荧光定量PCR操作流程

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；. 实时荧光定量PCR

组织RNA提取：

一般认为100mg肝组织提取RNA 500ng，100mg肺提取RNA 200ng，脑内的RNA丰度适中，100mg脑组织，提取RNA 5-200ng。所以一个10mg的海马可匀出RNA约为20ng。

反转录反应

反转录反应参照TaKaRa RT-PCR说明书。

反转录反应条件如下。

37°C 15 min（反转录反应）

85°C 5 sec（反转录酶的失活反应）

Real Time PCR反应

选用脑源神经营养因子（BDNF）为目标基因，核糖体18S rRNA(18S rRNA)做为内参。

基因 引物序列 扩增片段长度

NR2B NR2B(+) CCGCAGCACTATTGAGAACA 213 bp

NR2B(–) ATCCATGTGTAGCCGTAGCC

18s rRNA 18s rRNA(+) TTTGTTGGTTTTCGGAACTGA 198 bp

18s rRNA(–) CGTTTATGGTCGGAACTACGA

1） 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。

试剂 使用量 终浓度

SYBR® Premix Ex TaqTM（2×） 12.5 μl 1×

PCR Forward Primer（10 μM） 1 μl 0.4 μM

PCR Reverse Primer（10 μM） 1 μl 0.4 μM

模板（cDNA溶液） 0.5 μl

dH2O 10 μl

Total 25 μl .

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全班40人，分为5组，每组做8管。4管做BDNF，4管做18S rRNA。4管BDNF或者18S rRNA，采用相应的正反PCR引物。每种基因做两个模板，一个模板采用原液浓度，一个模板采用稀释一倍浓度，体积均为0.5 μl。

2）三步法PCR

首先95°C 作用3 min。

PCR进行35个循环。

实时荧光定量PCR方法简介

一． 实时荧光定量PCR的基本原理

理论上，PCR过程是按照2n（n代表PCR循环的次数）指数的方式进行模板的扩增。但在实际的PCR反应过程中，随着反应的进行由于体系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线性的方式增长进入平台期。因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性。如采用常规的终点检测法（利用EB染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量），即使起始模板量相同经PCR扩增、EB染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。

为了能准确判断样品中某基因转录产物（mRNA）的起始拷贝数，实时荧光定量PCR采用新的参数——Ct值，定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。

Ct值是如何得到的

在实时荧光定量PCR的过程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行，定量PCR仪全程采集荧光信号，实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。

Ct值的定义

Ct值中的“C”代表Cycle（循环），“t”代表检测threshhold（阈值），其含义是PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数；也可以理解为扩增曲线与阈值线交点所对应的横坐标。

Ct值与样品中模板的对应关系

Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系（y=ax+b，x代表起始模板拷贝数的对数，y代表Ct值）。

与终点法相比利用Ct值的优势

由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数，该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响，因此利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确，重复性也更好。传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量，这种方法的精确度不高、重复性也不好。

下图中是96个复孔的实时扩增曲线（完全相同的反应体系、相同的反应protocol、相同的样品起始浓度），可以看到Ct值具有很好的重复性，而终点的荧光信号强度差异达到300个单位。

荧光定量pcr操作流程

荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种常用的分子生物学技术。它可以有效地扩增DNA片段，具有极高的精确度，广泛应用于分子生物学、遗传学和病原学等领域。本文将介绍荧光定量PCR的操作流程。

首先，要准备所需的试剂和仪器。PCR反应所需的试剂包括DNA模板、双链引物、PCR酶、dNTPs等，而仪器则包括PCR微量热循环仪、荧光检测仪等。

其次，将所需试剂按一定比例配置，并分装到PCR微量热循环仪的反应液体中。然后，将液体加到PCR微量热循环仪的反应槽中，设定温度及时间，以完成PCR扩增反应。

最后，将扩增产物稀释，用荧光检测仪进行定量检测，并计算扩增倍数，从而完成荧光定量PCR的操作步骤。

总之，荧光定量PCR技术是一种常用的分子生物学技术。它可以有效地扩增DNA片段，有助于深入探究DNA序列，从而为分子生物学、遗传学和病原学等领域的研究发现提供重要线索。完成荧光定量PCR操作的步骤包括准备试剂和仪器、配置反应液体、PCR扩增反应、定量检测和计算扩增倍数等。

荧光定量PCR实验中的策略及注意事项

前一段时间在百度中搜索，发现多年前写的一个关于荧光定量PCR技术的PPT有很多人看过或引用过，后来又听见一些认识的人也说，近来也就觉得自己对社会有点看得见的贡献了。考虑到自己作为荧光定量PCR仪的技术支持人员已经工作了五年了，做的实验以及解决的问题远比五年前多了，因此利用过年的时间，写点荧光定量PCR实验中的一些注意事项及感想，无论对错，都是希望对相关的人员有些参考价值。

荧光定量PCR原理等大家都已经很熟了，我就不细说了，主要是写一些有人问过的事，希望写的内容是大家都关心的。

普通PCR与荧光定量PCR技术区别？

简单的讲PCR技术最早是用于扩增一段特异的PCR片段，用于克隆、测序等实验，后来也将其用于样本中特异的PCR片段有无或非很粗的相对定量，而荧光定量PCR技术则是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量，是一种测定特异的PCR片段含量的方式。如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA的含量等。

前些年有人讲过普通PCR后，通过电泳也可以进行定量，其实是将PCR产物的定量与PCR样本中模板定量相混了。近两年没有人再讲这类的话了。

Sybr Green、Taqman、Molecular beacon、LUX这些方法如何选择？

从实验成本来讲，Sybr Green是最好的，基本上就是普通PCR加上一点Sybr Green I 荧光染料即可，其信号强度也很好，还可以进行融解曲线分析等，但缺点是只能在一个反应管内进行一种PCR反应的检测，另一个问题是非特异性扩增会影响实验结果，当然也有一些技术解决这些问题，后面会讲到。对于研究人员来讲，如果需要检测的基因很多，而每个反应管中进行一种PCR反应的检测可以满足实验要求，则Sybr Green是最好的选择。

如果需要进行多通道实验，即在一个反应管中进行2种或以上的反应，则要选择其他的方法，最常用的是Taqman、Molecular beacon，这两种都是探针的方式，由于增加了探针的特异性，因此其扩增曲线反映的就是特异性产物的扩增曲线，不含有非特异性扩增的成分。因此商业用途的检测试剂盒大都采用这一技术，以减少非特异性产物造成错误结论的可能性。其缺点在于探针成本较高，有时设计的探针并不合适，有造成损失的可能性。并且要进行较多的实验条件的优化。这两种探针技术用于商业目的时都有专利问题，据说取得Molecular