PCR扩增检测乙肝病毒培训课件

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PCR扩增检测乙肝病毒

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PCR技术上岗培训解析幻灯片课件

标准的PCR过程分为三步
1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA 2.退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。 3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′ 端延伸，合成与模板发光激发荧光基团到达高能量状态,而后产生发射光。常用的有绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白 DsRed 、CY3、CY5、FAM及其它荧光报告基团
探针荧光标记及
荧光基团：如红色荧光Cy3和绿色荧光Cy5 标记探针
淬灭基团常：用4-（4-二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（DABCYL）
PCR反应特点
特异性强灵敏度高
PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10- 12)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。
简便、快速
PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。
对标本的纯度要求低
不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。
短柄圆环探针荧光PCR原理
分子信标是一种荧光标记的寡核苷酸链，一般含有25～35个核苷酸。在结构上，分子信标大体上可以分为三部分：（1）、环状区：一般由15～30个核苷酸组成，可以与靶分子特异结合；（2）、茎干区：一般由5～8个碱基对组成，在分子信标与靶分子结合过程中可发生可逆性解离。（3）、荧光基团和淬灭基团：荧光基团一般连接在5ˊ端；淬灭基团一般连接在3ˊ端，常用4-（4-二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（DABCYL）作为淬灭基团。根据Foerster理论，中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比。所以只有荧光基团与淬灭基团之间达到一定的距离时才会产生荧光。

乙肝病毒的检测ppt课件

聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析法 (PCR-
RFLP)
较测序法简便，适于大样本检测，但由于需要进行酶切，所以操作仍较为繁琐，成本较高，并存在酶切不彻底等问题。
pre-S2单克隆抗体酶联免疫简单、快速，已商品化，适于大样本检测，但检测费用较高
测定 (mAbs EIA法)
并不能有效鉴别有些混合型感染和HBsAg低表达及某些表位
6
2
乙型肝炎病毒HBV
• HBV是嗜肝脱氧核糖核酸病毒科的哺乳动物属的一员。
• HBV阳性的血清中有三种病毒颗粒．１.大球形颗粒，完整的HBV颗粒直径为
42nm，又名Dane颗粒，分为包膜与核心的两部分，外衣壳及包膜含有表面抗原，衣壳内为核心结构，有核心抗原，核心抗原下面藏有e抗原。
3
• ２.小球形颗粒，阳性血清中最多的颗粒，主要为表面抗原，不含核酸及ＤＮＡ成分，为不完整的ＨＢＶ．
11
①一种亚型的HBsAg及异型的抗HB（s 常见）；②血清从HBsAg 26 + + + + + 转化为抗HBs 的过程（少见）。 27 - + + + 28 - + + + + 29 - - + + 30 + - + + 31 + + + - 32 + + + + -
12
大三阳
小三阳
HBeAg 阴性的慢乙肝患者，肝硬化年发生率8%-10%； HBeAg 阳性的慢乙肝患者，肝硬化年发生率2%-5% 对HBeAg 阴性患者应该开展更积极的治疗
20
• 2、试剂的影响 2.1乙肝两对半试剂厂家较多；不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别，有资料显示，不同厂家试剂的特异性和敏感性分别为89.4%—99.3%,78~89%存在较大差异。有的厂家酶标板孔间A值差大于15%；标记酶的活性及显色液的稳定比较差。使用质劣的试剂必然导致结果的假阳性或假阴性。因此。选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。 2.2不同方法学的检测试剂，会使两对半结果出现一些不同。例如：在实际工作中常用ELISA检测HBsAg结果为阴性，而电化学发光检测为阳性。除方法学的灵敏度外；还存在使用单抗或多克隆抗体试剂的差别。单抗对变异抗原或亚型乙肝标志物检测存在差异，建议试剂厂家对剂的制备应该考虑亚型及型浓度的问题。

