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直投式发酵剂DVS增菌培养基的优化及冻干保护剂的筛选1彭亚会，高学军，刘营东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨（150030）E-mail：pyhui7856@摘要：对直投式酸奶发酵剂的制备工艺中的关键技术进行研究，在超浓缩培养基的筛选中利用脱脂乳代替乳酸菌所需的氮源部分，可以大大降低生产成本，并通过正交试验筛选出三株菌的最优的冻干保护剂配方，本研究结果将为我国工厂化生产质地优良的直投式酸奶发酵剂提供最佳且廉价的培养基组合。
关键词：乳酸菌，直投式发酵剂，增菌培养基，冻干保护剂中图分类号：Q933 文献标识码：A直投式酸奶发酵剂（Direct Vat Set, DVS）是指一系列高度浓缩和标准化的冷冻或冷冻干燥发酵剂菌种，每克活菌数在1011个以上，在生产酸奶或发酵乳制品时可直接加入到热处理的原料乳中进行发酵，而无需对其进行活化、扩培等其它预处理工作[1]。
直投式发酵剂使用方法快捷经济，使用量少，易于贮存，降低噬菌体的污染的可能，所发酵产品性质稳定、香味清新、口感爽滑、且货架期长，是生产优质酸奶的关键因素。
它的生产和应用促使酸乳和其它发酵乳制品生产专业化、社会化、规范化和统一化。
本实验根据对实验室保存的乳酸菌菌株超浓缩培养基以及冻干保护剂进行优化，筛选出最佳的成本低廉的超浓缩培养基及冻干保护剂配方，制备出性能优良的且生产成本较低的新型直投式酸奶发酵剂，以期为我国进一步直投式酸奶发酵剂的产业化提供理论依据及技术参数。
1. 材料与方法1.1材料1.1.1实验材料本实验室保藏的乳酸菌单菌株（嗜热链球菌1株，以下简称乳球菌；保加利亚乳酸杆菌2株，以下简称杆菌1和杆菌2）。
麦芽汁（青岛啤酒集团）；番茄汁（本实验室自制）；脱脂乳粉。
1.1.2培养基复壮培养基（乳球菌和乳杆菌分别采用液体M17培养基和液体MRS培养基）；乳球菌液体超浓缩培养基组；杆菌1液体超浓缩培养基；杆菌2液体超浓缩培养基见文献[2]。
直投式乳酸发酵剂的制备过程直投式发酵剂的制备首先需要选择合适的菌种以及培养基，培养基经灭菌处理接种，在适宜的条件下进行菌体高密度浓缩培养，培养完成后采用特定方法分离菌体添加保护剂，浓缩菌液后进行低温保藏，经检测合格后即为产品。
直投式酸奶发酵剂的制作方法直投式酸奶发酵剂(Directed Vat Set, DVS)是指一系列高度浓缩和标准化的冷冻干燥发酵剂菌种，可直接加入到热处理的原料乳中进行发酵，而无需对其进行活化、扩培等其它预处理工作。
直投式酸奶发酵剂的活菌数一般为1010 - 1012 CFU/g。
由于直投式酸奶发酵剂的活力强、类型多，酸奶厂家可以根据需要任意选择，从而丰富了酸奶产品的品种，同时省去了菌种车间，减少了工作人员、投资和空间，简化了生产工艺。
直投式酸奶发酵剂不需扩大培养，可直接使用，便于管理。
直投式酸奶发酵剂的生产和应用可以使发酵剂生产专业化、社会化、规范化、统一化，从而使酸奶生产标准化，提高酸奶质量，保障了消费者的利益和健康。
