吉姆萨染色方法及结果

原代贴壁细胞吉姆萨染色法原代贴壁细胞吉姆萨染色法染液制备：1. 称取0.5g吉姆萨粉和22ml甘油；2. 取少量甘油与吉姆萨粉在研钵内充分混合，研磨至无颗粒；3. 将剩余的甘油倒入研钵，于56℃保温2h；4. 加入33ml纯甲醇混匀，即为吉姆萨母液，将其保存于棕色试剂瓶内；5. 取9份pH6.80—7.38的Soreen缓冲液和1份吉姆萨母液混合即得染色液；贴壁细胞染色步骤：1. 去除培养器皿内的培养液，用平衡盐溶液反复漂洗单层培养物2次；2. 加入平衡盐溶液，再逐滴加入等体积甲醇，边加边混合，静置10mi n；3. 将50%甲醇-混合液丢弃，加入新鲜的甲醇液浸泡固定细胞10min，然后用甲醇漂洗细胞1次；4. 将瓶内细胞干燥后储存或直接染色；5. 按2ml/cm2的比例滴加吉姆萨染液，覆盖细胞层，染色2min；6. 移除染液，用自来水冲洗掉粉红色背景后，再用去离子水冲洗细胞；7. 用显微镜观察单层潮湿细胞。

若细胞已干，可重新使细胞潮湿后再观察；结果：细胞核被染成紫红色或紫蓝色，而细胞质则被染成浅红色；吉姆萨染色法注意事项：1. 染液宜现用现配，旧染液染色效果不佳。

染液保存时间不宜超过48 h；2. 吉姆萨对pH极敏感，因此，缓冲液pH要准确，否则染色效果不佳。

如用染色缸染色时，随染色时间的延长，在染液表面常形成一层氧化膜（发亮）易附着在玻片上形成污秽，且不易除掉。

因此在用染色缸染色，尤其用的不是现配者时，染色前应先用小片滤纸刮除液面的氧化层再进行染色。

染色完毕，应把标本浸入水中漂洗染液；提供：5. 原代细胞总蛋白质抽提物；6. 原代细胞总RNA；7. 原代细胞总DNA。

吉姆萨检测细胞凋亡实验方案1 材料及器具吉姆萨染料（粉剂）、甘油、甲醇、KH2 PO4、Na2 HPO4、蒸馏水、封闭型棕色瓶2 试剂配制吉姆萨母液：吉姆萨染料粉剂0.75g甘油50ml甲醇50ml将粉剂放于甘油内搅匀，放入60℃温箱24h，经常摇匀，取出待冷再加甲醇混匀，配成母液，封闭棕色瓶保存。

吉姆萨工作液：使用时以原液10ml加入pH为6.4-6.8的磷酸盐缓冲液100ml稀释成工作液。

磷酸盐缓冲液：A液Na2HPO4 0.946g，蒸馏水100mlB液KH2PO4 0.907g，蒸馏水100ml临用时取A液40ml，B液60ml混合，pH值约为6.64。

3 染色步骤（1）常规脱蜡至水；（2）蒸馏水洗；（3）在37℃温箱中吉姆萨染色30min；（4）蒸馏水洗2min；（5）PBS分色适度；（6）将切片从PBS中拿出，甩掉切片上的水分，放在空气中略干燥，以肉眼观察组织上的水分消失为度；（7）入100%酒精中30s至1min；（8）二甲苯透明5min；（9）中性树胶封片。

4 预期结果背景淡蓝色，核为深蓝色，凋亡细胞为深蓝色。

5 体会在染色中第6步是关键，不经过此步骤直接入100%酒精脱水，脱色会很严重，无法控制，使染色失败；在第6步后入95%的酒精中脱水，脱色也非常快；若将切片从PBS中拿出，甩掉切片上的水分，放在空气中略干燥，以肉眼观察组织上的水分消失后再入100%酒精脱水，效果良好。

因此，用吉姆萨染料染料检测细胞凋亡操作简便、色彩鲜艳、对比度好、细胞核和凋亡细胞着色清晰，能够长期保存、不褪色，为一种值得推广的方法。

参考文献：《吉姆萨染色法对大脑组织凋亡细胞的染色》-徐广有，2005年。

Giemsa染色法1 染色原理编辑本段Giemsa染色法：吉姆萨染液由天青，伊红组成染色原理和结果与瑞特染色法基本相同。

嗜酸性颗粒碱性蛋白质，与酸性染料伊红结果，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白和淋巴细胞胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。