PCR基因扩增仪培训课件

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第一节 PCR基因扩增仪的工作原理
PCR基因扩增仪的工作关键 DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。从PCR反应基本原理可以看出，PCR基因扩增仪工作关键是温度控制。
第二节 PCR扩增仪的分类与结构
荧光实时定量PCR（real-time quantitative PCR,RQ-PCR）技术在PCR反应体系中加入特异性的荧光染料或探针荧光信号的变化真实地反映了体系中模板的增加通过检测荧光信号，从而实时监测整个PCR反应过程最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析
第二节 PCR扩增仪的分类与结构
金属板式实时定量PCR仪可作为普通PCR仪使用可带梯度功能可容纳的样本量大，无需特殊耗材温度均一性欠佳，有边缘效应，标准曲线的反应条件难以做到与样品完全一致
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ABI 7500荧光定量PCR仪
MJ公司Chromo 4荧光定量PCR仪

pcr培训ppt课件

实验操作人员应接受专业培训，熟悉安全操作规程，避免在实验过程中受伤或感染。
07
总结与展望
Pcr技术的总结
PCR技术的原理
PCR是一种在生物实验室中广泛应用的分子生物学技术，其基本原理是通过特定的DNA 聚合酶，在DNA双链之间进行热循环，从而实现DNA的快速扩增。
PCR技术的应用领域
PCR技术在许多领域都有广泛的应用，包括遗传学、医学、生物技术和农业等。通过PCR 技术，科学家们可以快速、准确地检测和鉴定DNA序列，这对于遗传疾病的诊断、生物多样性的研究和基因工程等领域具有重要意义。
安全问题
生物安全
PCR实验涉及的生物材料可能具有传染性，因此需要采取适当的生物安全措施，如穿戴个人防护装备、实验室内消毒等。
废物处理
实验产生的废物应按照相关规定进行妥善处理，避免对环境和人类健康造成危害。
防止污染
PCR实验过程中应采取措施防止污染，如设置阴性对照、定期检测实验室环境等。
人员安全
PCR技术的优缺点
PCR技术具有高灵敏度、高特异性和操作简便等优点，但也存在一些局限性，如对模板 DNA的纯度要求高、易受污染等。因此，在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的 PCR方法。
Pcr技术的发展趋势
要点一
提高灵敏度和特异性
随着基因组学和分子生物学研究的深入，对PCR技术的灵敏度和特异性提出了更高的要求。因此，未来的PCR 技术需要进一步提高其灵敏度和特异性，以满足更广泛的研究和应用需求。
05
Pcr技术的拓展应用
基因克隆与表达
基因克隆
通过PCR技术，科学家可以快速、准确地获取特定基因片段，为基因克隆提供基础。
基因表达
利用PCR技术，可以检测基因在不同条件下的表达水平，有助于理解基因功能和调控机制。

基于乙肝病毒DNA检测技术的诊断课件

3
测序技术
测序技术可以帮助识别乙肝病毒DNA序列中的突变，从而更好地评估病毒的耐药性和致病性。
Hale Waihona Puke 检测结果解读阴性结果
阴性结果表示未检测到乙肝病毒DNA，说明检测样本中没有乙肝感染。
阳性结果
阳性结果表示检测到乙肝病毒DNA，说明样本中存在乙肝感染。
病毒载量
病毒载量是指血液中乙肝病毒的数量，高载量可能说明感染程度较重。
基于乙肝病毒DNA检测技术的诊断课件
本课件旨在介绍基于乙肝病毒DNA检测技术的诊断方法，为大家详细解释乙肝病毒检测的重要性以及相关方法和意义。
乙肝病毒检测的重要性
乙肝病毒检测是预防和控制乙肝传播的关键措施，早期检测可帮助避免病情恶化和传染他人。
乙肝病毒的传播途径
乙肝病毒主要通过血液接触、性传播和母婴传播等途径传播，了解传播途径可帮助预防和控制疾病的传播。
乙肝病毒DNA检测技术
乙肝病毒DNA检测技术是一种确诊乙肝感染的常用方法，通过检测乙肝病毒的DNA分子来确定感染情况。
乙肝病毒DNA检测方法
1
PC R （聚合酶链式反应）
PCR是一种快速高效的基因检测方法，可用于检测乙肝病毒DNA，并确定感染程度。
2
原位杂交
原位杂交是一种检测乙肝病毒DNA的特异性方法，通过与标记的探针结合来确定感染的位置。
乙肝病毒DNA检测的意义
1 早期诊断
乙肝病毒DNA检测可帮助早期发现感染，提供及时治疗和干预的机会。
2 疫情监测
乙肝病毒DNA检测可帮助监测疫情和流行趋势，指导公共卫生部门的干预措施。
3 治疗评估
乙肝病毒DNA检测可以评估患者对治疗的反应，指导治疗方案的调整。

