腾飞基因肿瘤免疫微环境基因表达谱研究方案 20190115

肿瘤微环境的研究进展与治疗策略肿瘤微环境是指肿瘤周围的细胞、蛋白质、激素等物质所构成的一种复杂的环境，对于肿瘤生长、转移、治疗等方面都有着重要的影响。

肿瘤微环境中的许多因素如肿瘤相关细胞、细胞外基质、免疫细胞、血管和神经、炎症细胞等对于肿瘤的生长、进展、治疗有着至关重要的影响。

随着相关研究的进展，越来越多的治疗策略也随之出现，例如免疫治疗、靶向治疗、化疗等。

一、免疫治疗免疫治疗是目前最为热门的治疗策略，其通过调节肿瘤微环境中的免疫细胞的数量和功能来达到治疗肿瘤的效果。

具体来说，免疫治疗是指用某些物质激活机体免疫系统，提高免疫细胞对肿瘤的识别和攻击能力，从而发挥治疗肿瘤作用。

免疫治疗主要包括：免疫检查点抑制剂、白细胞介素、肿瘤溶解疫苗等，其中免疫检查点抑制剂的研究和利用是近年来最为火热的领域之一。

该类治疗药物主要通过阻断体表的免疫抑制信号通路来恢复人体对癌细胞的免疫抗性，从而达到治疗的效果。

该类治疗药物已经被广泛应用于多个恶性肿瘤的治疗中，历史性地提高了许多肿瘤患者的治疗效果。

二、靶向治疗靶向治疗是肿瘤治疗的一种新型形式，其通过针对肿瘤微环境中特定的分子靶点，以达到治疗的效果。

这种治疗方式传统的化疗、放疗等治疗方式相比拥有更高的特异性和有效性，而且可以避免由于对健康细胞的损害导致的副效应。

在肿瘤微环境的研究中，许多分子靶点在肿瘤的形成、进展等方面起到重要的作用。

例如，在肺癌的治疗中，肿瘤微环境中的EGFR等多个靶点的抑制药物被广泛应用。

不过靶向治疗仅能针对单一的靶点，对多靶点或多种致癌机制则往往无效。

三、化疗化疗是一种传统的肿瘤治疗方式，其通过给患者输注化疗药物来杀死肿瘤细胞从而达到治疗效果。

化疗主要通过使异常增殖的肿瘤细胞受到破坏，达到抑制肿瘤生长的目的。

在肿瘤微环境的研究中，已经发现许多分子和信号通路在化疗耐药和疗效评估方面具有非常重要的作用。

通过深入的细胞和分子机制的研究，科学家们致力于寻找新的治疗肿瘤的方式，并通过化疗的手段提高普通人群的生活质量。

肝癌的肿瘤微环境调控及其免疫治疗新进展肝癌是全球范围内常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率都居高不下。

近年来，随着对肿瘤生物学的深入研究，肿瘤微环境（TME）在肝癌发生、发展中的作用逐渐受到重视，同时，基于肿瘤微环境调控的免疫治疗也取得了显著的新进展，为肝癌的治疗带来了新的希望。

肿瘤微环境是指肿瘤细胞周围的细胞和细胞外基质所构成的复杂环境。

在肝癌中，肿瘤微环境包括免疫细胞、间质细胞、细胞因子、血管等多种成分。

这些成分相互作用，共同影响着肝癌的进展和治疗效果。

免疫细胞在肿瘤微环境中起着关键作用。

其中，T 细胞是抗肿瘤免疫的核心力量。

然而，在肝癌的肿瘤微环境中，T 细胞往往处于功能抑制状态。

一方面，肿瘤细胞可以通过表达某些分子，如 PDL1，与 T 细胞表面的 PD-1 受体结合，从而抑制 T 细胞的活性。

另一方面，肿瘤微环境中的抑制性细胞因子，如TGFβ、IL-10 等，也可以抑制 T 细胞的增殖和杀伤功能。

此外，调节性 T 细胞（Treg）在肝癌微环境中增多，它们通过分泌抑制性细胞因子和直接接触等方式抑制效应 T 细胞的功能，从而促进肿瘤的免疫逃逸。

间质细胞在肝癌的肿瘤微环境中也扮演着重要角色。

其中，肿瘤相关巨噬细胞（TAM）可分为 M1 型和 M2 型。

M1 型巨噬细胞具有抗肿瘤活性，而 M2 型巨噬细胞则具有促进肿瘤生长和转移的作用。

在肝癌微环境中，M2 型巨噬细胞往往占主导地位，它们可以分泌多种细胞因子和蛋白酶，促进肿瘤血管生成、细胞外基质重塑和肿瘤细胞的侵袭转移。

此外，癌症相关成纤维细胞（CAF）也是肝癌微环境中的重要成分，它们可以通过分泌胶原蛋白等细胞外基质成分，为肿瘤细胞提供生长和转移的支架，同时还可以分泌多种细胞因子，促进肿瘤的进展。

细胞因子是肿瘤微环境中的重要信号分子。

在肝癌中，一些细胞因子的异常表达与肿瘤的发生、发展密切相关。

例如，VEGF 可以促进肿瘤血管生成，为肿瘤细胞提供营养和氧气，从而促进肿瘤的生长和转移。

两篇文章带你解析肿瘤免疫微环境相关研究思路在肿瘤发生发展过程中，包括但不限于巨噬细胞、DC（dendritic cell）、中性粒细胞、B细胞、T细胞、CAF（tumor associated fibroblast）等多种细胞被招募到肿瘤细胞周围的微环境中，与ECM （extracellular matrix）等元素共同构成肿瘤免疫微环境TIME （tumor immune microenvironment）。

在TIME中的多种成分，包括T细胞、B细胞以及分泌的相关因子等虽然对肿瘤起着免疫作用，但还有许多其它成分，如细胞方面包括M2型巨噬细胞、Treg细胞、Th2细胞及MDSC （Myeloid-derived suppressor cell）等发挥着免疫抑制的作用，细胞因子方面IL-4、IL-5、IL-10、TGFβ、MMP9和VEGF等等也通过特定的机制起着促进免疫逃逸和肿瘤发生发展的作用。

在免疫的过程中，肿瘤细胞也衍生出了各种对抗免疫的机制，例减少抗原的表达，抑制DC细胞的抗原递呈能力，抑制细胞毒性T细胞的浸润等等。

在过去的十年里，虽然关于TIME的研究文章呈逐年递增的状态，TIME方向作为国自然研究的热点，提供了大量的基金支持，但鉴于TIME的复杂性以及癌症治疗的困难性、高复发率，对TIME的研究仍任重道远。

在这里，小优博士又整理了两篇近期发表的关于TIME的高分文章，分别从研究背景、主要研究结果方面分享给大家，并对相关的研究思路做了部分总结，希望对大家的科学研究起到帮助作用。

一、单细胞转录组学揭示癌症相关成纤维细胞在复发性骨肉瘤肿瘤免疫微环境中的调节作用研究背景：骨肉瘤是最常见的骨肿瘤之一，主要发生在青少年。

尽管在手术和化疗方面取得了很大的成就，但骨肉瘤患者的预后仍不理想。

复发性骨肉瘤是临床的一大挑战，复发性骨肉瘤患者预后较差。

因此，迫切需要深入探讨骨肉瘤的进展机制，加强对复发性骨肉瘤的认识。

肿瘤微环境与肿瘤免疫治疗的研究进展肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）是1979年由Lord提出的一个复杂的综合系统，它包括许多的基质细胞以及在其中传递微环境与肿瘤细胞相互信息的细胞因子。

越来越多研究证实，肿瘤的发生发展不仅是肿瘤细胞基因突变，更是突变细胞对TME的适应过程。

近年来，肿瘤免疫治疗尤其是靶向TME的免疫治疗发展迅速，2013年《Science》杂志将肿瘤免疫治疗列为年度世界十大科技进展之首[1]。

本文主要对靶向TME的肿瘤免疫治疗研究进展进行综述。

一、免疫抑制分子TME中存在多种类型的免疫抑制细胞和抑制分子，抑制机体抗肿瘤免疫效应，其中近年来免疫抑制分子的研究热点主要集中在细胞毒T淋巴细胞相关抗原（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA4）和程序性死亡受体1（programmed death1，PD-1），多种抗体药物在临床试验中取得可喜的效果。

CTLA4又称为CD152，是成熟免疫T细胞表面的跨膜受体，与CD28竞争结合APCs表面的B7分子，影响免疫过程中TCR通路信号传导，抑制T细胞活化，参与肿瘤免疫的负性调节。

