pcr引物原理

随机引物pcr原理

随机引物PCR是一种基于随机引物的聚合酶链反应（PCR）技术。PCR是一种在体外进行的DNA扩增技术，可以在短时间内从微量DNA样本中扩增出大量特定DNA片段。

随机引物PCR的原理是利用随机引物与DNA模板的互补碱基序列结合，在PCR反应中作为起始引物参与扩增反应。传统PCR使用特异性引物，而随机引物PCR使用长度为8-10个碱基的随机序列作为引物，可以扩增出各种长度和来源的DNA片段。

随机引物PCR的步骤如下：首先，将包含待扩增DNA片段的DNA模板与随机引物加入到PCR反应混合液中；然后，在一系列的PCR循环中，通过变温过程，随机引物与DNA模板进行退火和延伸，形成新的DNA链；最后，经过多轮PCR扩增，可以得到大量的目标DNA片段。

随机引物的使用使得随机引物PCR可以扩增各种来源的DNA片段，不依赖于特定DNA序列的已知信息，因此被广泛应用于DNA序列分析、基因组测序、基因差异表达等领域。它的独特性在于可以扩增出未知DNA序列和未知源的DNA片段，提供了一种快速、有效、高通量的PCR扩增方法。

PCR引物设计原则

1. 引物长度一般为15-30 bp，常用的为18-27 bp，（过长会导致延伸温度＞74 ℃，不利于Taq DNA聚合酶反应）。.

2. 引物GC含量一般为40 %-60 %，以45 %-55 %为宜。

3. 引物所对应的模板序列的Tm值最好在72 ℃左右，（至少在55-80 ℃之间）。

4. 引物3’端碱基一般不用A（易错误引发位点）。

5. 引物3’端出现3个以上连续碱基，如GGG/CCC，引发错误。

6. 引物3’端避免出现互补，二聚体或发夹结构。

7. 如扩增编码区域，引物3”端不要终止密码子（TAG,TAA,TGA）的第三位，（易发生简并）。

8. 引物5’端可以修饰，（常用来引进修饰位点或标记物）。

9. 碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续四个碱基的互补。

10. 引物的▲G值最好呈正弦曲线形状。

11. 引物应在核酸保守区内设计并具有特异性。

PCR引物设计

PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。 PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。

1.引物的特异性

引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。

2.避开产物的二级结构区

某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

3.长度

寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T+，Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性。

4.G+C含量

G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

5.碱基础随机分布

引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。

6.引物自身

引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。

设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡。设计引用有一些需要注意的基本原理：

① 引物长度

一般引物长度为18~30碱基。总的说来，决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度。有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。

在引物长度小于20bp时：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃

在引物长度大于20bp时：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃

另外有许多软件也可以对退火温度进行计算，其计算原理会各有不同，因此有时计算出的数值可能会有少量差距。为了优化PCR反应，使用确保退火温度不低于54℃的最短的引物可获得最好的效率和特异性。

总的说来，每增加一个核苷酸引物特异性提高4倍，这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。引物长度的上限并不很重要，主要与反应效率有关。由于熵的原因，引物越长，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小。

② GC含量

一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%，一对引物的GC含量和Tm值应该协调。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴。

③ 退火温度

退火温度需要比解链温度低5℃，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，是DNA双链结合。一对引物的退火温度相差4℃～6℃不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的，可以在55℃～75℃间变化。

④ 避免扩增模板的二级结构区域

选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计目的片段的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2’-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。