PH对细胞染色有影响。

细胞各成分均不蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液PH而定，在偏酸性环境中下在电荷增，易与伊红结合，染色偏红；在偏三性环境中负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色偏蓝。

因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用正经片必须清洁，无酸碱污染。

配制顼特液必须用优质甲醇，稀释染色必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致各种细胞染色反应异常，以致识别困难，甚至造成错误。

2 介绍编辑本段MGG由May-Grunwald染料和Giemsa染料组成。

前者化学名为曙红亚甲基蓝Ⅱ，对胞质着色较好；后者对胞核着色较好。

因此MGG染色，可兼两者的优点，常用于细胞涂片染色。

2.1 1．染液配制I液的配制：迈格染料 lg甲醇 100ml在研钵内用少量纯甲醇将染料充分研磨成均匀一致的悬液，倒人烧瓶中，加入其余的甲醇后置入37℃温箱4-6小时，每隔半小时研磨半小时，然后放入深棕色瓶内，在室温下保存，2周后使用。

临用前取上液40ml，加纯甲醇20ml混合用作工作液。

Ⅱ液的配制：姬氏染粉 0.6g甘油 50ml甲醇100ml将姬氏染粉溶于甘油内，在研钵内研磨3-4小时，使之磨匀，加入纯甲醇后搅拌均匀,放入深棕色瓶内，室温下保存，2周后即可使用。

磷酸缓冲液配制：1％磷酸氢二钠20ml，l％磷酸二氢钠30ml，加蒸馏水至1000ml，调整pH 6.4-6.8(用蒸馏水代替缓冲液，效果亦佳)。

2.2 2．染色步骤(1)自然干燥的细胞涂片(预先滴加甲醇固定更好)水平置于染色架上。

1.材料
1g的姬姆色素染料加入66ml甘油，混匀，60度保温溶解两小时，再加入66ml甲醇混匀，即配成姬姆色素原液，此原液用前用PBS（6.8）稀释十倍左右就可以使用（此为姬姆萨工作液）。

工作液可保存一个月左右，Camon固定液（3体积乙醇+1体积冰乙酸）；
PBS缓冲液配制：在基因工程手册里，网上的不大准确！
2.方法
①涂片的制作与固定：用移液枪吸取10-20μL待检溶液滴在载玻片上,均匀涂布,室温下阴干后,用Camon固定液固定涂片10min。

②染色：置姬姆萨工作液30min。

③洗脱：染色完成后,涂片立即用ddH2O洗脱。

④显微镜观察：用甘油压片,指甲油封固。

在100×油镜下观察。

吉姆萨染色方法显示X染色质结构吉姆萨粉1 g ,甘油(AR) 66 mL ,甲醇(AR) 66 mL 。

先将吉姆萨粉溶于少量甘油中,用研钵研磨成匀浆,再将全部甘油倒入。

放入56 ℃温箱中2 h ,取出将甲醇加入混匀,即配成原液,于棕色瓶中密封保存备用。

临用时加入pH为6. 8 的磷酸缓冲液( V∶V = 9∶1) 配成吉姆萨染色剂。

（二）吉姆萨染色法此法可将细胞核与胞质同时染色，故便捷快速；但染液配制技术不易准确掌握，效果常不如HE染色稳定。

1.吉姆萨(Giemsa)染液的配制（1）取1.5g吉姆萨粉末放入50ml甘油，置于60℃温箱，约3h后溶解。

（2）取出后倒入50ml中性甲醇，即为母液。

于棕色瓶可长久保存。

需要注意的是，有的甲醇内含醋酸，会使染液中的伊红沉淀出来，不利染色。

（3）将母液与0.1 mol／LPBS(Ph6.9～7.2)按1:9混合即成工作液。

吉姆萨染液对pH极敏感，偏酸时染色过红，偏碱时则过蓝。

所以，工作液宜现用现配，保存时间不超过48h以免被CO2酸化。

瑞氏－姬姆萨染色方法1、试剂配制：原料:A:瑞氏染粉0.8--1克；吉姆萨染粉0.5克B:甘油33mlC：甲醇500ml配法：将A放入研钵中，加入少量B研磨，再加入少量B磨，再加入少量B磨……倒出，将未溶部分，继续加入B磨……>全溶，加入C，或中间加入C 亦可。