Ipilimumab和Tremelimumad均为针对CTLA4的单克隆抗体，可以有效的逆转CTLA-4对效应T 细胞的抑制，同时也可阻断CTLA-4对免疫抑制细胞的激活[2]。

研究证实和单用达卡巴嗪相比较，Ipilimumab联合达卡巴嗪用于恶性黑色素瘤可以显著延长患者的2个月的中位总生存期（overall survival，OS）[3]。

2011年FDA批准Ipilimumab 用于晚期恶性黑色瘤的治疗。

后续临床研究中证实Ipilimumab联合沙莫司亭生存收益更加明显，且毒性反应可以耐受[4]。

但近期其用于转移性去势抵抗前列腺癌的Ⅲ期临床研究尽管表明有一定的有效性，但患者的OS无显著的获益[5]，因此需要进一步的研究证实。

肿瘤微环境中免疫细胞及其相关基因的研究肿瘤是一种异质性疾病，它不仅影响着肿瘤细胞本身，也牵涉到外围免疫细胞对肿瘤的反应。

越来越多的研究表明，肿瘤与免疫系统不断地互动，形成了肿瘤微环境。

在这个微环境中，存在着多种类型的免疫细胞，它们既可发挥抗肿瘤作用，也可刺激肿瘤生长和转移。

研究肿瘤微环境中免疫细胞及其相关基因的作用机制，对于发展肿瘤免疫治疗具有重要的意义。

1. 肿瘤微环境中的免疫细胞类型及其功能（1）肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）肿瘤相关巨噬细胞是肿瘤微环境中最常见的一类免疫细胞，它们来源于循环血液并在肿瘤组织中定居。

