毕赤酵母表达Neuritin蛋白的纯化及鉴定

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２０１４年２月
文章编号：１００７ — ７３８３（２０１４）０１～００４７ — ０４
毕赤酵母表达Ｎｅｕｒｉｔｉｎ蛋白的纯化及鉴定
张云华，朱井玲，熊安英，单莉娅，朱美意，郑艳，郝慧星，黄瑾
重组蛋白为Ｎｅｕｒｉｔｉｎ重组蛋白。由此可知．本研究建立了一种有效的纯化方法，获得高纯度的Ｎｅｕｒｉｔｉｎ重组蛋白，为大量
制备Ｎｅｕｉｒｔｉｎ纯化蛋白，开展其功能和机制研究奠定基础。
关键词：Ｎｅｕｒｉｔｉｎ：蛋白纯化；鉴定中图分类号：Ｒ３４６文献标志码：Ａ
ＰｕｒｉｉｃｆａｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｉｆｔｉｃａｉｏｔｎｏｆＮｅｕｒｉｔｉｎＰｒｏｔｅｉｎｉｎＰｉｃｈｉａＰａｓｔｏｒｉｓ
程菌株表达Ｎｅｕｉｒｔｉｎ蛋白，采用硫酸铵盐析、Ｈｉｓ — ＴｒａｐＣｒｕｄ亲和层析等方法，对该表达产物进行纯化。纯化后的蛋白进
行ＳＤＳ — ＰＡＧＥ、ｗｅｓｔｅｒｎ — ｂｌｏｔ和生物质谱鉴定。结果显示．ＳＤＳ — ＰＡＧＥ分析显示经甲醇诱导后表达的蛋白获得了与Ｎｅｕｉｒｔｉｎ分子量理论值相符的条带．ｗｅｓｔｅｎ— ｒｂｌｏｔ分析它能够与抗表位抗体特异反应，进一步生物质谱分析证实该纯化
第ห้องสมุดไป่ตู้ ２卷
第１期
石河子大学学报（自然科学版）
ＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｈｉｈｅｚｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ）
Ｖｏ１．３２Ｎｏ．１
Ｆｅｂ．２０１４
（新疆地方与民族高发病教育部重点实验室／石河子大学医学院生物化学教研室，石河子８３２００２）
摘要：为研究重组Ｎｅｕｒｉｔｉｎ的毕赤酵母表达蛋白的纯化方法及鉴定。应用甲醇诱导ＧＳ１１５／ｐＰＩＣ９Ｋ — Ｎｅｕｒｉｔｉｎ毕赤酵母工
ｗａｓｉｎｄｕｃｔｅｄｂｙｍｅｔｈａｎｏｌｔｏｅｘｐｒｅｓｓＮｅｕｉｔｒｉｎｐｒｏｔｅｉｎ，ｗｈｉｃｈｆｕｒｔｈｅｒｐｕｉｒｉｆｅｄｂｙＡｍｏｎｉｕｍｓｕｌｆａｔｅｓａｌｔｉｎｇｏｕｔ，Ｈｉｓ－ＴｒａｐＣｒｕｄｃｏｌｕｍｎａｆｉｎｆｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｔｈｅｎｉｄｅｎｔｉｉｆｅｄｂｙＳＤＳ — ＰＡＧＥ，Ｗｅｓｔｅｎｒｂｌｏｔａｎｄｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｕｍ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｉｎｄｕｃｅｄｂｙｍｅｔｈａｎｏｌ，ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｔｈｅｒｉｇｈｔｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｐｒｏｔｅｉｎ．ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｅｓｔｓｈｏｗｅｄｔｈｅｐｕｉｆｒｉｅｄｐｒｏｔｅｉｎｈａｄｉｍｍｕｎｅｒｅａｃｔｉｏｎｗｉｔｈｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｓｐｅｃｉｉｆｃａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｆｕｒｔｈｅｒｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙａｎａｌｙｓｉｓｃｏｎｉｆｒｍｅｄｔｈａｔｔｈｅｐｕｉｆｒｉｅｄ
ＺＨＡＮＧＹｕｎｈｕａ，ＺＨＵＪｉｎｇｌｉｎｇ，ＸＩＯＮＧＡｎｙｉｎｇ，ＳＨＡＮＬｉｙａ，ＺＨＵＭｅｉｙｉ，ＺＨＥＮＧＹａｎ，ＨＡＯＨｕｉｘｉｎｇ，ＨＵＡＮＧＪｉｎ（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎｆｏｒＸｉｎｊｉａｎｇＥｎｄｅｍｉｃａｎｄＥｔｈｎｉｃＤｉｓｅａｓｅ／
ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＳｈｉｈｅｚｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｉｈｅｚｉ８３２００２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｏｐｕｉｒｆｙａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｙｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＮｅｕｒｉｔｉｎｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｉｎｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ．ＧＳｌｌＳ＆ＰＩＣ９Ｋ－ＮｅｕｉｒｔｉｎＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ

毕赤酵母分泌表达报告

实验报告毕赤酵母分泌表达报告订单号：«订单号»客户：«客__户»日期：«日__期»目录1 材料与方法 (1)1.1 菌株的保存与培养 (1)1.2 载体构建 (1)1.3 质粒电转毕赤酵母 (1)1.4 转化子筛选 (2)1.5 转化子表达小试 (4)1.6 最优转化子扩大表达 (6)1.7 蛋白鉴定与纯化 (7)2 结果与分析 (9)2.1 转化子筛选 (9)2.2 转化子表达小试 (9)2.3 最优转化子扩大表达 (10)2.4 蛋白纯化与浓度测定 (10)1．材料与方法1.1 菌株的保存与培养大肠杆菌（Eschrichia coli）菌株TOP10于LB培养液摇菌后保存成20%的甘油菌于-80℃冷冻保存。

大肠杆菌于37℃培养箱中培养。

毕赤酵母（Pichia pastoris）菌株X-33于YPD培养液摇菌后保存成25%的甘油菌于-80℃冷冻保存。

毕赤酵母于28℃培养箱中培养。

1.2 载体构建1）目的基因信号肽预测，采用SignalP 4.0和5.1预测，去除信号肽序列；2）根据毕赤酵母表达系统进行密码子优化，避开SacI酶切位点；3）基因合成至pPICZαA，目的基因紧挨着载体α-factor，C端带上6×His。

1.3 质粒电转毕赤酵母1.3.1 目的载体线性化1）按下表配制载体酶切体系：组分体积（ul）质粒（5-10 ug）6 ug10×buffer 5SacI 1 ulddH2O 补到502）37℃酶切过夜；3）琼脂糖凝胶电泳检测，以未酶切的质粒作为对照；4）检测酶切成功后，65℃ 20 min灭活。

1.3.2 线性化载体纯化回收1）按下表配置载体纯化体系：组分体积（ul）酶切产物50核酸助沉剂103 M NaAc，pH=5.2 6无水乙醇1652）-20℃静置35 min以上；3）4℃ 12000 rpm离心15 min，弃上清，此时可以观察到壁上有白色沉淀；4）加入400 ul预冷的80%乙醇重悬沉淀；5）4℃ 12000 rpm离心10 min，弃上清，开盖干燥；6）加入10 ul ddH2O溶解沉淀。

hBMP-4在毕赤酵母中的表达、纯化、活性鉴定及二聚体化研究的开题报告

hBMP-4在毕赤酵母中的表达、纯化、活性鉴定及二
聚体化研究的开题报告
毕赤酵母是一种单细胞真核生物，具有优异的表达异源蛋白的能力和强大的生物合成功能，在生命科学研究中具有广泛的应用前景。

而骨形态发生蛋白-4（BMP-4）作为一种重要的成骨细胞分化因子，与多种细胞生长、分化及组织修复等重要生物学过程密切相关，因此在生物医学领域具有重要的应用价值。

本课题将以毕赤酵母作为表达工具，通过基因克隆、重组表达、纯化等一系列技术手段，系统研究HBMP-4在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定，并进一步深入探究其在骨组织再生及修复中的作用机制。

具体实验流程包括以下几个方面：
1.基因克隆：通过PCR扩增获得HBMP-4基因，并构建表达载体。

2.重组表达：将载体转化至毕赤酵母中，利用酵母本身的合成机制表达重组蛋白。

通过Western blot等技术手段检测重组蛋白表达情况。

3.纯化：利用后续的柱层析工艺，对重组蛋白进行逐步的纯化，得到较为纯净的HBMP-4蛋白。

4.活性鉴定：利用生物学实验手段（如细胞培养、分子生物学法等），对HBMP-4蛋白的生物活性进行鉴定，确定其在细胞分化、骨组织再生等方面的作用。

5.二聚体化研究：通过分子生物学和蛋白质化学技术，研究HBMP-4蛋白的分子结构、功能性和动态的二聚体化/stim-ligation状态。

该课题的研究结果将有助于深入了解HBMP-4在生物学中的作用机制，为骨组织再生及修复的临床应用提供更加广阔的前景。

重组人Hepassocin在毕赤酵母中的分泌型表达、纯化与活性鉴定

第二章材料和方法 ............................................................................................................................ 11
2.1 材料 ............................................................................................................................................. 11
摘要......................................................................................................................................................3
2.1.1 菌株和质粒 .............................................................................................................................. 11 2.1.2 引物 .......................................................................................................................................... 11 2.1.3 工具酶及相关试剂 .................................................................................................................. 11 2.1.4 主要仪器设备 .......................................................................................................................... 11 2.1.5 层析柱及填料 ..........................................................................................................................12 2.1.6 常用试剂的配制 ......................................................................................................................13

毕赤酵母表达操作手册(PDF精译版)

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毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白综述：基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。

不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。

它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。

同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。

这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。

与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。

例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。

毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。

甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。

为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。

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毕赤酵母表达Neuritin蛋白的纯化及鉴定

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