荧光定量PCR原理扩增曲线ppt课件

遗传疾病的诊断
多重定量
24
内容概要
荧光定量PCR原理荧光定量PCR的标记方法荧光定量PCR的解析方法 SYBR法实验流程及注意事项 TIANGEN公司荧光定量产品选择指南
25
绝对定量解析方法
26
绝对定量的定义
Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量
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Ct1 28.18
25.25 22.11 18.63 20.56 None
Ct2 28.64
25.14 22.46 18.92 20.45 None
Mean Ct 28.41
25.19 22.28 18.77 20.5
STD 0.16
0.04 0.12 0.10 0.05
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绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量
设计特异引物；设计TaqMan探针并标记探针；荧光定量扩增；结果分析：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数。
30
绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量
实验数据
Sample
标准品标准品标准品标准品
未知样品空白对照
copies/ml 5×103
5×104 5×105 5×106
使用方便，不必设计复杂探针
具有价格优势
容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件
对引物特异性要求较高
不能进行多重定量
18
Taqman探针法——原理
5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等

HBV一管法实验操作培训

4、以上要求需在一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行检测。
整理课件
结果分析
• 三、检验结果的解释
1、如果靶基因FAM通道没有出现S型扩增曲线，判为HBV DNA检测阴性。
2、如果靶基因FAM通道出现S型扩增曲线，判为HBV DNA检测阳性，检测结果有如下解释：
1）测定值在0~500 IU/ml的样本报告为“低于试剂盒检出下限(500 IU/ml)”，即“<500 IU/ml”。应结合其它临床诊断指标进行判断。
乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针“一管法”）实验操作培训
北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司
整理课件
预期用途
•
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的
一种疾病，主要通过血和血制品、母婴传播及性接触传播。乙型肝炎病毒感染者临床表现多样化，潜伏期较长，最常见的临床表现有食欲减退、恶心、呕吐、腹胀、乏力等症状，部分患者有低热等症状。人感染HBV后，病毒持续6个月仍未被清除者可发展为慢性肝炎，导致肝硬化或肝癌。
注意：a、HBV酶混合物最后加，并且需要快速放回存储设备 b、加酶混合物前需润洗枪头2-3次，然后缓慢加样 c、在混匀和离心时注意闭光 d、PCR-mix可在样本整处理课理件结束后配制
操作步骤及注意事项
• 二、样本处理（在样本处理区进行）
1、取3 ul核酸释放剂，加入PCR反应管中注意：需要过吸加样，并且垂直加入PCR反应管底部
光信号的变化实现HBV DNA的定量检测。
•
本试剂盒系采用微量核酸释放剂(MNRR)，可在一管中
进行HBV DNA核酸提取与扩增，对3l的微量血清或血浆样本
直接进行快速、准确定量的荧光PCR系统；微量核酸释放剂

PCR扩增技术ppt课件

.
PCR仪
凝胶成像系统
.
三. 实验方法
１．向无菌的200μl Eppendorf管中依次加入以下溶液
反应物
体积
10×buffer
2.5μl *5 12.5
4×dNTP(1mM) 2.5μl *5 12.5
无菌水
18μl *5
90
Taq酶 (1U/l)
0.5μl *5
2.5
混合，吸取24.5μl
引物上
0.5μl *5
2.5
引物下
0.5μl *5
2.5
模板ＤＮＡ (20ng) 0.5μl
总体积
25μl
.
2. 反应体系混匀，离心 3. 在ＰＣＲ仪上按以下方式循环
９4℃变性 5分钟９4℃变性 45秒 30个循环 55℃退火 45秒 72℃延伸 1分钟７２℃延伸反应10分钟。 4. 取5μl反应液加4μl Loading buffer在１.５％琼脂糖凝胶上120伏，电泳2小时。 5. 在凝胶成像系统上观察记录实验结果
ＰＣＲ技术实际上是在模板ＤＮＡ，引物和４种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于ＤＮＡ聚合酶的酶促合反应，ＰＣＲ技术的特异性取决于引物和模板ＤＮＡ结合的特异性。反应分三步：①变性（denaturation）；② 退火（annealing）；③延伸（ex tension），反应过程见图。
.
模板ＤＮＡ在９４℃条件下变性形成单链；在５５℃条件下根据目的基因两侧序列设计的引物分别与其同源序列结合；７０℃下在耐热性ＤＮＡ聚合酶Taq 酶催化下，在４种dNTP存在条件下延伸形成双链。完成一次循环。接着又以新合成的ＤＮＡ为模板进行同样反应，如次往复循环30 次，由于每次循环目标ＤＮＡ都以２n次幂扩增，３０次循环后目的DNA的量增加１０６－７倍。成功的ＰＣＲ反应要求反应有很好的特异性和相当的扩增效率。要达此目的ＰＣＲ反应要注意以下问题：