研究表明，肿瘤相关巨噬细胞可分为两种不同的亚型：M1型和M2型。

M1型具有趋化、吞噬、抗原呈递、抗肿瘤等作用，而M2型具有促血管生成、抑制T淋巴细胞功能等作用，可以刺激肿瘤的生长和转移。

（2）T细胞T细胞是体内最重要的免疫细胞之一，它们可以通过细胞间信号传递和免疫识别分子受体相互作用，识别和攻击癌细胞。

然而，肿瘤微环境的存在会抑制T细胞的免疫杀伤作用。

这主要是由于肿瘤细胞在逃避免疫攻击的过程中，可以通过表达免疫调节分子来阻止T细胞的增殖和功能。

（3）自然杀伤细胞（NK细胞）NK细胞是识别和消灭感染和肿瘤细胞的主要免疫细胞。

在肿瘤微环境中，NK细胞可以对癌细胞进行直接杀伤，并能够刺激其他免疫细胞的抗肿瘤作用。

然而，肿瘤细胞也可以通过表达免疫抑制分子来抑制NK细胞的杀伤效应，从而逃避免疫攻击。

2. 肿瘤微环境中免疫基因的研究（1）T细胞相关基因T细胞具有重要的免疫调节作用，因此，研究肿瘤微环境中的T细胞相关基因可以帮助我们更好地理解T细胞的作用机制。

目前，人们已经发现许多与T细胞功能相关的基因，例如PD-1、CTLA-4、TIM-3等。

这些基因的表达水平可以影响T细胞的活性和各种免疫调节细胞的活性。

因此，这些基因也成为抗肿瘤免疫治疗的主要靶向物。

（2）NK细胞相关基因与T细胞一样，NK细胞也具有重要的免疫调节作用。

㊃0562㊃检验医学与临床2023年9月第20卷第18期 L a b M e d C l i n,S e p t e m b e r2023,V o l.20,N o.18㊃论著㊃D O I:10.3969/j.i s s n.1672-9455.2023.18.005肺癌外周血MM P-7m R N A与肿瘤免疫微环境特征的相关性研究*梁晶,陈立军,于津生,李加丽,邓为民,王海龙天津市滨海新区大港医院肿瘤科,天津300270摘要:目的研究肺癌患者外周血基质金属蛋白酶-7(MM P-7)m R N A在肺癌发生㊁发展中的作用及其与肺癌免疫微环境改变的相关性㊂方法采用实时荧光定量P C R检测125例肺癌患者(肺癌组)外周血MM P-7m R N A水平,采用流式细胞术检测C D4+T细胞㊁C D8+T细胞㊁B细胞及N K细胞受体N K G2D比例,并与70例体检健康者(对照组)进行比较㊂结果肺癌组外周血MM P-7m R N A水平高于对照组(P<0.05)㊂不同性别㊁病理分型㊁分化程度的肺癌患者外周血MM P-7m R N A水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05)㊂ⅢB 期㊁Ⅳ期肺癌患者外周血MM P-7m R N A水平均高于Ⅰ~ⅢA期(P<0.05)㊂与对照组相比,肺癌组外周血C D4+T细胞㊁B细胞㊁N K G2D比例均明显降低(P<0.05),C D8+T细胞比例明显升高(P<0.05)㊂肺癌患者外周血MM P-7m R N A水平与C D4+T细胞㊁B细胞㊁N K G2D比例呈负相关(r=-0.190㊁-0.237㊁-0.329, P<0.05),与C D8+T细胞比例呈正相关(r=0.230,P<0.05)㊂结论 MM P-7m R N A高表达的肺癌患者呈现免疫抑制特征,并且二者交互作用,共同促进了肿瘤的发展㊁浸润㊁转移㊂关键词:基质金属蛋白酶-7m R N A;肿瘤免疫微环境;肺癌中图法分类号:R734.2文献标志码:A文章编号:1672-9455(2023)18-2650-05 P e r i p h e r a l b l o o d MM P-7m R N A a n d i t s c o r r e l a t i o n w i t h c h a r a c t e r i s t i c s o f t u m o ri m m u n e m i c r o e n v i r o n m e n t i n l u n g c a n c e r*L I A N G J i n g,C H E N L i j u n,Y U J i n s h e n g,L I J i a l i,D E N G W e i m i n,WA N G H a i l o n gD e p a r t m e n t o f O n c o l o g y,T i a n j i n B i n h a i N e w A r e a D a g a n g H o s p i t a l,T i a n j i n300270,C h i n aA b s t r a c t:O b j e c t i v e T o i n v e s t i g a t e t h e r o l e o f p e r i p h e r a l b l o o d m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e(MM P)-7m R-N A i n t h e o c c u r r e n c e a n d d e v e l o p m e n t o f l u n g c a n c e r a n d i t s c o r r e l a t i o n w i t h i mm u n e m i c r o e n v i r o n m e n t o f l u n g c a n c e r.M e t h o d s T h e l e v e l s o f p e r i p h e r a l b l o o d MM P-7m R N A i n125c a s e s o f l u n g c a n c e r(l u n g c a n c e r g r o u p)w a s d e t e r m i n e d b y R T-P C R a n d t h e p r o p o r t i o n s o f C D4+T c e l l s,C D8+T c e l l s,B c e l l s,N K c e l l r e c e p-t o r N K G2D w e r e m e a s u r e d b y t h e f l o w c y t o m e t r y,a n d t h e r e s u l t s w e r e c o m p a r e d w i t h t h o s e i n70h e a l t h y s u b j e c t s u n d e r g o i n g p h y s i c a l e x a m i n a t i o n.R e s u l t s T h e p e r i p h e r a l b l o o d MM P-7m R N A l e v e l i n t h e l u n g c a n c e r g r o u p w a s h i g h e r t h a n t h a t i n t h e c o n t r o l g r o u p(P<0.05).T h e p e r i p h e r a l b l o o d MM P-7m R N A l e v e l h a d n o s t a t i s t i c a l d i f f e r e n c e a m o n g t h e p a t i e n t s w i t h d i f f e r e n t s e x e s,p a t h o l o g i c a l t y p e s a n d d i f f e r e n t i a t i o n d e-g r e e s(P<0.05).T h e p e r i p h e r a l b l o o d MM P-7m R N A l e v e l i n t h e p a t i e n t s w i t h s t a g eⅢB a n d s t a g eⅣw a sh i g h e r t h a n t h a t i n t h e p a t i e n t s w i t h s t a g eⅠ-ⅢA(P<0.05).C o m p a r e d w i t h t h e c o n t r o l g r o u p,t h e p r o p o r-t i o n s o f p e r i p h e r a l b l o o d C D4+T c e l l s,B c e l l s,N K G2D i n t h e l u n g c a n c e r g r o u p w e r e s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d (P<0.05),w h i l e t h e C D8+T c e l l s p r o p o r t i o n w a s s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d(P<0.05).T h e p e r i p h e r a l b l o o d MM P-7m R N A l e v e l i n t h e p a t i e n t s w i t h l u n g c a n c e r w a s n e g a t i v e l y c o r r e l a t e d w i t h C D4+T c e l l s,B c e l l s, N K G2D p r o p o r t i o n(r=-0.190,-0.237,-0.329,P<0.05),a n d w a s p o s i t i v e l y c o r r e l a t e d w i t h t h e C D8+T c e l l s p r o p o r t i o n(r=0.230,P<0.05).C o n c l u s i o n L u n g c a n c e r w i t h MM P-7m R N A h i g h e x p r e s s i o n s h o w s t h e i mm u n o s u p p r e s s i v e c h a r a c t e r i s t i c s,m o r e o v e r t h e t w o i n t e r a c t s a n d j o i n t l y p r o m o t t h e d e v e l o p m e n t o f t u m o r s.K e y w o r d s:m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e-7m R N A;t u m o r i mm u n e m i c r o e n v i r o n m e n t;l u n g c a n c e r根据2020年全球癌症报告,肺癌的发病率仅次于乳腺癌,是世界上最常见的癌症死亡原因[1]㊂我国*基金项目:天津市滨海新区卫生和计划生育委员会重点科技项目(2016B WK Z007)㊂作者简介:梁晶,女,主治医师,主要从事肿瘤内科方面的研究㊂网络首发h t t p s://l i n k.c n k i.n e t/u r l i d/50.1167.r.20230801.1424.002(2023-08-01)Copyright©博看网. All Rights Reserved.