海洋石油污染生物修复的探讨

第29卷总第71期 西北民族大学学报(自然科学版)Vol.29,No.3 2008年9月 Journal of N orthw est U niversity for N ationalities(Natural Science)Sep,2008海洋石油污染生物修复的探讨杨　超(环境保护部华南环境保护科学研究所,广州510655)[摘　要]生物修复法治理海洋石油污染被认为是最经济、最彻底、最有效的恢复手段1通过海洋石油污染的来源、转化过程以及降解机理分析了海洋石油污染生物修复的影响因素1笔者认为,溢油生物修复的理论基础有待进一步完善,未来的生物修复技术应是多种方法的有机融合1[关键词]海洋石油污染;生物修复[中图分类号]X55 [文献标识码]A [文章编号]1009-2102(2008)03-0062-060前言目前,海洋石油污染的危害受到越来越广泛的关注和重视1据统计,每年通过各种渠道泄入海洋的石油和石油产品,约占全世界石油总产量的0.5%,倾注到海洋的石油量达200万吨～1000万吨,由于航运而排入海洋的石油污染物达160万吨～200万吨,其中1/3左右是油轮在海上发生事故导致石油泄漏造成的1我国海上各种溢油事故每年约发生500起,沿海地区海水含油量已超过国家规定的海水水质标准的2倍～8倍,海洋石油污染十分严重[1]1为减轻海洋石油污染和保护海洋环境,除了要加强对海洋石油开采和海上运输的管理外,还要不断加强对海洋石油污染的治理,人工治理石油污染有物理、化学和生物的方法1物理方法如围油栏、吸油船和吸着材料等1化学方法如消油剂、凝油剂等1用物理方法消油,很难去除海表面油膜和水中溶解油1而用消油剂实际上是向海洋中加入人工合成化学污染物1用细菌可以清除海表面油膜和分解海水中溶解的石油烃,同时具有化学方法所不可比拟的优点1微生物的石油降解能力是对石油污染进行生物修复的生物学基础,直接决定生物修复的效率,被认为是解决石油污染的根本方法11　生物降解机理美国亚持兰大大学发现某些酵母菌株天然存在于被石油污染的水中,其数量随油污染范围的扩大而增多,这表明它们是靠“吃”石油而繁殖的1海洋微生物在完成海洋物质转化和元素循环中起着重大的作用1海洋石油降解细菌就是通过氧化环境中的油污来完成碳素循环,消除石油污染1石油是链烷烃、环烷烃、芳香烃以及少量非烃化合物的复杂混合物1石油的生物降解因其所含烃分子的类型和大小而异1链长度中等(C10～C24)的链烷最易降解,短链烷对许多微生物都有毒,不过它们通常很快从油中蒸发1很长的链烷对生物的抗性增强1从烃分子类型看,链烃比环烃易降解;不饱和烃比饱和烃易降解;直链烃比支链烃易降解,支链烷基愈多,微生物愈难降解,链末端有季碳原子时特别顽固;多环芳烃很难降解或不降解1其降解机理主要有以下几个方面: 微生物攻击链烷烃的末端甲基,氧化酶催化生成伯醇,再进一步氧化为醛和脂肪酸,脂肪酸接着通过β-氧化进一步代谢1有些微生物攻击链烷的次末端,在链内的碳原子上插入氧1生成仲醇后进一步氧化,生成酮,酮再代谢为酯,酯键裂解生成伯醇和脂肪酸1醇接着继续氧化成醛、羧酸,羧酸则通过β-氧化进一步代谢1不具备末端甲基的环烷烃由类似于上述次末端氧化的机制进行生物降解1[收稿日期]2008-08-20[作者简介]杨超(1978—),女,宁夏银川人,主要从事给排水及环境研究1芳香烃由加氧酶氧化而邻位或间位开环1邻位开环生成己二烯二酸,再氧化为β-酮己二酸,后者再氧化为三羧酸循环的中间产物琥珀酸和乙酰辅酶A1间位开环生成2-羟己二烯半醛酸,进一步代谢生成甲酸、乙醛和丙酮酸1多环芳烃的生物降解,先是一个环二羟基化、开环,进一步降解为丙酮酸和CO2,然后第二个环以同样方式分解12　生物修复石油污染的影响因素石油烃生物降解的程度取决于油的化学组成、微生物的种类和数量以及环境参数,如温度、营养盐、陆源污染物、盐度、海流、氧含量等[2]12.1　