生物技术制药 (全套课件234P) ppt课件

有限稀释法是把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到96孔细胞 培养板中，使每个孔中在理论上只含有一个细胞。第一次 克隆化时也要应用HT培养液，以后的克隆化可用不含HT的 RPMI1640培养液。由于单个细胞难以存活，克隆化时也需加 入饲养细胞辅助其生长。
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三、筛选阳(Yang)性克隆与克隆化
链抗体、单域抗体、最小识别单位等很多类 型的抗体或抗体单位。基本消除了单克隆抗 体的鼠源性，相对分子质量(Liang)只有完整抗体 分子的1/80~1/3，而且鼠源性单克隆抗体的 生物学活性如激活补体、促进吞噬功能（免 疫调理）、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用 等，只保留同抗原特异性结合的活性。
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三、筛选阳性克隆与(Yu)克隆化
（1）筛选阳性克隆： 因为产生特定抗原的抗体产生细胞只占所有脾细胞的5%左右，
所以要进行每孔培养上清的抗体活性的筛选工作，以选择出阳 性克隆，然后进行克隆化培养。 为了尽快地筛选出阳性克隆，必须采用微量、快速、特异、敏 感、简便并一次能检测大批标本的方法。常用的检测方法有免 疫(Yi)酶技术、免疫(Yi)荧光技术和放射免疫(Yi)技术等。一般来说， 免疫(Yi)酶技术和放射免疫(Yi)技术均适用于可溶性抗原及颗粒性 抗原的抗体检测。免疫(Yi)荧光技术适用于细胞抗原的抗体检测， 特别是制备以检测患者活检组织标本为目的的抗体时，免疫(Yi) 荧光法更有意义，在筛选抗体的同时，还能对所识别的抗原进 行定位判定。
1937年：Tiselius等人用电泳法将血清蛋白分为白蛋白、甲种 （）球蛋白、乙种（ ）球蛋白和丙种（ ）球蛋白，并证明
抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。 20世纪60年代初期：抗原决定簇，精制单价血清。

②细胞学说的建立：19世纪中期，1838和1839年，德国科学家 Schleiden和Schwann建立了细胞学说，是19世纪自然科学三大发现 之一。
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③细胞的早期体外培养实验：19世纪末至20世纪初，1885年~1907 年，用生理盐水培养鸡胚组织，用血清和血浆培养血液中和结缔组织 中的细胞，用淋巴液培养蛙神经组织中的细胞。
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3、兼性贴壁细胞 有些细胞并不严格地依赖支持物，即可以贴附于支持物表面生长，还 可以在培养基中呈悬浮状态良好地生长，这类细胞称兼性贴壁细胞。 在贴壁生长时呈上皮样或纤维样细胞的形态，而悬浮生长时呈圆形。 如：中国地鼠卵巢细胞、小鼠L929细胞等。
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二、动物细胞的生理特点
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二、生产用动物细胞的获得 用于生产的动物细胞主要有：原代细胞、二倍体细胞系、可无限传代 的异倍体转化细胞系（Continuous Cell Line）、以及用这些细胞进 行融合和重组的工程细胞系（genetially-engineered cell line）
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1、原代细胞 是直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化而获得的细胞悬浮液。 由于组织块内常有多种细胞组成，而真正生产需要的只是其中的一小 部分。因此，用原代细胞来生产生物制品常需要大量的动物，费钱费 劳力。 常用的有鸡胚、兔肾或鼠肾原代细胞，以及血液的淋巴细胞。
④无致癌性。
一般从动物的胚胎组织中获取，广泛应用的有WI-38、MRC-5、2BS 等。
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3、异倍体转化细胞系 这类细胞是通过某个转化过程，由于染色体的断裂变成异倍体，从而 失去了正常细胞的特点，而获得了无限增殖能力。 （1）自发的转化过程：正常细胞在传代过程中，大部分细胞随着传 代次数的增加寿命逐渐终结，但其中有个别细胞可自发地转化而形成 有无限生命力的细胞系。这种转化多发生在啮齿动物。