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一次循环
5’
3’
5’
3’ 模板DNA3’5’高温变性低温退火
适温延伸
5’
3’
引物
Tap酶
3’
两条子代DNA
5’
经过25-35次循环后，目的片段扩增2n倍
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三、主要器材及试剂
1.主要器材：
9700型PCR仪
PCR技术可以检测出极微量的病毒，是判断其传染性最直接、最可靠的证据。PCR技术已成为公认的对病毒性肝炎的诊断、疗效观察及预防研究工作最理想的方法之一。
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一、实验目的
1.掌握PCR技术扩增的原理 2.熟悉PCR扩增检测乙肝病毒的基本操作
Thank you!
五、注意事项
1. 试剂盒内阳性标本及DNA提取液使用前需充分融化离心。
2. 反应液的表面为固体封盖剂，电泳取样时从反应管底部吸液。
3. EB为强致癌物，操作过程应注意防护。 4. 注意无菌操作，以免出现假阳性。
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1.变性：加热使双链DNA变为单链 2.退火：急速降温使引物和互补模板
在局部形成杂交链 3.延伸：耐热DNA聚合酶按5 ′→3′
方向催化以引物为起始点的延伸反应
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乙肝病毒（HBV）感染引起的乙型肝炎，我国发病率很高，HBV的检测极其重要。
HBV DNA存在就可以引起乙肝的传染，乙肝病毒基因是乙肝病毒的核心成分，是病毒复制的发动机。
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DNA提取液
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四、操作步骤
1.标本处理：取患者血清40μl，加入DNA
提取液40μl，沸水浴10分钟，10000转离心 5分钟，取上清液4μl做PCR反应。
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变性
温度 93℃
时间 45″（首次5′）
退火
55 ℃
45″
延伸 72 ℃
60″（末次5′）
循环次数：25次
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加入标本
6000转离心10秒
PCR仪上扩增
离心
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4.电泳检测：
①制备2%琼脂糖凝胶
电泳槽的准备：
2%琼脂糖的制备：
称取 0.8g琼脂糖
40mlTBE 加入电泳缓冲液冷却
（PH8.0) 60℃左右煮沸溶解
加入溴乙啶
EB20μl
倒胶
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②加样：取扩增后的产物10 ul点样于凝胶孔
过程。
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二、实验原理
聚合酶链反应(Polymerase Chain
Reaction) 简称PCR,是在体外条件下利用DNA聚合酶、催化一对引物间的特异性DNA片段合成的基因体外扩增技术，它包括三个基本过程：
电泳槽、电泳仪
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紫外分析仪
台式高速离心机
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2.主要试剂：
HBV阳性标本 PCR反应管
HBV-PCR定性检测试剂盒
10×扩增缓冲液
TapDNA聚合酶
2.加样：
取试剂盒中PCR反应管
4种dNTP混合物
Mg2+ 引物(小分子DNA片段）
加入提取好的标本4μl，6000转离心10秒。
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3.PCR仪上扩增：
三个扩增步骤温度及时间
取样
点样
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③电泳：点样端接“-”，稳压，50V，电泳30分钟。
五、结果观察：紫外分析仪下观察，出现橙黄色条带则为HBV阳性
点样孔
HBV阳性对照
HBV阳性
HBV阴性对照
HBV阴性
正极
负极
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PCR扩增检测乙肝病毒培训课件

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