石油的理化性质在石油类的生物降解过程中,微生物生活于水相中而作用于油水界面,所以烃类的可溶性直接影响其微生物的降解率1当浓度非常低时,烃类是可溶的,但是大多数溢出的原油远远超过其可溶限度1另外,扩散的程度也部分决定了可被微生物菌群利用的石油表面积1石油化学组分不同也明显地影响它们被降解的速率1在各组分中,饱和烃最容易降解,其次是低分子量的芳香族烃类化合物,高分子量的芳香族烃类化合物、树脂和沥青质则极难降解1相同条件下微生物对不同种类石油烃的降解能力是不同的,一般认为不同烃类微生物可降解性次序如下:小于C10的直链烷烃>C10～C24或更长的直链烷烃>小于C10的支链烷烃>C10～C24或更长的支链烷烃>单环芳烃>多环芳烃>杂环芳烃1Chaineau等用微生物处理被石油污染的土壤时,270d后发现75%的原油被降解,饱和烃中的正构烷烃和支链烷烃在16d内几乎全部降解,22%的环烷烃未被降解,沥青质完全保留了下来12.2　微生物种类石油降解微生物的种类和数量对海洋中石油烃的降解有明显影响1不同微生物种类对石油烃的降解能力差别较大,同一菌株对不同烃类的利用能力也有较大的差别,一般情况下,混合培养的微生物对石油烃的降解比纯培养快1石油污染能够诱导降解石油的微生物种群的生长,未受到石油污染地区的石油降解菌不到0.1%,但在受污染地区的石油降解菌的比例和数量明显上升,污染程度越重细菌数量越多,说明石油污染能够使石油降解菌发生富集[3]12.3　环境参数2.3.1　温度　温度能明显影响烃类的降解速率1温度对烃类氧化菌降解石油的影响包括两个方面:一方面是温度直接影响细菌的生长、繁殖和代谢;另一方面温度能影响石油在海洋中的理化性质1提高温度,可促进石油中一些对细菌有害烃类的挥发,同时也可增加石油的乳化程度,因而有利于细菌对油类的降解1故环境中的每一种微生物都只能在一定的温度范围内生长,有其生长繁殖的最适温度、最低温度、最高温度和致死温度1烃类生物降解速率通常随温度的降低而减弱,这主要是由于酶活力的降低1在高温下,由于酶活力增加,降解速率加快1曹微寰等从晴纶废水中分离、筛选出两株降解正烷烃的高效菌株C21421和C21422(诺卡氏菌),研究了温度对菌株生长的影响,结果表明温度对菌株的生长有较大影响,两菌株最适的生长温度为35℃12.3.2　营养盐　在海洋石油的生物降解过程中,由于石油中含有微生物能利用的大量碳源,海水和海滩中有足够的微量元素,所以N和P成为主要的限制因子[4]1Stephen R.Hutchins等通过向含苯、甲苯、乙苯和航空燃油等石油烃的污水中添加N源促进生物修复的研究,使降解率达到66%1营养物质缺乏就会抑制微生物对石油的降解1但是营养物质的添加并非越多越好,只有在一定的范围内才有促进作用1Sjmc Milen等研究原油在土壤中泄漏后生物降解能力时,发现当添加肥料的C∶N∶P=100∶5∶1.7,并为缓慢释放的形式时,效果最佳1Oudot J等在法国Brest海湾做了一个添加缓释肥料对原油污染地的石油污染进行生物降解的试验,结果表明,如果底物中含N≥100μmol/L,则生物修复所需的营养充足,无需再添加营养物质1如果营养物质的浓度含量很高,则只能促进N的循环和硝化细菌的活性,对石油降解的促进作用很小12.3.3　氧气　尽管一些学者实验证明在厌氧条件下微生物也能降解烃类,但在大多数情况下,厌氧时烃类的生物降解作用要比好氧条件下慢得多1石油中各组分完全生物氧化,需消耗大量的氧1据测算1g石油被微生物矿化需3～4g 氧,即需消耗2.1L以上的氧1所以,在石油严重污染的海域,氧可能成为石油降解的限制因子1 Johnston测定了含有科威特原油的沙柱中氧的消耗,在4个月的降解中,氧的平均消耗速率为0.45g/(m2・d),对应于油的降解率为90mg/(m2・d);在有氧条件下二氧化碳的产生速率比在无氧条件下高几个数量级1由此可见氧对石油微生物降解的重要作用12.3.4　