医疗器械产品无菌检验操作规程
1目的
通过无菌检验，确保灭菌后产品能够达到无菌的要求。
2适用范围
适用于灭菌后医疗器械产品（列举）的无菌检验。
3检验依据
本厂产品注册标准（编号）
EN1174-1996 医疗器械灭菌产品中微生物数量的评估
《中国药典》（2005 年版）
医用输液、输血、注射器具检验方法第二部分：生物试验方法
GB15980-1995 一次性使用医疗用品卫生标准
4仪器、设备
百级层流超净工作台、电热干燥箱、电热恒温培养箱、霉菌培养箱、压力蒸汽灭菌器、集菌仪（器）、电子
天平、 PH计、冰箱、恒温水浴锅、酒精灯、三角烧瓶，接种环、无菌棉签、镊子，试管架，大试管若干等。
5无菌检验室的环境要求
无菌检验应在环境洁净度10000 级下的局部百级的单向流空气区域内进行。
缓冲区与外界环境、无菌检验室与缓冲区之间空气应保持正压，阳性对照室与缓冲区之间空气应保持负压。
无菌检验室与室外大气之间静压差应大于10Pa。无菌检验室的室温应保持18～26℃，相对湿度：45～ 65%。
无菌检验室的单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降
菌的测试方法》的现行国家标准进行悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的监测。每年至少检测一次。
无菌检验过程中应同时检查超净工作台单向流空气中的菌落数：每次操作时在层流空气所及台面的左中右
置 3 个营养琼脂平板，暴露30min ，于 30～35℃培养 48 小时，菌落数平均应不超过1CFU/平板。
6无菌检验前的准备
器具灭菌、消毒
6.1.1灭菌：试验过程中与供试品接触的所有器具必须采用可靠方法灭菌。可经电热干燥箱160℃以上干烤2 小时，或置压力蒸汽灭菌器内121℃蒸汽灭菌30 分钟后使用（根据灭菌效果验证决定灭菌参数）。所有的灭菌物品不应超过 2 周即用毕，否则应重新灭菌。
6.1.2消毒：凡检验中使用的器材无法灭菌处理的，使用前必须经消毒处理。如无菌检验室的试管架、电子天平、工作台面、工作人员的手、橡胶吸头等。可采用消毒剂浸泡或擦拭。消毒剂应每月更换，以防止产生耐药
菌株。
6.1.3标识：器具的灭菌、消毒后必须做好标识，标明灭菌、消毒时间和使用有效期。
人员、物料进入无菌检验室
6.2.1 开启紫外线灯或臭氧发生器进行空间灭菌处理，消毒时间不得少于30min。
6.2.2 物料进入无菌检验室流程
6.2.2.1 脱包：进入无菌检验室的物品若有双重包装的，需将外包装在传递窗 / 缓冲间拆除后，传入试验室。
6.2.2.2 消毒：进入无菌操作室的所有培养基、供试品等的外表都应采用适用的方法进行消毒处理，以避免将外包装污染的微生物带入无菌检验室。
6.2.2.3传递：查看所有进入无菌检验室的器具上的灭菌、消毒标识，是否在有效期内。符合要求的经传递窗传入无菌检验室。
6.2.3人员进入无菌检验室流程
6.2.3.1更鞋脱衣：在一更区脱去一般区工作鞋，穿上无菌检验室工作鞋；脱去一般区工作服。
6.2.3.2洗手：首先用肥皂或洗手液在手上揉擦出泡沫，再用流水连续冲洗20 秒，洗净泡沫。
6.2.3.3更衣：在二更区按照从上到下的顺序穿戴无菌工作服（包括衣、帽、口罩等），要求裤子掖在上衣
里，口罩掩住口鼻，帽子包裹所有头发。
6.2.3.4手消毒：用消毒液浸泡双手 5 秒以上或用浸过消毒液的棉球擦拭双手。消毒液可用洗必泰、新洁尔灭、碘伏、 75%酒精等。
6.2.3.5人员进入：经缓冲间进入无菌检验室。
6.2.4人员进入无菌检验室后，进一步用消毒液擦拭工作台面，戴无菌手套。
7无菌检验操作要求
全过程必须严格执行无菌操作，防止微生物污染。
