产物的筛选：通过对放线菌培养液或菌体提取物的分离、纯化和结构鉴定，筛选出具有生物活性的代谢产物。

常用的筛选方法包括生物测定法、波谱分析法等。

其中，生物测定法是通过对目标活性的生物测定，如抗菌活性、抗肿瘤活性、抗炎活性等，筛选出具有生物活性的化合物。

5.进一步筛选与优化：在获得具有初步生物活性的代谢产物后，可以进一步对其进行筛选与优化。

可以通过改变培养条件（如培养基、温度、pH值等）、发酵工艺等方式提高活性代谢产物的产量和纯度。

6.结构鉴定：对优选的生物活性代谢产物进行结构鉴定，通常使用核磁共振谱、质谱、红外光谱等波谱技术进行分析。

结构鉴定有助于揭示生物活性物质的药理作用机制，为后续研究提供基础。

7.生产量扩大与优化：当获得了具有潜在药用价值的放线菌菌株和代谢产物后，可以进行大规模的发酵生产以提高产量。

在此过程中，需要不断优化发酵工艺、培养基成分和培养条件，以提高产量和纯度。

综上所述，放线菌筛选的一般方法包括放线菌样本的收集、放线菌的分离、放线菌培养、代谢产物的筛选、进一步筛选与优化、结构鉴定和生产量扩大与优化。

这些方法的应用能够帮助科学家发现新的放线菌菌株和生物活性化合物，并为新药研发提供重要的基础信息。

放线菌的分离与筛选方法放线菌介于细菌和丝状真菌的一类丝状原核生物，多为腐生，少数寄生。

腐生型在自然界物质循环中起着重要作用。

放线菌突出特性产生抗菌素，常以孢子或菌丝状态存在，以土壤最多，常存在肥土农田土中性或偏碱性土壤中。

1.拮抗放线菌的筛选方法：1.1平板划线法：待测菌株与检测病原菌通用培养基制成平板，在平板中央划线接种待测菌株，28-30℃ 3-5d，将病原菌垂直方向划线于待测菌生长线的两侧，不能与待测菌相连，在37℃ 24h取出观察。

如果待测菌株对病原菌有抑制活性，病原菌靠近待测菌的一端生长会受到待测菌抑制产生抑菌带。

可根据抑菌带的长短来判断待测菌活性强弱。

选择抑制活性强的复筛。

1.2抑菌圈法或十字交叉法：常用的初筛方法将待测菌接种于平板，长出成熟菌落后，用打孔器将供试病原菌苔打成直径5-6mm小菌块，并将其移入到病原菌平板培养基中，将待测菌与病原菌呈十字交叉排列，即病原菌在中央，待测菌置于病原菌的四周，培养3-4d。

若有抑菌活性在待测菌周围形成一个没有生长病原菌抑菌圈。

若菌块厚度大小一致的，抑菌圈的大小可直观反应待测菌抑菌活性的强弱。

1.3纸片法或生长速率法：主要测定发酵液的抑菌活性，即将相同灭菌后的圆形滤纸片放于待测发酵液中，取出并黏贴在接种有病原菌的平板培养基，培养后观察有无抑菌圈或抑菌圈的大小。

2.放线菌分离与筛选.2.1培养基；2.1.1改良高1号：可溶性淀粉20g/L KH2PO40.5g/L NaC10.5g/L MgSO40.2-0.5g/L KNO3 1g/L FeSO40.01g/L 重铬酸钾（3%）3.3mL/L PH7.2-7.4（分离保存用）每100ml培养基加入1ml0.1℅的FeSO4溶液。

2.1.2淀粉培养基和秸秆腐解物培养基2.1.3拮抗试验培养基：高1号牛蛋 PDA改良培养基加3g牛肉膏2.2抑菌剂的选择：有效降低细菌真菌的数量，细菌扩散真菌蔓延速度迅速。

细胞毒活性海洋放线菌的筛选及两株目标菌株次级代谢产物的研究３筛选样品的准备将冰箱保藏的菌株接于原斜面培养基上，于２８＂Ｃ培养箱中活化培养５至８天后，分别接种到５ｍＬ试管液体培养基中，于２８＂Ｃ试管摇床中２４０ｒｐｍ振荡培养７天。

取全部发酵物，超声破碎菌体细胞，按体积比加入２倍量的甲醇，静置过夜，离心取上清液，浓缩至干，所得固形物为活性测试样品。

４活性筛选结果４．１海虾生物致死法：在用海虾生物致死法测试的２６２株放线菌发酵样品中，１００Ｊｆ，ｇ／ｍＬ的有活性菌株共有７８株。

４．２抑菌活性筛选：２６２株放线菌发酵样品经抑菌活性筛选之后，有３２株对至少一种致病菌有活性。

４．３肿瘤细胞筛选：在海虾生物致死法初筛有活性的７８株放线菌样品中，经肿瘤细胞二级复筛，共有１７株在终浓度１００ｕｇ／ｍＬ时对Ｋ５６２细胞显示了不同程度的细胞毒活性。

其中，１３株菌株在终浓度１０＃ｇ／ｍＬ仍显示较强的活性。

部分活性结果参见Ｆ睡１．２．１。

细胞毒活性海洋放线菌的筛选及两株目标菌株次级代谢产物的研究第三节小结本章采用改良的９６孔板海虾生物致死法和抑菌试验作为初筛模型，成本低廉，测试样品用量少，可筛样本数大，可以扩大筛选面、加快筛选速度，故可通过大规模筛选，快速排除绝大多数无活性的菌株，具有十分显著的优越性。

复筛采用流式细胞技术，结合镜检观察细胞形态学变化，选择有限的初筛有效菌株，专门检测具有细胞周期抑制、细胞凋亡及坏死性细胞毒等活性的菌株，具有灵敏、微量、快速的优点。

结合这两种模型进行分级组合筛选，充分发挥两种模型各自的长处，形成了细胞周期抑制、细胞凋亡诱导以及细胞毒等抗癌活性微生物菌株的简便快速且经济可行的组合筛选模式，大大缩小了复筛样本数目、减少了流式细胞术筛选的工作量、大幅度降低了成本，适用于大量菌株抗肿瘤活性的体外筛选。

本章从采自威海、福建、广东的１０个海泥样品中共分离得到放线菌２６２株，并利用组合筛选模式对这２６２株放线菌进行了活性筛选。