肺癌的发病率㊁病死率仍居所有恶性肿瘤第一位,大约90%肺癌死亡是由于肺癌转移[2]㊂肿瘤细胞内在基因组学㊁蛋白质组学的改变决定了肺癌特质,而肿瘤微环境的改变也显著影响着肺癌的发生㊁发展,肿瘤基质细胞在肺癌侵袭㊁转移级联过程中每一个环节都有参与[3]㊂肿瘤基质细胞如肿瘤相关成纤维细胞与肿瘤免疫微环境相关性成为近年来的研究热点之一㊂肿瘤相关成纤维细胞被肿瘤细胞分泌的细胞因子激活,诱导产生大量的基质金属蛋白酶(MM P s)㊂基质金属蛋白酶-7(MM P-7)是MM P s家族中相对分子质量最小的分泌型蛋白,它可以:(1)通过降解内皮基底膜和细胞外基质,减少细胞间黏附;(2)通过促进血管生长因子的分泌,诱导血管生成;(3)通过裂解p r o MM P-2及p r o MM P-9以活化MM P-2㊁MM P-9;(4)通过促进细胞生长及抑制凋亡等途径促进肺癌的侵袭㊁转移[4]㊂另有研究证实MM P-7和热休克蛋白90在调节获得性耐药和肿瘤进展中相互作用[5]㊂但关于MM P-7对肺癌免疫微环境的影响还少见报道㊂本文通过检测肺癌患者外周血MM P-7m R N A水平,分析其与各类免疫细胞亚群的相关性,旨在为MM P-7促进肿瘤进展的机制研究提供新的思路,为肺癌免疫治疗寻求新靶点和方向㊂1资料与方法1.1一般资料选择2018年5月至2022年12月本院收治的125例确诊为肺癌的患者作为肺癌组㊂纳入标准:全部病例均具有完整的临床㊁影像学资料;经病理或细胞学检查证实且首次入院;未接受过任何相关治疗㊂排除标准:转移到肺部的其他肿瘤患者;伴有精神类疾病患者;伴有高血压㊁冠心病等心脑血管疾病,免疫系统疾病,糖尿病㊁肾功能不全引起的相关疾病等㊂另外收集同期在本院体检的70例健康人作为对照组㊂两组的年龄和性别差异无统计学意义(P>0.05),见表1㊂本研究经过本院医学伦理委员会批准㊂表1两组一般资料比较组别n年龄(xʃs,岁)性别[男/女,n(%)/n(%)]病理类型[n(%)]鳞癌腺癌小细胞癌临床分期[n(%)]Ⅰ~ⅢAⅢBⅣ肺癌组12556.93ʃ12.4180(64.00)/45(36.00)44(35.2)57(45.6)24(19.2)36(28.8)42(33.6)47(37.6)对照组7058.38ʃ10.0539(55.71)/31(44.29)------t或χ2-0.8901.295--P0.3750.255--注:-表示无数据㊂1.2试剂与仪器T r i z o l㊁Q u a n t s c r i p t R T K i t Q u a n t c D N A第一链合成试剂盒㊁R e a l M a s t e r M i x (S Y B R G r e e公司)试剂盒(天根生物科技有限公司)㊂所有引物由上海基康生物技术有限公司合成㊂兔抗人C D3-P e r C P㊁兔抗人C D4-F I T C㊁兔抗人C D8-P E㊁兔抗人C D19-P E㊁小鼠抗人C D56-F I T C㊁小鼠抗人N K G2D-P E,均购自美国B D公司;F A C S C a l i b u r流式细胞仪(美国B D公司),A B I P R I S M7000荧光定量P C R分析仪(美国A p p l i e d B i o s y s t e m s公司),B i o-P h o t o m e t e r P l u s核酸蛋白测定仪(德国E p p e n d o r f公司),全自动酶标仪(奥地利B i o c e l l公司)㊂1.3方法1.3.1外周血T细胞㊁B细胞㊁N K细胞受体N K G2D检测 B细胞检查采用双色免疫荧光染色(C D3-F I T C/C D19-P E)㊂C D4+T细胞㊁C D8+T细胞㊁N K细胞受体N K G2D检查采用三色免疫荧光染色(C D3-P e r C P/C D4-F I T C/C D8-P E,C D3-P e r C P/C D56-F I T C/N K G2D-P E)㊂根据说明书,取20μL荧光标记的单克隆抗体加入E P管,设相应的同型对照,然后加入乙二胺四乙酸(E D T A)钾盐抗凝全血100μL,混匀,孵育,冲洗㊂加入1000μL裂解液,孵育,冲洗,样品上机㊂采用流式细胞术检测C D4+T细胞㊁C D8+T 细胞㊁B细胞及N K G2D比例㊂1.3.2外周血MM P-7m R N A的检测标本的采集及R N A提取:用E D T A抗凝真空采血管采集研究对象空腹外周静脉血3m L㊂分离淋巴细胞,吸取淋巴细胞悬液置于1.5m L无菌E P管中,清洗,离心去上清液,用T r i z o l法提取总R N A㊂c D N A的合成:在20μL反应体系中取2μL/g总R N A反转录成c D N A㊂该反应体系组成如下:10ˑR T m i x2μL,o l i g o(d T)152μL,d N T P2μL,R N A2μg,Q u a n t Re v e r s e T r a n s c r i p a s e1μL,最后加入D E P C处理水补至20μL㊂37ħ温育60m i n,-20ħ保存备用㊂实时荧光定量P C R的扩增与检测:P C R反应体系为25μL,以无菌纯H2O代替D N A模板作为阴性对照㊂P C R反应体系包括:上㊁下游引物(10μm o l/L)各1.25μL,2.5ˑR e a l M a s t e r M i x/20ˑS Y B R s o l u t i o n11.25μL,模板5μL,其余用无菌去离子液补足㊂每个样品设3个复孔㊂反应条件:95ħ预变性5m i n,94ħ45s,60ħ30s,共40个循环,在A B I P R I S M7000荧光定量P C R分析仪上进行反应㊂㊃1562㊃检验医学与临床2023年9月第20卷第18期 L a b M e d C l i n,S e p t e m b e r2023,V o l.20,N o.18Copyright©博看网. All Rights Reserved.MM P -7基因及内参引物序列见表2㊂表2 MM P -7基因及内参引物序列基因引物序列MM P -F 5'-C C A A A T A G C C C A A A A T G G A C T T C -3'MM P -R5'-T G T A A T A T G C G G T A A G T C T C G A G T A T A T C -3'G A P D H -R 5'-C A T G G G T G G A A T C A T A T T G G A A C -3'G A P D H -F5'-C C A T C A A T G A C C C C T T C A T T G -3'1.4 统计学处理 采用S P S S 22.0软件进行数据分析㊂呈正态分布的计量资料以x ʃs 表示,两组间比较采用独立样本t 检验,多组间比较采用O n e -W a yA N O V A 法;采用P e a r s o n 相关进行MM P -7m R N A与C D 4+T 细胞㊁C D 8+T 细胞㊁B 细胞㊁N K G 2D 的相关性分析㊂以P <0.05为差异有统计学意义㊂2 结 果2.1 两组外周血MM P -7m R N A 水平比较 肺癌组外周血MM P -7m R N A 水平为36.420ʃ11.339,高于对照组的14.631ʃ4.858,差异有统计学意义(P <0.05)㊂2.2 不同临床资料肺癌患者外周血MM P -7m R N A 水平比较 不同性别㊁病理分型㊁分化程度的肺癌患者外周血MM P -7m R N A 水平比较,差异均无统计学意义(P >0.05)㊂不同临床分期的肺癌患者外周血MM P -7m R N A 水平比较,差异有统计学意义(P <0.05),其中ⅢB 期㊁Ⅳ期肺癌患者外周血MM P -7m R N A 水平均高于Ⅰ~ⅢA 期(P <0.05),ⅢB 期与Ⅳ期肺癌患者外周血MM P -7m R N A 水平比较,差异无统计学意义(P >0.05)㊂见表3㊂2.3 两组外周血C D 4+T 细胞㊁C D 8+T 细胞㊁B 细胞㊁N K G 2D 比例比较 与对照组相比,肺癌组外周血C D 4+T 细胞㊁B 细胞㊁N K G 2D 比例均明显降低(P <0.05),C D 8+T 细胞比例明显升高(P <0.05)㊂见表4㊂2.4 肺癌患者外周血MM P -7m R N A 水平与C D 4+T 细胞㊁C D 8+T 细胞㊁B 细胞㊁N K G 2D 比例的相关性分析 肺癌患者外周血MM P -7m R N A 水平与C D 4+T 细胞㊁B 细胞㊁N K G 2D 比例呈负相关(r =-0.190㊁-0.237㊁-0.329,P <0.05),与C D 8+T 细胞比例呈正相关(r =0.230,P <0.05)㊂见图1㊂表3 不同临床资料肺癌患者外周血MM P -7m R N A水平比较(x ʃs )临床资料nMM P -7m R N At 或FP性别0.8790.381男8037.089ʃ11.802 女4535.230ʃ10.488临床分期6.3570.002Ⅰ~ⅢA3631.216ʃ10.344 ⅢB 4237.220ʃ10.520* Ⅳ4739.691ʃ11.568*病理分型1.2480.291鳞癌4436.024ʃ11.630 腺癌5735.367ʃ10.954 小细胞癌2439.645ʃ11.586分化程度 中㊁高分化6436.352ʃ11.107-0.0670.946低分化6136.490ʃ11.669注:与Ⅰ~ⅢA 期比较,*P <0.05㊂表4 两组外周血C D 4+T 细胞㊁C D 8+T 细胞㊁B 细胞㊁N K G 2D 比例比较(x ʃs ,%)组别nC D 4+T 细胞C D 8+T 细胞B 细胞N K G 2D对照组7034.198ʃ6.14928.561ʃ6.65312.243ʃ3.53985.191ʃ6.424肺癌组12529.518ʃ6.23335.140ʃ7.4627.084ʃ2.35381.478ʃ7.696t 5.053-6.13510.9193.422P<0.001<0.001<0.0010.001注:A 表示MM P -7m R N A 与C D 4+T 细胞的相关性;B 表示MM P -7m R N A 与C D 8+T 细胞的相关性;C 表示MM P -7m R N A 与B 细胞的相关性;D 表示MM P -7m R N A 与N K G 2D 的相关性㊂图1 肺癌患者外周血MM P -7m R N A 水平与C D 4+T 细胞㊁C D 8+T 细胞㊁B 细胞㊁N K G 2D 比例的相关性散点图3 讨 论肿瘤微环境包括肿瘤细胞㊁细胞外基质㊁成纤维细胞㊁内皮细胞㊁免疫细胞㊁微血管,以及浸润其中的信号分子[6]㊂肺癌微环境中免疫细胞的功能及其信㊃2562㊃检验医学与临床2023年9月第20卷第18期 L a b M e d C l i n ,S e pt e m b e r 2023,V o l .20,N o .18Copyright ©博看网. All Rights Reserved.