(一)冷冻干燥蛋白质药物制剂
冷冻干燥制备蛋白质类药物制剂主要考 虑两个问题：
一是选择适宜的辅料，优化蛋白质药物 在干燥状态下的长期稳定性。
二是考虑辅料对冷冻干燥过程一些参数 的影响，如最高与最低干燥温度，干燥 时间，冷冻干燥产品的外观等。
（二）喷雾干燥蛋白质药物制剂
喷雾干燥的特点是所得产品可以控制颗粒 大小与形状，生产出流动性很好的球状颗 粒。此项工艺对制备蛋白质类药物的控释 制剂特别是发展新的给药系统是很有用的 。 在喷雾干燥过程中也可加入稳定剂。 喷雾干燥的缺点是操作过程中损失大，特 别是小规模生产，水分含量高。
二、生物技术药物的研究概况
（3）蛋白质两性本质与电学性质
2. 表面活性剂 6. 大分子化合物 生物技术药物产品，目前国内外已批准上市的约40多种，正在研究的数百种之多，这些药物均属肽类与蛋白质类药物。
采用DNA重组技术或其他生物技术研制的蛋白质或核酸类药物，也称为生物技术药物。 (4)微球制剂；
3. 糖和多元醇 2、制剂中药物的活性测定；
吸收促进剂作用机制：
(1)增强药物的热力学运动，使药物不易 聚集，溶解性增加，易于吸收；
(2)改变上皮细胞的体积，使细胞间转运 更易进行；
(3)增加生物膜的流动性，使药物容易穿 过，或引起膜磷酯排列的混乱或是促 进膜中蛋白的沥滤；
(4)抑制药物的水解。
(一)鼻腔给药系统
鼻腔给药对多肽蛋白质药物在非注射剂型中是一个较有希 望的给药途经。由于鼻腔粘膜中动静脉和毛细淋巴管分布 十分丰富，鼻腔呼吸区细胞表面具有大量微小绒毛，鼻腔 粘膜的穿透性较高而酶相对较少，对蛋白质类药物的分解 作用比胃肠道粘膜为低，因而有利于药物的吸收并直接进 入体内血液循环。 为了提高蛋白质类药物鼻腔给药的生 物利用度，可采用吸收促，正在研究的数百种之 多，这些药物均属肽类与蛋白质类药物 。

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（6）交联度大小：交联度愈小，树脂愈易膨胀，交换速度 愈快。但交联度小的树脂选择性较差。
（7）有机溶剂的影响：当有有机溶剂存在时，会降低树 脂对有机离子的选择性，而容易吸附无机离子。 6、凝胶层析
1、溶剂:常用水、稀盐、稀酸、稀碱，有机溶剂如乙醇、 丙酮、氯仿、四氯化碳、丁醇等。丁醇提取的pH、温度范 围较广（pH3-6, -2-40℃）。适用于动植物和微生物原 料。
2、pH : 与溶解度和稳定性有很大关系，一般选择在 pI 的两侧。
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3、温度：一般在5 ℃ 以下，但对温度耐受力较大的药物，可 适当的提高温度，使杂蛋白变性分离，有利于提取和纯化。 如胃蛋白酶、酵母醇脱氢酶及多肽激素类，选择37-50 ℃ 提 取，效果较好。 影响提取的因素：
1、被提取物质溶解度的大小：一般极性对极性；非极性 对非极性；酸对碱；碱对酸；高温；远离等电点。
2、扩散作用的影响：扩散方程式 G=DF*Δ C/Δ X*t 3、分配作用的影响：分配定律 (C1/C2)恒温、恒压=K
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四、分离纯化Separation and Purification 1、盐析法
基 2、发酵法（ Zymotechnics）
本 3、化学合成（Chemical synthesize）
制 造
4、组织培养法（Tissue culture）
方 5、现代生物技术(Modern Biotechnics):
法
Gene engineering, Enzyme engineering,
Cell engineering , protein Engineering,
时比较少用。
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B. 溶菌酶处理法：溶菌酶是专一地破坏细菌细胞壁的酶。 多用于微生物，对蜗牛酶、纤维酶及植物细胞也适用。如 用噬菌体感染大肠杆菌细胞制造DNA时，采用pH8.0的 0.1mol/L Tris-0.01mol/L EDTA 制成 2 亿/ml的细胞悬液， 然后加 入100μg~1mg的溶菌酶，在37 °C保温10min， 细菌胞壁即被破坏。