2、染色步骤：滴数滴入玻片盖满标本，30秒，再加入双蒸水或PBS2-3倍染1-3分中，倾去染液，水洗……封片。

吉姆萨染色液贮备液配制：吉姆萨粉1g，加甘油60ml，加热并搅拌，待溶解冷却至室温，再加甲醇33ml吉姆萨(Giemsa)氏母液将吉姆萨粉末1g先溶于少量甘油，在研钵内研磨30min以上，至看不见颗粒为止，再将全部(66mL)剩余甘油倒入，于56℃温箱内保温2h。

然后再加入甲醇(66mL)，搅匀后保存于棕色瓶中。

母液配制后放入冰箱可长期保存，一般刚配制的母液染色效果欠佳，保存时间越长越好。

两种染色试剂和方法如下。

000000一、HE染色000000试剂：000000苏木素染液：苏木精1g；无水乙醇25mL；硫酸铝钾10g；蒸馏水350mL；碘酸钾0.1g；冰醋酸10mL。

A 液：用25mL 无水乙醇溶解1g苏木精，摇动即可溶解。

B 液：用350mL 蒸馏水溶解10g硫酸铝钾，摇动或振荡即可溶解。

把A 液和 B 液混合，加入碘酸钾摇动至颜色加深。

最后加入10mL冰醋酸，摇动颜色变为深葡萄酒红色。

染液配制当日即可应用于染色。

酸化液：醋酸20-35mL加蒸馏水至700mL。

000000伊红染液：储液：取1g伊红，溶于100mL 95%的乙醇，待溶解完全后加几滴冰醋酸至染液呈半透明状，避光保存备用。

工作液：取一定量的伊红储液，加入等量70%乙醇，此液即为伊红染液的工作液。

000000染色步骤：000000（1）细胞爬片放用PBS漂洗3次，每次5min，无水乙醇固定5min，风干。

000000（2）95%乙醇1min，75%乙醇1min，三蒸水1min。

000000( 3 ) 浸洗5 % 的醋酸液 ( 酸化液 ) 数秒。

000000( 4 ) 苏木精染液 3 - 5 m i n，胞核呈橙红色。

000000( 5 ) 自来水冲洗至颜色变蓝。

000000( 6) 盐酸乙醇液分化数秒，颜色再次返红。

000000(7) 自来水再次冲洗，返蓝。

000000( 8) 伊红染液5min，流水漂洗15min左右。

000000二、吉姆萨染色000000试剂：000000吉姆萨染液配制：取吉姆萨粉末1g溶于66ml甘油中研磨混匀，然后放置55-60℃水浴2h，冷却后加入66ml甲醇中混匀，过滤后棕瓶分装保存。

0000 00PBS甲醇液：PBS与甲醇一比一混合。

000000染色步骤：000000（1）细胞爬片使用PBS漂洗3次，每次5min。

000000（2）加PBS甲醇液静置2min，去掉PBS甲醇液。

000000（3）加甲醇固定10min，去掉甲醇，加入新无水甲醇漂洗去掉。

吉姆萨染色实验步骤及注意事项实验步骤1.将显影的玻片置于玻片架上，浸入盛有水的染色盘中。

（1）1个盘：pH6.8 10 mmol/l 磷酸钠缓冲液，所配的25倍稀释的吉姆萨染液。

（2）3个盘：水。

（3）脱水系列溶液：①3个盘：分别盛50%、70%和95%乙醇。

②2个盘：盛有100%乙醇。

③3个盘：盛有二甲苯。

2.在25倍稀释的吉姆萨染液中染玻片20 s（依染色时间决定染色的强弱），将玻片在水中浸泡3次，每次2 min。

3.连续用乙醇脱水系列溶液处理，每盘中浸泡2 min，将玻片移至二甲苯盘中，毎次浸泡2 min，共3次。

4.在通风橱中，按如下操作压片固定：用一平头镊（拿在左手），从二甲苯中取出一块玻片，夹住磨面端置水平。

加4滴Permount 的于另一端（切片所处位置），左手拿一干净的盖玻片，很缓慢地放在载玻片上（在加压片固定介质和盖玻片前，勿使玻片变干，因微小气泡会造成人为假象）。

