PCR引物设计原则

PCR引物设计原则

PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物

的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。

要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个

区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。

现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。

让我们先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。而且四种碱基的分布最好随机。不要

有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否则P1引物设计的就不合理。应重新寻找区域设计引物。

同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。

引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧

光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端

开始的。这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增

的特异性与效率。

综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则：

① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。

② 产物不能形成二级结构。

③ 引物长度一般在15~30碱基之间。

④ G+C含量在40%~60%之间。

⑤ 碱基要随机分布。

⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。

⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。

⑧ 引物5′端可以修饰。

⑨ 引物3′端不可修饰。

⑩ 引物3′端要避开密码子的第3位。

PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述，引物

的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成

功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。

1.引物的特异性

引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。

2.避开产物的二级结构区

某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。

用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△

G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP

对扩增的成功是有帮助的。

3.长度

寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T+，Ln值不能

大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性。

4.G+C含量

G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链

解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm

值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

5.碱基础随机分布

引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或

C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。

6.引物自身

引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间

位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。

7.引物之间 两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连

续碱基的同源性或互补性。

8.引物的3′端

引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR

（AS-PCR）反应中，引物3′端不能发生错配。

在标准PCR反应体系中，用2U Taq DNA聚合酶和800μmol/L dNTP（四种dNTP各200μmol/L）以质粒

（103拷贝）为模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1min的循环参数扩增HIV-1 gag基因区的条件下，

引物3′端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。A∶A错配使产量下降至1/20，A∶G和C∶C错七下降

至1/100。引物A：模板G与引物G：模板A错配对PCR影响是等同的。

9.引物的5′端

引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。

引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引

入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。

10.密码子的简并

如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异

性与效率。

寡核苷酸的优化设计

郑仲承

( 中国科学院上海生命科学院生物化学和细胞生物学研究所，上海 200031 )

在核酸分子杂交、DNA序列测定和通过PCR放大DNA片段等实验中，都需要使用寡核苷酸作为探针或引物，

而对这些反应的质量起最重要影响作用的，就是这些寡核苷酸探针或引物。用优化的寡核苷酸进行实验能

够很快得到好的结果，而用不够合适的寡核苷酸时，常常得出似是而非的结果，不仅大大增加了后续实验

的工作量，还可能一无所获。怎样优化设计寡核苷酸呢?至少有下列几个方面的问题需要考虑。

1. 估测可能形成的DNA或RNA双链的稳定性

寡核苷酸，无论是DNA的或者RNA的，都有形成双链结构的潜在可能性，正如下面反复提到的，这种结构

对寡核苷酸的作用有很大影响。所以，预测这种结构的稳定性对设计和优化寡核苷酸就很重要。在一个双链结构中，碱基对的相对稳定性是由其邻近碱基决定的。在热动力学中，这样的性质以双链形成时的自由

能(ΔG)来表示。现在，大多采用 Breslauer等人提出的，以最接近的相邻核苷酸的动力学数值(自由能)

来预测双链稳定性的方法。为简化起见，所有的计算都在25 ℃条件下进行。此时，最接近的相邻核苷酸

的自由能是：

此主题相关图片如下：

ΔG(kcal/mol)