陆源污染物　陆源污染物对海洋石油烃的降解也有影响1在美国Brittany海岸石油泄露研究中发现,该地区石油烃的生物降解速度比其他地区要快,其原因是大量农村用氮肥和磷肥进入Brittany海域,为降解微生物提供了丰富的营养物质1农药则对河口环境中微生物降解石油有抑制作用12.3.5　盐含量　Rhykerd RL研究发现,向不同性质的土壤中添加不同量的NaCl后,生物降解速度会改变,过量的NaCl 会延缓生物降解1金文标等通过盐的浓度对石油污染土壤生物治理影响的研究,发现土壤中油的生物降解率随盐含量的增大而减小1因此,盐度对石油的微生物降解有一定的影响13　生物修复海洋石油污染的优点20世纪80年代末美国在Exxon Vadez油轮石油泄露的生物修复项目中,短时间内清除了污染,治理了环境,是生物修复成功应用的开端,同时也开创了生物修复在治理海洋污染中的应用1常用的修复方法有物理修复、化学修复和生物修复1与化学、物理方法相比,生物修复对人和环境造成的影响小,且修复费用仅为传统物理、化学修复的30%～50%[5]1目前常用的“油船吸油法”中普遍存在着速度慢、效率低的问题,吸油率一般不到40%,且分层速度慢,若溢油出现乳化现象则分层时间更长或很难分层1投放分散剂来处理没有回收的石油会造成二次污染,用沉降法处理溢油同样会污染海底生物,此方法在一些国家已经禁止使用1而用细菌或酵母菌可清除海表面油膜和分解海水中溶解的石油烃,费用低、效率高、安全性好,而且能处理的污染物阈值低、残留少,被认为是最可行、最有效的方法14　目前主要研究及应用近20多年来,国外不少学者在不同环境中对石油降解细菌生态学进行了大量的调查研究,在此基础上以实验室内模拟现场条件,建立了降解过程中水动力学模型,探讨其氧化条件、氧化能力、氧化速度、氧化机理和氧化产物及其相互间关系1我国自20世纪70年代也有不少这方面的工作报道1按照研究的阶段和水平不同,本文从筛选能够氧化石油烃的细菌菌株,加速其消除油污的生态环境条件,通过添加营养盐,加速细菌繁殖以提高清油速率等方面进行论述14.1　自然微生物的筛选石油降解微生物的筛选工作较多,如丁明宇[6]等从青岛附近海域分离了几十株石油降解菌,并对其石油降解特性进行研究,并发现了具有较强降解石油能力的微生物1部分菌能很好地利用所测试的短链烷烃(正己烷)或芳香烃(荼,二甲荼);多数测试菌在2天后即开始表现出一定的降解能力1有的真菌在生长过程中,其菌丝有时会与石油聚集成致密的茵丝油团,使其在利用生物法清除海上石油中具有独特的优越性,并且在没有添加营养盐的新鲜海水中,部分测试菌仍表现出较好的降解能力1张景来等[7]从被大庆油田污染的土壤中分离到两株原油降解菌,在模拟海水的情况下,对原油降解菌的降解特性进行研究1发现这两株原油降解菌适应力很强,菌株(SY1和SY2)在贫营养条件下对原油的生物降解率分别达到41.3%和42.6%1在贫营养条件下以正十四烷、环己烷、苯和二甲苯为惟一碳源配制降解液,降解后测定培养液的OD600值,结果如表1所示. 由表1可知菌株(SY1和SY2)能够降解正十四烷、环己烷、苯和二甲苯,且具有较宽的底物利用范围.图1表明,较适合菌株SY1和SY2生长的盐的质量浓度为15～30g/L,其中SY1为25.0g/L,SY2为20.0g/L1同时还可以看出,即使在NaCl的质量浓度达到35.0g/L时,SY1和SY2的生物降解率仍达到30%以上,表明分离得到的菌种有较好的耐盐性1实际海水中盐的质量浓度为25.6～27.2g/L,因此菌株完全可以满足实际使用要求1图2表明菌株SY1和SY2降解原油较适的p H值范围是7.0～9.01当p H值不在此范围时,生物降解率迅速降低1这是因为随着p H值的变化,酶分子上的酸性及碱性氨基酸侧链基团处于不同的解离状态,具有催化活性的基团在总酶量中的比例不同,使得酶分子的催化能力也不一样1当p