号交流与肿瘤微环境有关时,被称为肺癌免疫微环境[7]㊂MM P s是维持肺癌细胞外基质平衡最重要的一类蛋白水解酶,目前人类有23种MM P s家族成员,其中MM P-7(基质溶解素)的编码基因定位于人11q21~q22,其c D N A长1094b p,由267个氨基酸㊁4个MM P s特征区域组成,基质中的蛋白多糖和糖蛋白是其发挥作用的主要底物,因MM P-7缺乏c端血红蛋白结构域,结构精简,能够特异性识别底物的结构部分很少,所以MM P-7能够降解几乎所有的细胞外基质[8]㊂另有研究表明,MM P-7通过切割细胞生长因子㊁细胞表面受体㊁细胞黏附分子等途径,改变肿瘤细胞生物学行为,同时,被切割掉的这些因子可以诱导MM P-7调节抗凋亡细胞的产生,反过来促进肿瘤细胞繁殖,使肿瘤具有更强的侵袭性[9]㊂有研究证实MM P-7高表达于肺癌上皮组织[4]㊂本研究通过实时荧光定量P C R对肺癌患者外周血MM P-7m R N A 进行定量检测,结果发现:肺癌患者外周血MM P-7 m R N A水平升高,ⅢB期㊁Ⅳ期肺癌患者外周血MM P-7m R N A水平明显高于Ⅰ~ⅢA期,间接证明MM P-7在肺癌侵袭㊁转移过程中发挥的作用及潜在的临床意义㊂提示外周血MM P-7m R N A可作为肺癌诊断和预后判断的肿瘤标志物,MM P-7有望成为肺癌治疗的新靶点㊂本研究结果显示:与对照组相比,肺癌组外周血C D4+T细胞㊁B细胞㊁N K G2D比例明显降低(P<0.05),C D8+T细胞比例明显升高(P<0.05),提示肺癌微环境处于免疫抑制状态㊂有研究发现,黑色素瘤中的肿瘤相关性成纤维细胞中MM P s㊁转化生长因子(T G F)-β㊁白细胞介素(I L)-6㊁I L-10㊁血管内皮生长因子和细胞程序性死亡-配体1在低氧条件下表达和分泌增加,而这些蛋白质组学的变化加强了肿瘤相关性成纤维细胞对T细胞介导的细胞杀伤的抑制作用[10]㊂由于MM P s家族的蛋白酶活性使N K G2D从癌细胞表面脱落产生可溶性N K G2D,导致肿瘤细胞表面N K G2D下调,介导肿瘤免疫逃逸[11]㊂MM P-7会让s y n d e c a n-1/C X C L1蛋白质复合体脱落,脱落的C X C L1会趋化并活化肿瘤相关中性粒细胞,从而产生免疫抑制微环境[12]㊂本研究结果显示:肺癌患者外周血MM P-7m R N A水平与C D4+T细胞㊁B细胞㊁N K G2D比例呈负相关,与C D8+T细胞比例呈正相关㊂这间接提示MM P-7可能调节免疫细胞的表达,与肺癌免疫微环境相关,与以往研究结论一致㊂说明MM P-7不但具有降解细胞外基质的功能,为肿瘤侵袭铺平道路,而且MM P-7还调节与炎症㊁血管生成㊁细胞增殖㊁凋亡和迁移有关的几种癌症信号传导途径,具有独特的免疫调节能力,参与介导肿瘤免疫逃逸㊂另有基础研究发现,c MM P-7D N A疫苗免疫在B A L B/c小鼠中诱导了强烈的C D8+细胞毒性T细胞和T h1型反应,并产生高水平的γ-干扰素[13]㊂这项实验从另一个角度也证实了MM P-7与肿瘤免疫相关㊂另有研究表明,许多生长因子㊁细胞因子如I L-6㊁T G F-β㊁β-干扰素可调节MM P s的表达,这些生长因子㊁细胞因子与免疫细胞也交互联系,因此免疫细胞和基质细胞的募集㊁激活㊁重新编程是肿瘤微环境中免疫细胞相互调控和交流的结果[14],结合本研究结果,推断免疫细胞可能通过细胞因子传递信息或者间接激活MM P-7相关信号通路促进其表达㊂综上所述,本研究证实了肺癌患者存在肿瘤免疫抑制微环境特征,发现MM P-7m R N A可能参与肺癌免疫微环境的形成,同时肺癌免疫抑制微环境也可能激活了MM P-7m R N A的表达,为MM P-7促进肺癌转移的机制研究提供了新方向,MM P-7有望成为肺癌免疫治疗的新靶点㊂参考文献[1]F E R L A Y J,C O L OM B E T M,S O E R J OMA T A R AM I,e ta l.C a n c e r s t a t i s t i c s f o r t h e y e a r2020:a n o v e r v i e w[J].I n tJ C a n c e r,2021,149(4):778-789.[2]G A O S G,L I N,WA N G S H,e t a l.L u n g c a n c e r i n p e o-p l e's r e p u b l i c o f C h i n a[J].J T h o r a c O n c o l,2020,15(10): 1567-1576.[3]J I A O Y,L I Y Q,L I U S Y,e t a l.I T G A3s e r v e s a s a d i a g-n o s t i c a n d p r o g n o s t i c b i o m a r k e r f o r p a n c r e a t i c c a n c e r[J].O n c o T a r g e t s T h e r,2019,12:4141-4152.[4]L I A O H Y,D A C M,L I A O B,e t a l.R o l e s o f m a t r i x m e t-a l l o p r o t e i n a s e-7(MM P-7)i n c a n c e r[J].C l i n B i o c h e m,2021,92:9-18.[5]K UMA R P,S I R I P I N I S,S R E E D HA R A S.T h e m a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e7(MM P7)l i n k s H s p90c h a p e r o n e w i t ha c q u i r e d d r u g61r e s i s t a n c e a n d t u m o r m e t a s t a s i s[J].C a n c e r R e p(H o b o k e n),2022,5(12):e12.[6]WO N G K Y,C H E U N G A H,C H E N B,e t a l.C a n c e r-a s-s o c i a t e d f i b r o b l a s t s i n n o n s m a l l c e l l l u n g c a n c e r:f r o mm o l e c u l a r m e c h a n i s m s t o c l i n i c a l i m p l i c a t i o n s[J].I n t JC a n c e r,2022,151(8):1195-1215.[7]L I D,Y U H,HU J,e t a l.C o m p a r a t i v e p r o f i l i n g o f s i n g l ec e l l t r a n s c r i p t o m e r e v e a l s h e t e r o g e n e i t y o f t u m o r m i c r o-e n v i r o n m e n t b e t w e e n s o l i d a n d a c i n a r l u n g a d e n o c a r c i n o-m a[J].J T r a n s l M e d,2022,20(1):423.[8]A L A S E E M A,A L HA Z Z A N I K,D O N D A P A T I P,e t a l.M a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e s:a c h a l l e n g i n g p a r a d i g m o fc a n c e r m a n a g e m e n t[J].S e m i n C a n c e r B i o l,2019,56:100-115.[9]T H I O L L O Y S,H A L P E R N J,H O L T G E,e t a l.O s t e o c l a s t-d e r i v e d m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e-7,b u t n o t m a t r i x m e t a l l o-p r o t e i n a s e-9,c o n t r i b u t e s t o t u m o r-i n d u c e d o s t e o l y s i s[J].C a n c e r R e s,2009,69(16):6747-6755.(下转第2658页)㊃3562㊃检验医学与临床2023年9月第20卷第18期 L a b M e d C l i n,S e p t e m b e r2023,V o l.20,N o.18Copyright©博看网. 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[收稿日期]2023-03-20　[修回日期]2023-09-04[基金项目]安徽省高校自然科学研究重点项目(KJ2019A1095)[作者简介]刘弘飞(1999-),男,硕士研究生.[通信作者]胡知齐,硕士,主任医师.E⁃mail:ahyxhzq@[文章编号]1000⁃2200(2024)03⁃0307⁃06㊃临床医学㊃乳腺癌组织中STING 和CD68的表达及其临床意义刘弘飞1,2,胡金龙2,彭俊斌2,胡知齐1,2(1.蚌埠医科大学研究生院,安徽蚌埠233030;2.安徽省第二人民医院普外科,安徽合肥230041)[摘要]目的:探讨干扰素基因刺激因子(STING)和CD68在乳腺癌组织中的表达及其临床意义㊂方法:采用免疫组织化学SP 法检测83例乳腺癌病人癌组织及其癌旁组织中STING 和CD68的表达情况,分析上述两种蛋白的表达与乳腺癌病人临床病理参数㊁临床预后之间的关系,并结合TGCA 数据库进行生物信息分析两种蛋白表达情况的相关性及其代表的cGAS⁃STING 信号通路于肿瘤相关巨噬细胞的相关性㊂结果:STING 蛋白在乳腺癌组织中的阳性表达率为24.1%(20/83),低于癌旁组织中的39.7%(33/83)(P <0.05),其表达情况与病人的HER⁃2阳性率㊁分子分型相关(P <0.05)㊂CD68蛋白在乳腺癌组织中的阳性表达率为69.8%(58/83),高于癌旁组织中的39.7%(33/83)(P <0.01),其表达情况与病人的分子分型㊁TNM 分期㊁淋巴结转移相关(P <0.05)㊂STING 蛋白表达水平与病人中位生存期相关,高表达组中位OS 为42个月(95%CI :34.263~49.458),STING 低表达组中位OS 为19个月(95%CI :17.614~24.683),差异有统计学意义(χ2=6.25,P <0.05)㊂结合生物信息分析,STING 蛋白表达水平与CD68表达水平呈正相关关系(Kappa =0.241,r =0.636,P <0.01)㊂乳腺癌中STING 表达水平与包括巨噬细胞在内的各种免疫细胞浸润密切相关,并且与巨噬细胞M1/M2极化标志物表达水平呈正相关关系㊂结论:乳腺癌病人癌组织中STING 蛋白表达降低,CD68蛋白表达升高,两者可能共同参与乳腺癌的进展,从cGAS⁃STING 信号通路活化可能有助于TAMs 浸润及极化,STING 激动剂有望成为TAMs 调控和增强免疫治疗响应性的有效手段㊂[关键词]乳腺肿瘤;肿瘤微环境;干扰素基因刺激因子;CD68[中图法分类号]R 392.31 [文献标志码]A DOI :10.13898/ki.issn.1000⁃2200.2024.03.006Expression and clinical significance of STING and CD68in breast cancer tissuesLIU Hongfei 1,2,HU Jinlong 2,PENG Junbin 2,HU Zhiqi 