例如，双链d(ACGG／CCGT)的ΔG是：

ΔG(ACGG)＝ΔG(AC)＋ΔG(CG)＋ΔG(GG)＝－(1.3＋3.6＋3.1)＝－8.0 kcal/mol

此计算方法特别适用于测定其3′末端会形成双链的引物的相容性。也可以用来计算发夹环结构的ΔG。不

过，这时需要根据环区内核苷酸的数量添加一定的数值。如3个核苷酸时为5.2 kcal/mol；4个时为4.5；

5个为4.4；6个是4.3；7和8个为4.1 kcal／mo1。

2. 选择引物的一般规则

设计和选择引物时有5个要素必需注意。

2.1 引物的3′末端不互补引物的3′末端一定不能有很大的互补性，因为它们的互补会形成引物二聚体，

这就会带来很大的问题，例如合成出非专一的产物，极大地减少所期望产物的得量。有实验表明，3′末端

双链的ΔG是0～－2 kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在

－6时只有40%，到－8时少于20%，而－10时，接近于0。虽然产量还取决于其他参数，如退火温度、引

物的专一性等等，但是用Taq聚合酶操作时，由于它的工作能力很强，能够在很短的时间内就识别3′末

端互补的双链区并发动聚合反应，即使3′末端双链的稳定性很差也不能阻碍它的作用，所以这时产量对

二聚体的形成就有很大的依赖性。

2.2 引物分子内不互补应当尽量不用会通过释放能量而形成分子内双链结构的寡核苷酸。虽然有些带有发

夹环，其ΔG为－3 kcal/mol的自身互补引物也可以得到不错的结果，但是如果它的3′末端被发夹环占

据时就很麻烦，即会引发引物内部的延伸反应，减少了参与正式反应引物的数量。当然，如果发夹环在5′

末端对反应就没有多大的影响了。

2.3 引物的组分、解链温度和长度普遍认为PCR引物应当有50%的GC/AT比率。其实，这是不对的。以人

基因组DNA为模板，用81% AT的引物可以产生单一的，专一的，长250 bp，含有70% AT的产物。完全没

有必要复杂地去计算产物和引物的解链温度，PCR引物的GC/AT比率应当等于或高于所要放大的模板的

GC/AT比。要知道，更重要的因素是模板与稳定性较小的引物之间解链温度的差异。差异越小，PCR的效率

越高。因为DNA的解链温度也取决于它的长度，所以有的研究者喜欢设计很长，而不求它很稳定的引物。

可是，引物太长就难以避免形成二聚体和自身互补，因此，一般还是不用为好。如果期待的产物长度等于或小于500 bp，选用短的(16～18 mer)的引物：若产物长5 kb，则用24 mer的引物。有人用20～23 mer

引物得到40 kb的产物。但是，引物较长时，如果不借助引物选择的计算机软件帮助，就很难确定一对引

物是否会形成二聚体，是否有自身互补性以及专一性如何。于是，用眼睛选出来的寡核苷酸放大长片段DNA

时就会使引物彼此引发而不是延伸模板，得出非专一产物。通过下述的观察内部稳定性原理可以极大地减

少这种问题。

2.4 引物的内部稳定性在DNA测序和PCR中最好用5′末端稳定(如GC含量较多)，而3′末端不太稳定(如

AT含量较多)的引物，这种引物的结构可以有效地消除假引发反应。这就是基于引物内部稳定性的经验之

谈。其3′末端稳定性低的引物在这些反应中能起好作用的原因在于，接近或在3′末端上的碱基与非靶位

点碱基所形成的配对的稳定程度还不足以引发DNA合成，所以不会产生假产物。因此，为了有效地引发反

应，引物的5′末端和中央部分必须与靶DNA也形成双链。与此相反，带有稳定的、GC丰富的3′末端的

寡核苷酸不需要其所有的核苷酸序列都与靶序列配对，只凭借其3′末端与靶序列任何位点的牢固配合就

可以引发反应，产生非专一产物。如果用3′末端低稳定性的引物，反应的最适退火温度范围会不寻常的

宽。这就可以不经过事先的最佳化实验就能在最佳条件下进行反应。还要注意的是PCR反应产物的质量还

取决于模板(底物的复杂性、Tm、产物长度)和退火的温度与时间。所以，有时3′末端稳定的引物也可以

满意地进行反应。但是，无论如何，寡核苷酸3′末端最后5个核苷酸的稳定性小于－9 kcal/mol的，通

常就是专一性的探针或引物。寡核苷酸3′末端越不稳定，假引发的可能性越低。

2.5 引物的唯一性为了放大单个的、专一性DNA片段，选用的引物序列就应当是唯一的，即在模板中没有

重复序列。虽然不会整个引物序列都偏好于和模板中的一个以上位点匹配，但是，通常见到的引物的3′

末端往往都有6～7个没有什么个性的核苷酸。如果假引发的位点正好在放大区的内部，那麻烦就大了。由

于短的DNA片段有更高的PCR或杂交效率，就容易产生非专一产物。如果用哺乳动物基因组序列作为模板，

可以用Alu序列或其他短重复元件来核对想用的引物的互补性。由此也可知，应当避免使用同寡聚物(如

—AAAAAA—)和二核苷酸重复(如—ATATAT—)。

3. 按照氨基酸序列设计寡核苷酸

按照多肽的氨基酸序列来设计 PCR引物或杂交探针是最常用的实验手段，尤其是在试图“钓取”一个蛋白