H值在各自较适p H值范围时,总酶量中活性基团比例大,酶分子催化能力强,细菌对原油的降解能力也强1由于实际海水的p H 值在7.6～8.5,因此筛选到的菌株可以用于实际治理中1图2　p H 对菌株降解效果的影响 图3　温度对菌株降解效果的影响图3表明,菌株SY 1和SY 2的适宜降解温度是15℃～40℃,在此范围内生物降解率较高,菌株SY 1以30℃效果最佳,菌株SY 2以25℃降解率最高1即温度较低时随着温度的升高降解率升高,当温度达到一定值后随着温度的升高而降低1综上所述,实际海水的盐含量、p H 值和温度能够满足SY 1和SY 2的降解需求,在海洋石油污染生物治理中具有良好的应用前景14.2　微生物增殖据报道,英国已于20世纪90年代首次在不用拦油栅和化学药剂的情况下,用添加细菌混合培养物和N 、P 营养盐的方法,成功地进行了海上消除油膜的试验,这种细菌能在2h 内将石油分子变成脂酸乳状液,且不影响水的有机体1美国已利用此技术成功地消除了得克萨斯州海岸的一次油污染1为了有效清除海上溢油,用于海上细菌除油的“肥料”应具备的特性:1)必须浮于水面,在水中不易溶解;2)要有大的比表面积,以便“肥料”能均匀释放;3)不造成二次污染,其外包装也能被细菌降解;4)要有足够的营养盐,减少投入量等1常用的营养盐有两大类:一类是水溶性的,一类是亲油性的1在溢油现场,由于受潮汐、波浪的影响,水溶性营养盐极易被冲刷掉,因而人们开发出了能缓慢释放的肥料1亲油性营养盐可以溶解于油相中,能在油—砂界面上存留1由于降解石油的微生物往往粘附在砂的表面,该肥料能够有效地为其提供N 、P 营养,促进微生物的生长及代谢11989年,Exxon 公司的Valdez 号油轮在阿拉斯加的Willam 王子湾触礁,泄露出3.55万t 原油,污染了1750km 的海岸线1Exxon 公司和美国环保局(EPA )的科学家采用亲油性肥料Inipol EAP 22清除沙滩表面鹅卵石上粘附的油污,采用胶囊状的缓释肥料Customblen 清除滩体下部的石油1泄露事故发生后16个月的定量分析表明,60%～70%的石油被降解,并且未对环境产生负面影响[8]14.3　混合微生物的使用图4　单一菌种与混合菌比较实验一般来说,一种细菌仅能降解一种或少数几种石油烃,或石油烃降解的几个步骤1而原油和其炼制油所含的石油烃种类甚为复杂,不同来源的原油其石油烃的组成也有较大的差异,所以将不同的菌混合培养有助于提高石油的总体降解率1日本海洋生物技术研究所用4种细菌的混合培养物处理海上溢油,取得良好效果1丁明宇等[6]任选5种降解菌(S J227B ,S J225w2,S J22,F237,F238),比较了该5种菌混合培养时与纯菌株培养时的石油降解情况1结果如图4所示,表明将几种不同的降解菌混合培养有助于加快降解速率和提高降解率.采用细菌混合培养物来处理海上油污染,因油的种类不同、来源不同,其石油烃的组分有较大的差异1因此关于细菌的种类合理搭配等问题,在实际应用上有不少困难14.4　投加表面活性剂,增加石油与海水中微生物的接触面积表面活性剂是集亲水基和疏水基结构于同一分子内部的两亲化合物,能将油乳化并分散至水体中.由于微生物只能生长在水溶性的环境中,溶解的石油烃更容易被降解;然而很多石油烃是不可溶的,以油珠或油滴的形式存在1通过添加表面活性剂,可以使油形成很微小的油颗粒,增加与O2和微生物接触的机会,从而促进油的生物降解[9]1 Churchill等人研究了3种非离子型表面活性剂和亲油性肥料Inipol EAP22对菲生物降解速率的影响1结果显示, Inipol EAP22能促进菲在水溶液中的分散,并能显著提高菲的生物降解速率1他们认为,Inipol EAP22之所以在Exxon 公司Valdez号溢油的生物修复中表现出色,除了因为它含有微生物所需的N、P营养外,其配方中的表面活性剂成分功不可没,Inipol