1,2(1.School of Graduate ,Bengbu Medical University ,Bengbu Anhui 233030;2.Department of General Surgery ,The Second People′s Hospital of Anhui ,Hefei Anhui 230041,China )[Abstract ]Objective :To investigate the expression and clinical significance of stimulator of interferon gene(STING)and CD68in breast cancer tissues.Methods :Immunohistochemical SP method was used to detect the expression levels of STING and CD68in cancer tissues and adjacent tissues of 83breast cancer patients.The relationship between the expression of two proteins and clinicopathological parameters,clinical prognosis of breast cancer patients were analyzed.The correlations of the expression between the two proteins,and between cGAS⁃STING signaling pathway and tumor⁃associated macrophages were analyzed using the biological information analysis ofTGCA database.Results :The positive expression rate of STING protein in breast cancer tissues was 24.1%(20/83),which was lower than that in adjacent tissue[39.7%(33/83),P <0.05],and correlated with the HER⁃2positive rate and molecular typing of patients(P <0.05).The positive expression rate of CD68in breast cancer tissues was 69.8%(58/83),which was higher than that in adjacent tissue [39.7%(33/83),P <0.05],and correlated with the TNM stage,lymph node metastasis and molecular typing of patients (P <0.05).The expression level of STING protein was correlated with the median survival of patients.The median OS in the high⁃expression group was 42months (95%CI :34.263-49.458),the median OS in the low⁃expression group was 19months (95%CI :17.614-24.683),and the difference of which was statistically significant (χ2=6.25,P <0.05).The results of biological information analysisshowed that the expression level of STING protein was positively correlated with the CD68expression level (Kappa =0.241,r =0.636,P <0.01).The expression level of STING in breast cancer was closely related to the infiltration of various immune cells,including macrophages,and positively correlated with the expression level of M1/M2polarization markers in macrophages.Conclusions :The expression of STING protein decreases,and the CD68protein increases in the cancer tissues of breast cancer patients,both of which maybe involved in the progression of breast cancer.Activation of the cGAS⁃STING signaling pathway may contribute to the infiltration andpolarization of TAMs,and STING agonists are expected to become an effective means to regulate TAMs and enhance the response to immunotherapy.[Key words]breast neoplasms;tumor microenvironment;stimulator of interferon gene;CD68 最新WHO全球癌症流行病学调查研究显示[1],乳腺癌已取代肺癌成为全球最高发的癌症,并且是导致女性病人癌症因素死亡人数最多的恶性肿瘤,需引起临床医生的高度重视㊂肿瘤微环境(TME)与乳腺癌发生㊁发展密切相关,其中,肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)浸润是乳腺癌免疫微环境改变的重要组成部分,白细胞分化抗原分子68(CD68)被认为是TAMs活化㊁浸润的主要标志物之一,研究乳腺癌TAMs浸润情况及可能的调控手段,对于乳腺癌诊断和治疗具有积极意义[2]㊂干扰素基因刺激因子(STING)是cGAS⁃STING信号通路的核心调节分子,近年来,关于其在恶性肿瘤免疫微环境中发挥调节作用的相关研究报道越来越多,其表达与泛肿瘤预后及免疫治疗响应性密切相关[3]㊂因此, STING信号通路能够逐渐成为研发TME免疫调节剂的热门靶点[4]㊂目前,关于cGAS⁃STING信号通路是否参与调控乳腺癌TAMs浸润鲜有文献报道㊂因此,我们通过免疫组织化学(IHC)检测乳腺癌及其癌旁组织中cGAS⁃STING信号通路关键蛋白STING和TAMs主要标志物CD68的表达,分析这两种蛋白的表达与病人临床病理参数之间的关系,结合癌症基因组图谱(TCGA)数据库进行分析,探讨STING与CD68表达㊁巨噬细胞浸润相关性,为临床诊疗提供参考㊂现作报道㊂1　材料与方法1.1　材料　本研究用于IHC实验的主要试剂包括:无水乙醇㊁二甲苯㊁包埋石蜡㊁中性树脂,均购自中国国药集团;苏木素购自美国Sigma公司;anti⁃STING抗体㊁山羊抗兔二抗均购自美国CST公司;重组anti⁃CD68抗体购自英国Abcam公司㊂DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒购自中国碧云天公司㊂1.2　方法　1.2.1　临床资料　收集2014年7月至2018年10月在安徽省第二人民医院普通外科住院接受乳腺癌改良根治术的乳腺癌病人的临床资料㊂纳入标准:经病理检查证实为乳腺癌者;能够获取完整的临床㊁病理㊁组织样本资料者㊂排除标准:资料不全者;合并其他恶性肿瘤者;术前行新辅助治疗者㊂经筛选,共入组83例,均为女性,年龄25~79岁,其中,参考NCCN乳腺癌指南[5],肿瘤TNM分期:Ⅰ期5例,Ⅱ期64例,Ⅲ期14例;分子分型:LuminaA型26例, LuminaB型34例,人表皮生长因子受体⁃2(HER⁃2)阳性8例,三阴性乳腺癌(TNBC)15例㊂所有入组病人均签署知情同意书,本研究经医院伦理委员会批准㊂1.2.2　IHC　采用SP法㊂常规进行包埋㊁脱蜡等工作并阻断过氧化物酶进行封闭;滴加经稀释的一抗(STING与CD68,稀释比例均为1∶1000),后于4℃湿性环境中孵育过夜㊂PBS冲洗㊁吸干后滴加HRP标记的山羊抗兔二抗,37℃孵育20min㊂再次PBS冲洗㊁吸干后滴加新鲜配制的DAB显色液㊂再进行复染㊁脱水㊁封片及拍照镜检㊂镜下见STING 蛋白和CD68蛋白在乳腺癌组织中主要定位于细胞质,呈棕黄色颗粒㊂1.2.3　IHC结果判定　IHC结果需综合着色深度和阳性细胞数比率来评价㊂着色深度评价标准如下:基本不着色,0分;黄色,1分;棕黄色,2分;棕褐色,3分㊂阳性细胞数比率评价标准如下:随机选取5个视野观察并记录阳性细胞数占总细胞数的比率,取其平均值,≤5%,0分;>5%~25%,1分;> 25%~50%,2分;>50%~75%,3分;>75%,4分;着色深度分数×阳性细胞数比率为最终得分,≥1为阳性,<1为阴性㊂1.2.4　随访资料　所有本组病人术后常规进行门诊随访,以病人术后出院日期为随访起始时间,截至本文投稿时间,随访2~5年不等㊂按STING表达水平进行分组,比较各组内生存指标差异㊂所关注生存指标为总生存期(OS),指从术后随访开始至因任何原因引起死亡的时间,对于失访者将最后一次随访时间计为死亡时间,按月计㊂1.2.5　生物信息学分析　为进一步研究cGAS⁃STING信号通路与TAMs浸润的关系,进行生物信息学分析㊂首先,通过TCGA数据库(https:// /)下载BRCA临床数据和相应的基因组mRNA芯片表达谱数据㊂然后,采用LI 等[6]在线数据处理系统(https://cistrome. shinyapps.io/timer/)进行STING表达与巨噬细胞浸润相关性等数据分析㊂1.3　统计学方法　采用χ2检验㊁t 检验和相关分析㊂2　结果2.1　乳腺癌组织及癌旁组织中STING 蛋白和CD68蛋白的表达情况　纳入本组研究的83例乳腺癌病人,其癌组织中STING 蛋白阳性表达为20例(20/83,24.1%),癌旁组织中为33例(33/83,39.7%),2组间阳性表达率差异有统计学意义(χ2=4.68,P <0.05),癌组织低于癌旁组织㊂癌组织中CD68阳性表达为58例(58/83,69.8%),癌旁组织中为32例(32/83,38.5%),2组间阳性表达率差异有统计学意义(χ2=16.41,P <0.01),癌组织高于癌旁组织(见图1)㊂2.2　乳腺癌组织中STING 蛋白和CD68蛋白表达与病人临床病理参数的关系　纳入本组研究的83例乳腺癌病人,其STING 蛋白阳性表达与其HER⁃2阳性率㊁Lumina 分型之间有相关性(P <0.05);与雌激素受体(ER)阳性率㊁孕激素受体(PR)阳性率㊁TNM 分期㊁淋巴结转移之间无相关性(P >0.05)㊂CD68蛋白阳性表达情况与其Lumina 分型㊁TNM 分期㊁淋巴结转移呈现显著相关关系(P <0.05);与ER 阳性率㊁PR 阳性率㊁HER⁃2阳性率之间无相关性(P >0.05)(见表1)㊂2.3　乳腺癌组织中STING 蛋白和CD68蛋白表达情况的相关性分析　应用Kappa 一致性检验对本组数据进行分析,其结果显示,本组研究资料中,STING 蛋白与CD68蛋白的表达呈正相关关系(Kappa =0.241,P <0.01)㊂应用TIMER 在线数据库针对TGCA 数据库进行分析,STING 蛋白与CD68蛋白的表达呈明显正相关关系(r =0.636,P <0.01)㊂2.4　STING 蛋白表达与乳腺癌TME 免疫细胞浸润及巨噬细胞标志物的关系　应用TIMER 在线数据库针对TGCA 数据库进行分析㊂STING 表达与乳腺癌及其各亚型的免疫微环境中巨噬细胞㊁B 细胞㊁CD4+T 淋巴细胞㊁CD8+T 淋巴细胞㊁树突状细胞浸润情况普遍具有正相关性,说明cGAS 信号通路深度参与乳腺癌免疫微环境调控㊂其中,TGCA 乳腺癌整体队列(1095例)STING 表达水平与巨噬细胞浸润呈正相关关系(P <0.01);各分子亚型中,LuminaA +B 型乳腺癌病人,STING 表达水平与巨噬细胞浸润呈正相关关系(P <0.05),TNBC 病人STING 表达水平与巨噬细胞浸润呈正相关关系(P <0.01),HER⁃2阳性病人STING 表达水平与巨噬细胞浸润呈无明显相关性(P >0.05)(见表2)㊂表1　乳腺癌病人临床病理参数与STING ㊁CD68蛋白阳性表达之间的关系(n ) 临床病理参数STING 阳性 阴性 χ2PCD68 阳性 阴性 χ2P年龄/岁　M (P 25,P 75)47(34,60)48(38,58)0.47△>0.0546(37,56)48(36,60)0.57△>0.05ER　阳性　阴性9113726 1.16>0.0523351312 1.08>0.05PR 阳性　阴性101033300.03>0.0533251015 1.99>0.05HER⁃2　阳性　阴性41638259.87<0.01273115101.25>0.05续表1临床病理参数STING 阳性 阴性 χ2PCD68 阳性 阴性 χ2PLumina 分型　LuminaA 型1251214　LuminaB 型　HER⁃2阳性型13121712.83<0.012856311.63<0.01TNBC 型510132TNM 分期　Ⅰ期2314　Ⅱ期14500.94>0.0547177.93<0.05　Ⅲ期410122淋巴结转移　有　无13732250.48>0.0536229164.78<0.05 △示u c 值　表2　STING 蛋白表达与乳腺癌TME 免疫细胞浸润间的相关系数(TIMER 分析)免疫细胞BRCA CorBRCA⁃Basal CorBRCA⁃Her2CorBRCA⁃Luminal Cor肿瘤纯度0.398**-0.500**-0.395**0.385**巨噬细胞0.306**0.308**0.0760.342**B 细胞0.160**0.359**0.288*0.201**CD8+T 细胞0.325**0.435**0.2440.340**CD4+T 细胞0.419**0.506**0.2090.389**中性粒细胞0.414**0.499**0.1600.488**树突状细胞0.405**0.582**0.2630.435**样本量(n )109519182787 *P <0.05,**P <0.01㊂STING 蛋白的Gene Symbol 为TMEM173 再进一步分析STING 表达与乳腺癌中巨噬细胞亚型浸润的相关性,采用巨噬细胞标志物进行分类,TAMs 以CD68㊁CCL2㊁IL10标识,M1型巨噬细胞以NOS2㊁IRF5㊁PTGS2标识㊁M2型巨噬细胞以CD163㊁VSIG4㊁MS4A4A 标识,分别比较STING 表达与各标志物的相关性㊂TGCA 数据库整体乳腺癌队列,STING 表达与各标志物呈正相关关系(P <0.05),LuminaA +B 型乳腺癌病人,STING 表达与各标志物呈正相关关系(P <0.05),TNBC 病人㊁HER⁃2阳性病人,STING 表达与各标志物无明显相关性(见表3)㊂2.5　病人随访情况　对83例乳腺癌病人术后进行密切随访,所有病人失访2例,存活53例,死亡28例,其中因乳腺癌死亡25例;复发46,未复发37例㊂全组病人中位OS 为25.5个月,其中,STING 高表达组中位OS 为42个月(95%CI :34.263~49.458),STING 低表达组中位OS 为19个月(95%CI :17.614~23.683)㊂2组间差异有统计学意义(χ2=6.25,P <0.05)㊂　表3　STING 蛋白表达与乳腺癌TME 中各类巨噬细胞标志物的相关系数(r )巨噬细胞亚型分子标志物整体队列CorLumina 队列CorHER⁃2队列CorTNBC 队列CorTAMsCCL20.336**0.381**0.2120.573**CD680.438**0.408**0.352**0.691**IL100.406**0.365**0.329**0.604**M1NOS20.185**0.221**0.237**0.089IRF50.391**0.324**0.476**0.580**PTGS20.291**0.368**0.1670.108M2CD1630.382**0.357**0.325**0.638**VSIG40.382**0.359**0.2310.567**MS4A4A 0.401**0.331**0.306*0.617** *P <0.05,**P <0.013　讨论 乳腺癌是女性最常见和最容易导致癌症相关死亡的恶性肿瘤之一[1],国内外临床诊疗指南对于乳腺癌病人进行TNM 分期和分子分型有助于其整体治疗方案的选择和预后的判断[5,7]㊂但是在实际临床工作过程中却存在一定的局限性,特别是随着以免疫检查点抑制剂(ICIs)为代表的肿瘤免疫治疗的发现和兴起,为调节机体免疫功能正常化,能够更加准确地进行免疫微环境分类以及如何研发新的治疗方法提高免疫治疗效果将会是新的难题[8]㊂TME 与恶性肿瘤免疫分型及ICIs 响应性密切相关,检测及评估TME 有助于指导病人进行恶性肿瘤的精准治疗[9]㊂TAMs 是TME 重要的组成部分,一般以CD68为重要的标志物,其表达与乳腺癌等恶性肿瘤的进展及不良预后密切相关[10]㊂本研究中,乳腺癌病人癌组织中CD68阳性表达率高于癌旁组织,且其表达情况与病人的TNM分期㊁分子分型㊁淋巴结转移等临床指标相关,这与国内外相关研究结果基本一致,反映出TAMs作为乳腺癌病人预后评估指标及提高免疫治疗效果的干预指标的可行性㊂TAMs在肿瘤组织内充当着 多面手”的角色,根据功能表型的不同,TAMs在肿瘤早期可分化为M1型发挥吞噬㊁识别肿瘤细胞的作用,肿瘤进展期也可分化为M2型分泌大量细胞因子,促进乳腺癌进展,帮助肿瘤细胞获得耐药性[11]㊂也有观点认为先天性免疫系统功能缺失,在肿瘤早期形成阶段,导致癌细胞基因突变累积及DNA受损修复机制的缺失,可能与TAMs早期浸润㊁识别相关[12]㊂而cGAS⁃STING作为经典的先天性免疫应答信号通路,被证实与肿瘤发生㊁发展有着密切的联系㊂其核心调节分子是存在于细胞质内的STING,在肿瘤细胞发生的早期,自身DNA损伤出现核泄漏时,发挥类似于 哨兵”的识别作用,并激活下游通路,产生Ⅰ型干扰素(INF⁃β),达到募集并激活免疫细胞㊁驱化多种催化因子表达的作用,进行免疫调节㊂多种肿瘤组织内STING蛋白处于低表达状态,可能与其参与免疫抑制及免疫逃逸相关[13]㊂本研究中,乳腺癌组织中的STING蛋白阳性表达低于癌旁组织,其表达水平与病人整体预后密切相关,高表达STING的病人整体生存率显著高于低表达组,可能与STING发挥免疫识别作用有关㊂为了进一步分析STING信号通路对于免疫微环境的影响,课题组结合TGCA数据库进行生物信息分析,发现在乳腺癌中,STING表达水平与几乎各类免疫细胞浸润都有关系,是进行免疫微环境调控的理想靶点㊂并且,其表达水平与巨噬细胞浸润密切尤为相关,在不同分子表型的乳腺癌中STING的表达与巨噬细胞的浸润及分化呈现出明显的差异,在特定类型的乳腺癌,如TNBC㊁HER⁃2阳性乳腺癌组织中,STING蛋白水平表达甚至能够与TAMs是否发生M1/M2型极化密切相关㊂这些研究结果均反映出STING信号通路的活化可能深度参与肿瘤微环境中TAMs的浸润及极化㊂STING激动剂的研发是免疫治疗领域研究的热点,多种核苷酸类药物和非核苷酸类药物被开发作为免疫治疗㊁增敏药物或免疫佐剂,能够发挥很好的抗肿瘤和协同抗肿瘤效果[4]㊂但是,目前关于STING激动剂是否能够通过调控TAMs浸润及M1/ M2型巨噬细胞极化而发挥免疫调节作用鲜有报道㊂TAMs已经被证实与癌症进展,特别是早期TME改变密切相关[14],但其功能调控极其复杂,难以为免疫调节提供理想的靶点[15]㊂虽然cGAS⁃STING信号通路不是TAMs的专属调控通路,但本研究通过生物信息分析㊁IHC及临床病理分析,充分验证了STING信号通路参与TAMs调控的可能性,以期为后续STING激动剂应用于乳腺癌,特别是以TAMs 为目标的,免疫微环境调控提供一定的理论和实践支持,相关干预试验工作有尝试研究的价值㊂综上所述,本研究通过生物信息分析㊁IHC㊁临床病理分析等多种方法,研究了cGAS⁃STING信号通路可能参与肿瘤相关局势细胞的浸润及极化, STING蛋白及CD68蛋白的表达对于评价肿瘤免疫学分型及指导乳腺癌治疗和预后判断均具有一定的参考价值㊂但本研究样本量较小,为回顾性分析,证据等级较低,需要进行后续随机对照研究或大样本调查获得更高的临床证据支持㊂[参考文献][1]　SUNG H,FERLAY J,SIEGEL RL,et al.Global Cancer Statistics2020:GLOBOCAN Estimates of Incidence and MortalityWorldwide for36Cancers in185Countries[J].CA Cancer JClin,2021,71(3):209.[2]　PAN Y,YU Y,WANG X,et al.Tumor⁃associated macrophages intumor immunity[J].Front Immunol,2020,11:583084. [3]　AN X,ZHU Y,ZHENG T,et al.An analysis of the expression andassociation with immune cell infiltration of the cGAS/STING pathwayin pan⁃cancer[J].Mol Ther Nucleic Acids,2019,14:80. [4]　GARLAND KM,SHEEHY TL,WILSON JT.Chemical andbiomolecular strategies for STING pathway activation in cancerimmunotherapy[J].Chem Rev,2022,122(6):5977. [5]　GRADISHAR WJ,ANDERSON BO,ABRAHAM J,et al.BreastCancer,Version3.2020,NCCN Clinical Practice Guidelines inOncology[J].J Natl Compr Canc Netw,2020,18(4):452. 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肿瘤微环境的调控研究及治疗策略肿瘤作为一种严重威胁人类健康的疾病，一直以来都是医学领域研究的重点之一。