酸奶生产技术的一个重大突破就是在于改变了传统液态发酵剂的生产模式，使用直投式酸奶发酵剂。
直投式酸奶发酵剂的产品质量均一，可以预先测定其活性，接种量可精确控制，而且容易混合均匀，因此可以确保发酵剂和酸奶质量的稳定。
直投式酸奶发酵剂的生产过程主要包括以下几个步骤：1)优良菌种的选育和保藏。
生产优质的商品化发酵剂关键在于使用优良菌种。
目前国外已经专门成立了酸奶发酵剂生产与研究中心，对发酵剂菌种的功能要求已经基本形成标准。
乳酸菌的筛选方向主要有：①筛选抗冷冻、抗干燥、抗剪切力等抗逆性强的菌株，因为冻干、深度冻藏、喷雾干燥是当前制备商品化发酵剂的主要方法；②筛选乳糖和半乳糖利用率高的阳性菌株，以多产乳酸；③筛选粘性菌种以高产胞外多糖等粘性物质，从而增加产品粘度，提高产品的浓厚质地，并减少凝胶断裂及乳清析出等质量缺陷的发生；④酸奶发酵过程中会经常由于噬菌体的污染而导致发酵迟缓甚至发酵失败，但是目前还缺乏有效的防治措施，因此每个酸奶厂都要求有相应的抗噬菌体菌株以备轮换；⑤柠檬酸能够被分解成为二乙酰等酸奶特有风味物质，柠檬酸利用菌能够增强酸奶的特有风味；⑥筛选双歧杆菌和嗜酸乳杆菌等益生菌时，菌株最好来自于人体，而且能耐受人的胆汁酸盐和酸性环境，以增强其有效性。
乳酸菌复合发酵剂的制备方法筛选方法（一）溶钙圈法利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。
其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。
几种乳酸菌筛选1、嗜热链球菌样品来源：市售酸奶培养基：M17改良培养基培养温度：42℃需氧情况：兼性厌氧筛选方法：常规的稀释涂布和划线分离2、保加利亚乳杆菌样品来源：市售酸奶培养基：牛肉浸膏1.5％，酵母浸膏0.5％，葡萄糖3.0％，柠檬酸三铵0.2％，七水硫酸镁0.02％，琼脂1.5％，pH 5.1。
培养温度：42℃需氧情况：兼性厌氧筛选方法：常规的稀释涂布和划线分离法3、双歧杆菌样品来源：婴儿新鲜粪便培养基：MRS培养基、NPNL培养基、TYP培养基、PTYG培养基培养温度：37℃需氧情况：严格厌氧筛选方法：常规的稀释涂布和划线分离法从商品酸奶或自然发酵食品中分离出保加利亚杆菌和嗜热链球菌；以4％～12％的脱脂奶粉、4％～6％的酶解乳清粉、2％～6％的蕃茄汁、0.5％～0.7％的酵母粉、4％～6％的麦芽糖；1％～3％的乳糖、0.4％～0.6％的丝氨酸或缬氨酸、0.4％～0.6％的蛋氨酸或胱氨酸或半胱氨酸、0.5％～1％的碳酸钙、50～80mg/kg的甲酸和余量的水的混合物作为增菌培养液，将保加利亚杆菌和嗜热链球菌以初菌数1∶1的比例混合，将菌种接种在增菌培养液中进行发酵培养，并用10％～15％氢氧化钠控制pH值在5.8～6.1，在41.5 ℃～43℃的温度下发酵培养4-5小时；发酵液在0℃-20℃，转数为6000-15000转/分钟的条件下离心处理，得到离心沉淀物，在无菌条件下与菌体冻干保护剂均匀混合，菌体冻干保护剂由10％～20％的奶粉、1％-3％的甘油、1％～2％的维生素C、0.5％～1％的谷氨酸或甘氨酸、3％～5％的蔗糖，0.1％～0.2％的蛋氨酸或半胱氨酸和与量的水组成；在-18℃～15℃温度下，进行6-12 小时的冻干前预冷处理后真空冷冻干燥，并采用充氮包装制成产品。