EAP22的结构组成如表2所示1目前,几乎所有的表面活性剂都是以石油为原料经化学合成而来1化学合成的表面活性剂在生产和使用过程中常常会出现严重的环境污染问题1在1967年的“托雷峡谷号”漏油事件中,技术人员为分散大量溢油,使用了约10000t 的化学分散剂,大部分的溶剂虽在几天内即已挥发,但当时以芳香烃为基础的分散剂却将浮油乳化,并残留在海面上达数星期之久,对环境的负面作用甚大[10]1近些年来,人们尝试利用微生物产生的表面活性剂加速石油降解1生物表面活性剂是用生物方法合成的表面活性剂,是微生物在一定条件下培养时,在其代谢过程中分泌产生的一些具有一定表(界)面活性的代谢产物,可以增强非极性底物的乳化作用和溶解作用,从而促进微生物在非极性底物中的生长.Harvey等使用铜绿假单胞菌SB30产生的糖脂类表面活性剂,在不同的条件下(活性剂浓度、接触时间、冲洗浓度),测定了砾石样品中石油的降解情况1结果表明,温度在30℃以上时,比起只加水的对照组,这种微生物表面活性剂使细菌利用石油的能力提高了2～3倍[11]1可以预见,在溢油现场使用生物表面活性剂来促进生物降解,极具发展潜力1表2　Inipol EAP22的化学组成组成化学方程式功能Oleix acid CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH Tris(laureth)phosphate C12H25PO4Hydrophoric phase Phosphorous source surfactants22Butoxy212ethanol HO2C2H42O2C4H9cosurfactants:乳化稳定尿素NH22CO2NH2氮源水H2O溶剂5　研究与展望石油烃类化合物的微生物降解是一个复杂的过程,它的效率和质量取决于石油烃类化合物存在的数量及状态,周围的环境条件以及微生物群落的组成1微生物对石油的降解受环境因素的影响很大,水体环境中降解主要受营养成分(如N和P)、盐度和氧气的限制15.1　在缺氧条件下对石油污染的厌氧代谢当前,生物修复法治理地表石油被认为是最经济、最彻底、最有效的恢复手段,但是生物修复法对稠油污染物,特别是稠油中胶质、沥青质等组分并不是合适的处理方法[12]1即使石油烃在进行好氧代谢,添加的有机肥料有时也会导致出现缺氧区1虽然石油烃的厌氧降解速率比好氧降解速率要慢,但是在厌氧状态下,烷烃和多环芳烃均发生了降解,此外在好氧条件下通常较难降解的姥鲛烷和植烷也发生了降解1另外,还有人分离出了在缺氧条件下能降解简单芳香烃和脂肪烃的反硝化菌及硫、铁、锰的还原菌1较复杂的芳香烃(如多环芳烃)的降解也已得到证实1因此烃的厌氧代谢将是以后研究的一个突破点15.2　接种基因工程菌在修复环境中接种的外源微生物可能面临多重压力:一是土著微生物的竞争作用;二是环境中生态因子的适宜性;三是被修复环境中污染物的环境毒性1由于这几方面的压力,使接种的外源微生物的存活率很低或者活性较弱,限制了它的实际应用1事实上,在实施接种的现场生物修复处理中,似乎只有1990年在墨西哥湾和1991年在德克萨斯海岸获得了成功1由于现代生物技术的发展,将降解多种污染物的降解基因转到一种微生物细胞中,使其具有广谱降解能力已经成为可能1不少学者设想培养一种能降解各种类型石油烃的特殊细菌1这个设想,经美籍印度科学家Chakrabat y等人的努力,已使设想逐渐变成现实11976年,Chakrabaty和其同事首次将3个烃类降解质粒转移到一个铜绿假单胞菌(P.areugi2 nosa)中,培育出含有多降解质粒的“超级细菌”1虽然该细茵遗传稳定性较差,在细菌繁殖过程中质粒容易丢失,尚难以在实际应用中发挥其作用,但已是利用细菌消除油污染技术的一个里程碑1有人采用生物技术以铜绿假单胞菌(Pseudomonas.aeruginosa)作为受体,将恶臭假单胞菌(P.putida)等携带的各种质粒转入其中,构成了带有多种质粒的“超级嗜油工程菌”,用于海上溢油处理,其清除油污的能力比天然微生物高上万倍.