5.用3MM 滤纸，沿盖玻片边缘，小心吸去多余固片介质/二甲苯，并擦拭载玻片背面（勿擦拭盖玻片）。

6.将玻片平放于一硬纸盒盘上，置42℃温孵箱2天使之凝固。

7.以剃须刀片小心刮去载玻片背面残留胶乳，染料及固片介质。

用镜头纸或普通棉纸擦去尘埃。

放入玻片盒，必要时，载玻片上再注明标签。

8.显微镜观察玻片，观察时可依信号强弱，调节光亮。

注意事项▲1.勿将玻片直立存放于玻片中，因此时固片介质尚未凝结。

▲2.细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用正经片一定清洁，要无酸碱污染。

▲3.配制顼特液一定用优质甲醇，稀释染色一定用缓冲液，冲洗一定用水应近中性，不然可导致各种细胞染色反应异常，以致于识别困难，甚至造成错误的。

吉姆萨染色的原理吉姆萨（Giemsa）染色法：吉姆萨染液由天青，伊红组成。

染色原理和结果与瑞特染色法基本相同。

嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结果，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白和淋巴细胞胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。

PH对细胞染色有影响。

细胞各种成分均不蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液PH而定，在偏酸性环境中下在电荷增多，易与伊红结合，染色偏红；在偏三性环境中负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色偏蓝。

因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用正经片必须清洁，无酸碱污染。

配制顼特液必须用优质甲醇，稀释染色必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致各种细胞染色反应异常，以致识别困难，甚至造成错误。

一般性操作技术血涂片制备；细胞染色；显微检查；血液病诊断；染色不良；瑞特（Wright）染色法；酸性染料；伊红；碱性染料；亚甲蓝；吸附作用；PH对细胞染色的影响；甲醇；吉姆（Giemsa）染色法春天要常用润肤剂，它含有松香油脂酸和丰富维生素a，常用可加快皮肤血液循环，剌激面部细胞分泌，有效改善皮肤生理环境，减少气候对皮肤的危害。

第二节血涂片的制备和细胞染色血涂片的显微检查是血液细胞学检查的基本方法，临床上应用极为广泛，特别是对于各种血液病的诊断具有重要的价值，近年来血细胞分析仪的广泛应用，血涂片的观察也可作为判断仪器结果的简易方法。

比台观察10个高倍视野血涂片中白细胞和血小板数大致估计血内这些细胞的数量，借以作为仪器结果分析后质控的参考。

但积压涂片制备和染色不良，常使细胞鉴别发生困难，甚至导致错误结论。

例如，血膜过厚细胞重叠缩小，血膜太薄白细胞多集中于边缘，细胞分布不匀；染色偏酸或偏碱均可使细胞染色反应异常。

因皮制备厚薄适宜，分布均匀，染色良好的血涂片是血液学检查的重要革本技术之一。

血涂片制备方法及注意事项将在实习指导中详细介绍。

姬姆萨染色法过程
姬姆萨（Giemsa）染色法简称姬氏染色，是用天青色素、伊红、次甲蓝混合而成的姬姆萨染料对血液、疟原虫、立克次体、骨髓细胞、脊髓细胞等标本进行染色的方法。

姬姆萨染色是病理学以及疾病研究中常用的染色剂，染色原理和结果与瑞氏染色法基本相同，但该法对细胞核和寄生虫着色较好，结构显示更清晰，而细胞质和中性颗粒则着色较差。

姬姆萨染液可将细胞核染成紫红色或蓝紫色，胞浆染成粉红色，在光镜下呈现出清晰的细胞及染色体图像。

样本处理：组织样本块经10%中性福尔马林溶液固定后，制备成石蜡组织切片，然后进行脱蜡、水化处理；贴壁细胞样本，让其在盖玻片上爬行生长，然后使用甲醇在室温下固定；悬浮细胞样本，离心收集细胞，涂片后用甲醇室温下固定。

姬姆萨染色：滴加Giemsa染色工作液，37℃染色20~30分钟；蒸馏水轻轻洗去染液，在室温条件下充分干燥。

然后在二甲苯中浸泡5分钟，去除杂质，待载玻片透明后，用中性树胶封片。

结果观察：在普通光学显微镜下观察细胞形态。