直投式发酵剂制备过程直投式发酵剂是一种利用发酵技术制造的微生物制品，广泛应用于农业、养殖业、食品加工等领域。
下面我们来详细了解一下直投式发酵剂的制备过程。
一、原料准备直投式发酵剂主要由菌种、发酵培养基、保护剂和辅料组成，因此在制备过程中需要准备好以下原料：1. 菌种：不同的直投式发酵剂对应不同的菌种，可以选择酵母菌、乳酸菌、放线菌等单一或混合培养，根据实际需要选择相应的菌种。
2. 发酵培养基：发酵培养基是直投式发酵剂的基础，其质量直接影响到发酵剂的质量。
一般情况下，发酵培养基由蔗糖、酵母粉、麩皮粉、鱼粉等原料制成，还可以添加维生素、微量元素等。
3. 保护剂：保护剂是为了保护直投式发酵剂的稳定性和活性，常用的有蔗糖、麦芽糊精、蛋白等。
4. 辅料：根据不同的发酵剂需要，可以添加调味剂、氧化剂等。
以上原料准备好后，可进入制备工序。
二、发酵培养1. 发酵罐准备：将准备好的发酵罐清洗干净，并进行高温高压消毒处理，以避免污染。
2. 发酵培养基配制：根据配方搭配好各种原料，并加入足够的水，搅拌均匀。
3. 菌种加入：将已培养好的菌种加入发酵培养基中，搅拌均匀，让菌种充分分散。
4. 发酵过程：将混合好的发酵液装入发酵罐中，并控制好温度、湿度、pH值等发酵条件。
发酵过程中要定期观察、调整，以确保发酵剂的质量和稳定性。
5. 发酵结束：当发酵液的酸度达到一定的范围，表明发酵结束。
此时，应停止通风，关闭发酵罐，并取出发酵液。
三、成品制备1. 分离工序：将发酵液通过离心或滤纸等方式进行分离，得到含有菌体的沉淀物。
2. 干燥工序：将沉淀物进行干燥，去除多余的水分。
3. 粉碎工序：对干燥好的沉淀物进行进一步粉碎，直至制成粉末状。
4. 包装工序：将粉末状的发酵剂放入密封包装袋中，并进行真空封闭处理，以确保制品安全性和稳定性。
至此，一份高品质、高效率、具有指导意义的直投式发酵剂便制备完成了。
在制备过程中，需严格控制各项发酵条件，确保制品质量及稳定性。
直投式乳酸发酵剂的制备过程直投式发酵剂的制备首先需要选择合适的菌种以及培养基，培养基经灭菌处理接种，在适宜的条件下进行菌体高密度浓缩培养，培养完成后采用特定方法分离菌体添加保护剂，浓缩菌液后进行低温保藏，经检测合格后即为产品。
直投式酸奶发酵剂的制作方法直投式酸奶发酵剂(Directed Vat Set, DVS)是指一系列高度浓缩和标准化的冷冻干燥发酵剂菌种，可直接加入到热处理的原料乳中进行发酵，而无需对其进行活化、扩培等其它预处理工作。
直投式酸奶发酵剂的活菌数一般为1010 - 1012 CFU/g。
由于直投式酸奶发酵剂的活力强、类型多，酸奶厂家可以根据需要任意选择，从而丰富了酸奶产品的品种，同时省去了菌种车间，减少了工作人员、投资和空间，简化了生产工艺。
直投式酸奶发酵剂不需扩大培养，可直接使用，便于管理。
直投式酸奶发酵剂的生产和应用可以使发酵剂生产专业化、社会化、规范化、统一化，从而使酸奶生产标准化，提高酸奶质量，保障了消费者的利益和健康。