研究人员发现海洋中的假单胞菌有8种降解石油的质粒:美国通用电气公司通过重组DNA技术构建同时含有4种质粒的“超级菌”,降解石油烃类的能力比野生菌高几十倍到几百倍,降解同样面积海上石油,野生菌需要1年以上,而“超级菌”则只需几小时[13]1但是由于欧美等国家对基因工程菌的利用有严格的立法控制,迄今还未见到在油污染海洋生物修复中实际应用的报道15.3　丝状真菌丝状真菌是海洋中常见的微生物,许多丝状真菌在净化海洋石油污染物的过程中起重要作用[14]1丝状真菌的菌丝体在污染海域能提供较大的接触石油烃的面积,其孢子比革兰氏阴性细菌更能适应不良环境,如紫外线辐射、低营养、低p H等,且易于保存及易于制成微生物制剂在污染现场使用等1陈碧娥,刘祖同等[15]研究从湄洲湾海域分离的4株丝状真菌MF1、MF2、MF3、MF4的生长特性及去除油污的过程.结果表明,丝状真菌去除原油的过程与一般生物降解作用显然不同,是生物吸咐与生物降解相结合的生物转化过程1霉菌孢子接入摇瓶24h后萌发为菌丝,48h后菌丝大量生成,并与原来漂浮在培养基表面的原油吸咐在一起,粘贴在瓶壁上,然后渐渐形成菌丝球(<2～3mm)分散到溶液中1霉菌对原油不产生乳化作用,培养液的浊度无明显改变1真菌的这一特性在石油生物降解中具有优越性,因为在生物降解后,可再通过机械法将菌丝和石油同时去除,从而获得更好的去除石油的效果1参考文献:[1]闫峰.海洋石油污染的人文思考[J].中学地理教学参考,2002,(10):211[2]李永祺,丁美丽.海洋污染生物学[M].北京:海洋出版社,1991.[3]沈德中.污染环境的生物修复[M].北京:化学工业出版社,2002.[4]宋志文,夏文香,曹军.海洋石油污染物的微生物降解与生物修复[J].生态学杂志,2004,23(3):99-102.[5]HICKS B N,CAPLAN J A.Bioremediation:A natural solution[J].Pollution Engineering,1993,25(2):30-33.[6]丁明宇,黄健,李永祺.海洋微生物降解石油的研究[J].环境科学学报,2001,21(1):84-8.[7]张景来,李正要,汪莉,宋存义.海水中原油生物的降解[J].北京科技大学学报,2003,25(5):410-413.[8]夏文香,郑西来,李金成,宋志文.海滩石油污染的生物修复[J].海洋环境科学,2003,22(3):74-791[9]FOU GHT J M,GU TN IK D L,WESTLA KE D W S.E ffect of emulsion on biodegradation of crude oil in pure and mixedcultures[J].Appl Environ Microbiol,1989,55:36242.[10]National Research ing Oil Spill Dispersants on the Sea[M].[S1l1]:The National Academic Press,1989.[11]沈德中.污染环境的生物修复[M].北京:化学工业出版社,2002.268-279.[12]张亚学,耿安松,廖泽文.地表稠油污染物地球化学研究现状[J].矿物岩石地球化学通报(综述),2004,23(2):155-159.[13]张青田.生物技术在海上溢油处理中的应用[J].海洋信息,2005,2:14-16.[14]金志刚,张彤等.污染物生物降解[M].上海:华东理工大学出版社,1997.15-21.[15]陈碧娥,郭厚宝,苏荣西,苏锦波.湄洲湾天然菌群对石油烃的降解作用[J].华侨大学学报(自然科学版),2000,21(2):182-186.。