使用玻璃器皿应轻取轻放，避免破损，以防培养物扩散。
所有操作均应在近火焰区进行，且不得有大幅度或快速动作，以免搅动空气中的尘埃微粒。
使用金属接种器具时，用前、用后均需灼烧灭菌。
在接种培养物时，动作应轻、准，防止培养物溅出，产生汽溶胶，造成污染。
操作过程中所有的带菌物品，用后均应作消毒、灭菌处理。可在检验过程中随用随时放入消毒液缸内浸泡
或消毒桶内，或在检验完成后经传递窗传至一般区，立即用压力蒸汽灭菌锅121℃灭菌 30 分钟。
8培养基制备
需气菌、厌气菌培养基（硫乙醇酸盐流体培养基）的制备
8.1.1所用试剂
酪胨（胰酶水解）15.0g 葡萄糖 5.0g
L- 胱氨酸 0.5g
硫乙醇酸钠0.5g
（或硫乙醇酸）（）
酵母浸出粉 5.0g
氯化钠 2.5g
新配制的 %刃天青溶液
琼脂 0.75g
水1000ml
8.1.2制备
除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH 为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖
和刃天青溶液，摇匀，调节pH 为±。
8.1.3硫乙醇酸盐流体培养剂氧化层的颜色要求
在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5 ，否刚需经 100℃水浴加热到粉红色
消失（不超过20 分钟）迅速冷却，只限加热一次，并应防止被污染。
霉菌培养基（改良马丁培养基）的制备
8.2.1所用试剂
胨5.0g
酵母浸出粉 2.0g
葡萄糖 20.0g
磷酸二氢钾 1.0g
硫酸镁 0.5g
水1000 ml
8.2.2 制备
除葡萄糖外，取上述成分混和，微温溶解，调节pH 值约为，煮沸，加葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调
节pH 为±。
还可使用按处方生产的符合规定的脱水培养基，按照使用说明书配制。
培养基配制后应尽快灭菌，避免微生物繁殖。一般采用高压蒸汽121℃灭菌 30 分钟。
制备好的培养基应在2～25℃保存，在 3 周内使用。
培养基的无菌性检查
每批配制的培养基均应进行无菌性检查（可与产品无菌检验同步进行）。检查时，每批培养基随机取
不少于 5 支（瓶）培养14 天，应无菌生长。
9稀释液、冲洗液的制备
%蛋白胨水溶液
30 分钟后，
取蛋白胨 1.0g ，加水 1000ml，微温溶解，滤清，分装后置入压力蒸汽灭菌器内，121 ℃灭菌
于 4℃保存备用。 ,分装后置入压力蒸汽灭菌器内，121℃灭菌 30 分钟后，于4℃保存备用氯化钠 - 蛋白胨缓冲液
取磷酸二氢钾 3.56g 、磷酸氢二钾7.23g 、氯化钠 4.30g 、蛋白胨 1.0g ，加水
1000ml 。微温溶解，滤清，分装后置入压力蒸汽灭菌器内，121℃灭菌 30 分钟后，于4℃保存备用。
浸提介质： 9g/L 无菌氯化钠溶液，可直接从有证单位采购大输液。
10 对照菌液制备
无菌检验所用的菌株传代次数不得超过 5 代。
取金黄色葡萄球的普通琼脂斜面培养物，接种一白金耳至营养琼脂培养基内，在 30～35℃培养18～24h 后备用，同时制备%氯化钠溶液加入在 6 支小试管内，每支试管内加的%氯化钠溶液，在压力锅内经121℃灭菌30min 备用。将已配好的金黄色葡萄球菌培养菌液取加入第一支小试管内，稀释成浓度1:10 的菌液；取第一支试管内 1.0m l 菌液加入第二支小试管内，稀释成浓度1:100 的菌液，同法稀释成浓度1:10 6（每ml 含菌量≤ 100CFU）即可。
采用平皿计数法测定活菌数。
11 无菌检验培养温度