酸奶生产技术的一个重大突破就是在于改变了传统液态发酵剂的生产模式，使用直投式酸奶发酵剂。
直投式酸奶发酵剂的产品质量均一，可以预先测定其活性，接种量可精确控制，而且容易混合均匀，因此可以确保发酵剂和酸奶质量的稳定。
直投式酸奶发酵剂的生产过程主要包括以下几个步骤：1)优良菌种的选育和保藏。
生产优质的商品化发酵剂关键在于使用优良菌种。
目前国外已经专门成立了酸奶发酵剂生产与研究中心，对发酵剂菌种的功能要求已经基本形成标准。
乳酸菌的筛选方向主要有：①筛选抗冷冻、抗干燥、抗剪切力等抗逆性强的菌株，因为冻干、深度冻藏、喷雾干燥是当前制备商品化发酵剂的主要方法；②筛选乳糖和半乳糖利用率高的阳性菌株，以多产乳酸；③筛选粘性菌种以高产胞外多糖等粘性物质，从而增加产品粘度，提高产品的浓厚质地，并减少凝胶断裂及乳清析出等质量缺陷的发生；④酸奶发酵过程中会经常由于噬菌体的污染而导致发酵迟缓甚至发酵失败，但是目前还缺乏有效的防治措施，因此每个酸奶厂都要求有相应的抗噬菌体菌株以备轮换；⑤柠檬酸能够被分解成为二乙酰等酸奶特有风味物质，柠檬酸利用菌能够增强酸奶的特有风味；⑥筛选双歧杆菌和嗜酸乳杆菌等益生菌时，菌株最好来自于人体，而且能耐受人的胆汁酸盐和酸性环境，以增强其有效性。
筛选得到的纯培养物置于超低温冰箱或液氮罐中长期保藏，以保持其活性和稳定性。
2)菌种的移植。
在进行发酵剂的工厂化生产以前，先在实验室和菌种车间进行菌种的活化和移植，并进行种子液的扩大培养。
3)培养基的配制和灭菌。
制备直投式酸奶发酵剂，首先要对乳酸菌进行高浓度培养。
在选择好基础培养基(一般为脱脂奶粉培养基)后，要找到合适的增强因子对培养基进行强化，得到优化培养基，以使乳酸菌的繁殖量达到最大。
4)接种培养。
乳酸菌的高浓度培养方法有几种：①恒定pH值培养法：乳酸菌在发酵过程中，代谢产生的乳酸、醋酸等物质对其生长具有反馈抑制作用。
发酵罐中培养液的pH值维持在5.8 - 6.0，以解除乳酸等物质对菌体生长的抑制作用，延长培养时间，制备出含活菌数高的发酵液。
培养过程中，使用化学中和法或缓冲盐法维持培养液pH值的稳定。
②膜渗析法：利用膜的选择性将培养液与营养液进行成分交换，使培养液中的乳酸部分渗出，营养液中的成分渗入培养液中，以维持乳酸菌正常的生长繁殖。
5)细胞浓缩。
对数期后期至稳定期前期是乳酸菌细胞收获的最佳时期，因为此时收获的菌体细胞的存活率和抗冻、抗干燥能力最强。
这时就可以将乳酸菌培养液进行离心分离，收集菌体细胞，使菌液浓度得到浓缩。
也可以选择膜分离。
浓缩倍数在20 - 50倍以上，操作过程应尽量柔和，尽量降低剪切力和空气的影响。
6)冷冻干燥。
将乳酸菌冷冻后，在减压环境下利用升华现象除去水分。
当菌体中的大部分水分被去除后，细胞的生理活动就会停止，从而达到了长期保藏的目的。
冷冻过程中产生的冰晶体会损坏细胞膜，导致细胞大量死亡，所以在冷冻干燥前需加抗冷冻保护剂，以减少细胞的损害程度。
7)包装。
一般采用袋装、无菌包装，便于贮存、运输和使用。
8)贮存和运输。
生产结束后，将袋装直投式酸奶发酵剂一直保持在-18℃条件下冷藏，直至产品投放到发酵罐中，有助于保持更高的存活率和稳定性。
以上过程中涉及两个关键技术：增加菌液的浓缩程度和减少干燥致死数量。
本实验对直投式酸奶发酵剂的发酵工艺中的关键技术进行研究，利用5L发酵罐进行发酵工艺研究，确定从EZAL-MY96直投式酸奶发酵剂中分离得到的３株乳酸菌中每一菌株的最佳发酵工艺参数。
冷冻干燥后的３株乳酸菌按照一定的比例混合制备出优质的DVS。
本研究结果为直投式酸奶发酵剂的工业化生产提供了重要的理论和实验数据。
1．材料与方法1.1材料1.1.1实验材料本实验室保藏的乳酸菌单菌株（嗜热链球菌1株，以下简称球菌；保加利亚乳酸杆菌2株，以下简称杆菌1和杆菌2）[ 2]。
麦芽汁（青岛啤酒集团）；番茄汁（本实验室自制）；脱脂粉（内蒙古呼伦贝尔农垦雪花乳业）。
1.1.2培养基PY培养基；M17球菌半选择培养基；MRS杆菌半选择培养基；复壮培养基（乳球菌和乳杆菌分别采用液体M17培养基和液体MRS培养基）见文献[3]；球菌工业化液体超浓缩培养基；杆菌1工业化液体超浓缩培养基；杆菌2工业化液体超浓缩培养基见文献[4]。
1.1.3仪器设备BIOF-2005型发酵罐，FD-1B-55型冷冻干燥机，高压灭菌器，超净工作台，恒温培养箱，恒温震荡器。
1.2方法1.2.1 DVS菌株种子液的获得本实验对目前广泛使用的法国罗地亚公司EZAL-MY96发酵剂应用形态学观察及糖发酵实验进行菌株的分离鉴定，分离和筛选出３株具有优良特性的菌株，分别为1株球菌和2株杆菌（分别命名为杆菌1和杆菌2），利用这３株乳酸菌进行直投式酸奶发酵剂的制备。
将球菌菌种利用PY增殖培养基在42℃的条件下培养8h制备出球菌种子液，将杆菌1菌种利用MRS培养基在37℃的条件下培养23h制备出杆菌1种子液，将杆菌2菌种利用MRS培养基在37℃的条件下培养22h制备出杆菌2种子液。
1.2.2 DVS菌株的发酵工艺３株乳酸菌各自在5L发酵罐中进行发酵工艺试验。
球菌发酵实验采用的工艺流程为：将球菌种子液按照2%～3%的接菌量接到已灭菌球菌工业化液体超浓缩培养基中，调节初始pH为7.0后，在42℃的条件下发酵，发酵罐的搅拌转速为100r/min～120 r/min；杆菌1的发酵实验采用的工艺流程为：将杆菌1的种子液按照2%～3%的接菌量接到已灭菌的杆菌1工业化液体超浓缩培养基中，调节初始pH为6.2～6.4后，在37℃的条件下发酵，发酵罐的搅拌转速为100～120r/min；杆菌2的发酵实验采用的工艺流程为：将杆菌2的种子液按照2%～3%的接菌量接到已灭菌的杆菌2工业化液体超浓缩培养基中，调节初始pH为6.2～6.4后，在37℃的条件下发酵，发酵罐的搅拌转速为100～120r/min。
1.2.2.1 DVS菌株生长曲线的确定利用上述发酵工艺流程，进行3株乳酸菌菌株得生长曲线测定。
球菌每1 h 取样、杆菌1和杆菌2均每2 h取样进行活菌数的测定，绘制生长曲线。
1.2.2.2 DVS菌株的冻干将3株乳酸菌发酵后的发酵液在各自的生长曲线的最高值时取出，采用冷冻离心机在4℃20min，转速为6000r/min。
离心后分别加入各自湿菌体量2倍质量的3株乳酸菌特异性冻干保护剂，其中冻干保护剂配方见文献[ 4]。
冷冻干燥采用程序为-40℃冻干20h，冻干后利用-80℃的低温冰箱保存。
1.2.2.3 DVS菌株的生化特性分析测定DVS菌株在5L发酵罐培养过程中培养液总蛋白含量、甘油三酯含量变化情况，测定培养液中乳酸含量变化情况，具体步骤均按说明书进行操作。
实验结果均测定3个平行，然后求平均值。
1.2.2.4 DVS菌株搅拌转速的确定根据确定的最佳工艺参数及生长曲线，来确定３株菌的发酵过程中最佳搅拌速度。
球菌生长的实验基本条件为：在5L发酵罐装入3.5L增殖培养基，按3%接种量接种，在不同转速下，42℃恒温培养6h终止，分别测定活菌数。
杆菌1生长的实验基本条件为：在5L发酵罐装入3.5L增殖培养基，按3%接种量接种，在不同转速下，37℃恒温培养8h终止，分别测定活菌数。
杆菌2生长的实验基本条件为：在5L发酵罐装入3.5L增殖培养基，按3%接种量接种，在不同转速下，37℃恒温培养14h终止，分别测定活菌数。
2．结果与讨论2.1生长曲线的确定根据３株菌在5L发酵罐中各自活菌计数，绘制出各自的生长曲线。
结果如图1、图2。
图1 球菌生长曲线图2杆菌的生长曲线由图1球菌的生长曲线可知，到6h 左右活菌数达到最大值，因此发酵培养6h为球菌的最佳收获期，此时的发酵液活菌数为1.52 ×1010cfu/mL；由图2杆菌1、杆菌2的生长曲线可知, 杆菌1到8h 左右活菌数达到最大值，因此选择发酵培养8h为其最佳收获期，此时的发酵液活菌数为1.83× 109cfu/mL；杆菌2到14h 左右活菌数达到最大值，因此选择发酵培养14h为其最佳收获期，此时的发酵液活菌数为1.72×109cfu/mL。
2.2 DVS菌株的冻干效果球菌冻干后所得冻干粉的活菌数为7.12×1011cfu/g，活菌率71%；杆菌1冻干后所得冻干粉活菌数为2.10×1011cfu/g，活菌率81%；杆菌2冻干后所得冻干粉活菌数为2.45×1011cfu/g，活菌率83%。
由此可见，所获得产品的活菌数均超过1011cfu/g，活菌率均超过70%，达到国外同类产品的标准。
2.3 DVS菌株发酵培养的生化特性2.3.1球菌、杆菌1和杆菌2的代谢产物乳酸含量的变化有研究表明：球菌、杆菌1和杆菌2合成的乳酸是影响发酵液pH值的主要物质。
这与赵鑫和Shakeel UR等人的研究相一致[5～7]。
球菌、杆菌1和杆菌2的代谢产物乳酸的含量变化见图3、图4。
由图3可以看出：球菌在12h培养液中乳酸含量最高。
由图4可以看出：杆菌1在10h培养液中乳酸含量最高，杆菌2在16h培养液中乳酸含量最高，因此，3株菌合成乳酸的最大值时间均为对数生长期顶点后2到3h。
球菌、杆菌1和杆菌2在菌数达到最高值时，菌体还继续合成乳酸，2到3h后乳酸含量达到最高值，此后乳酸抑制了菌体的增长。
由图3、图4可知，球菌合成的乳酸量远远高于杆菌1和杆菌2，由此可知，球菌是合成乳酸的重要来源。
图3 球菌乳酸含量变化图4 杆菌乳酸含量变化2.2.2球菌、杆菌1和杆菌2甘油三酯的含量变化球菌、杆菌1和杆菌2培养液甘油三酯的含量变化见图5。
由图5可以看出，随着培养时间的延长，3株菌培养液中甘油三酯的积累呈越来越多的趋势，可能与菌体合成甘油三酯增多或菌体裂解释放甘油三酯有关。