而在肿瘤的治疗中，肿瘤微环境的调控也逐渐成为了一个重要的研究方向。

本文将主要从以下几个角度进行介绍。

一、肿瘤微环境的概念和组成肿瘤微环境（TME）是指包括肿瘤细胞、免疫细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞和其他细胞在内的细胞外基质（ECM）和细胞因子在肿瘤周围的三维结构体系。

它们之间相互作用，共同影响肿瘤发展和转移。

TME由多种不同细胞组成，其中包括肿瘤细胞、成纤维细胞、免疫细胞和其他细胞类型。

肿瘤细胞在TME中起主导作用，其代谢产物和分泌产物能影响整个TME的环境。

成纤维细胞是一种负责产生结缔组织的细胞，其在TME中有重要作用。

免疫细胞包括巨噬细胞、T细胞、B细胞、树突细胞和NK细胞等，对于控制肿瘤发展和转移至关重要。

此外，ECM和多种细胞因子也是构成TME的重要成分。

二、TME对肿瘤发展的影响TME不仅能够刺激肿瘤细胞的增长、生存和转移能力，同时还能够影响肿瘤的治疗效果。

例如，TME中存在的成纤维细胞和它们产生的纤维蛋白等能够形成肿瘤结构，影响肿瘤细胞的局部环境和扩散能力。

TME中的免疫细胞如T细胞和巨噬细胞等则具有免疫敏感性，可产生细胞毒性，从而对肿瘤细胞产生杀伤作用，从而影响肿瘤治疗效果。

三、调控TME的策略为了能够更好地阻止肿瘤的发展和转移，调控TME也成为了治疗肿瘤的重要策略之一。

该策略在以下几个方面得到了研究和应用。

1. 免疫检查点抑制剂免疫检查点抑制剂对 TME中的免疫细胞具有重要作用。

通过抑制某些免疫抑制剂的活性，可以激发T细胞的激活，从而增强其对肿瘤细胞的杀伤作用，从而提高治疗效果。

2. 肿瘤相关细胞因子调节肿瘤相关细胞因子可以影响TME中的细胞互动，从而影响肿瘤细胞的生长、扩散和转移。

通过这些因子的调节，可以对TME 中的细胞做出有效的干预，从而达到治疗肿瘤的目的。

3. 肿瘤血管生成抑制剂TME中的血管生成是促进肿瘤增长和转移的重要因素之一。

专利名称：一种人的AIMP2突变蛋白及其应用
专利类型：发明专利
发明人：张耀洲,吴玉乾,冯建华,李冬梅,张树军,陈玉皎,王文雅
申请号：CN201810957713.5
申请日：20180822
公开号：CN109206498A
公开日：
20190115
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种人的AIMP2突变蛋白及其应用，将若干肺癌、卵巢癌患者作为研究病例，对病例进行基因检测并分析，确定出人的AIMP2的突变蛋白，根据该人的AIMP2突变蛋白制备基因芯片、单克隆抗体和ELISA试剂盒，为肺癌、卵巢癌的基因诊断提供指引作用，为实现肺癌、卵巢癌的诊断和治疗提供科学基础。

申请人：天津市湖滨盘古基因科学发展有限公司
地址：300300 天津市东丽区东丽湖景湖科技园4号楼
国籍：CN
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肿瘤微环境发育的基本概念和分子生物学机制肿瘤微环境是指肿瘤细胞周围的组织和细胞，包括免疫细胞、内皮细胞、纤维细胞、血管、细胞外基质等因素，以及与肿瘤互动的分子和细胞信号通路。

肿瘤微环境是肿瘤发育和进展的重要组成部分，与预后有密切关系。

肿瘤微环境的免疫细胞免疫细胞分为T细胞和B细胞。

肿瘤细胞通常会抑制这两类细胞的功能。

T细胞的活性会受到肿瘤诱导的免疫耐受的抑制，B细胞则会分泌免疫抑制性分子。

已经为人们所了解的是，PD-1抑制剂和CTLA-4抑制剂将是最有前途的免疫治疗方法。

PD-1抑制剂能够识别肿瘤细胞表达的PD-L1分子，从而促使恢复T细胞功能。

CTLA-4抑制剂能够阻断细胞封装受体活性，从而刺激T细胞。

这些新出现的药物已经用于扩大人体免疫反应的范围，从而消灭肿瘤细胞，它们的抵抗力主要来自于充分发掘肿瘤微环境的优势。

肿瘤微环境的血管肿瘤细胞的生长和扩张需要充足的营养和氧气。

肿瘤细胞可以通过诱导新血管的形成来满足其需要。

血管内皮细胞的血管生成能力和生长因子的分泌是促进这一过程的关键。

经过多次实验，细胞外基质的积累和纤维化被认为是肿瘤细胞诱导的新血管形成的后果。

因此，血管功能的调节可以揭示肿瘤治疗的新策略。

肿瘤微环境的细胞周期调节正常细胞周期的带动节律可以向肿瘤微环境的力量和细胞信号触发提供新的治疗途径。

许多肿瘤细胞具有过度表达细胞周期调节的分子，这些分子包括肿瘤抑制基因和细胞周期蛋白激酶等。

细胞周期蛋白激酶被认为是细胞周期调节的关键因素，其活性改变会带来肿瘤细胞周期异常和异常增长，如果能够从调节细胞周期入手，则有可能没有太多副作用地抑制肿瘤扩散AI和减少复发的发生率。

肿瘤微环境的基质分子细胞外基质和肿瘤细胞之间的相互作用是肿瘤生长的关键，基质分子双方的信号分子和细胞内分子通路的调节可以提供新的肿瘤治疗策略。

约19种中的肿瘤细胞分泌了有机分子和在基质分子的激发下增长和衍生的前体，如FGF-2、BMP-7等。

基于差异表达基因的肿瘤微环境调控信号通路探究随着人们对肿瘤生物学研究的不断深入，肿瘤微环境及其调控机制成为了热门研究领域之一。

肿瘤微环境是指包括肿瘤细胞、免疫细胞、血管、间质细胞等在内的一系列细胞和分子组成的复杂系统。

它在肿瘤的发生、进展以及治疗中都起着至关重要的作用。

而基于差异表达基因的研究是揭示肿瘤微环境调控机制的一种常见方法。

差异表达基因是指在不同条件下（如正常组织和肿瘤组织）表达水平发生显著变化的基因。

对于肿瘤微环境的研究，差异表达基因常用来作为调控信号通路的起点，探究其在肿瘤微环境中的调控作用。

肿瘤微环境调控信号通路的研究有助于我们了解肿瘤发生和进展的机制，并为肿瘤治疗提供新的靶点。

下面将介绍几个与肿瘤微环境调控相关的信号通路。

1. TGF-β信号通路TGF-β（Transforming Growth Factor-β）是一种多功能蛋白质，它在肿瘤微环境中的作用非常复杂。

TGF-β通过与其受体结合，诱导Smad信号通路的激活，从而参与调控肿瘤的增殖、转移、血管新生等多种生物过程。

同时，TGF-β还可以激活炎症反应和免疫细胞活化，调控肿瘤微环境的免疫应答。

多项研究表明，TGF-β在肿瘤生长和进展中发挥着双重作用。

在早期肿瘤阶段TGF-β通常被认为是一种抑制肿瘤生长的因子。

但是当肿瘤细胞进入转移期，TGF-β可能会转变成一种促进肿瘤生长和转移的信号分子。

2. Wnt信号通路Wnt信号通路在胚胎发育和成体细胞再生中发挥着重要作用。

在肿瘤微环境中，Wnt信号通路也被证明可以调控肿瘤的增殖和转移。

Wnt信号通路的异常活化与许多肿瘤的发生和进展有关系。

在正常情况下，Wnt信号通路是通过Wnt蛋白质与细胞表面的Frizzled受体结合来激活的。

然而，在许多肿瘤中，突变或异常表达的Wnt调节蛋白（如β-catenin）可以导致Wnt信号通路的过度激活，从而促进肿瘤增殖和转移。

3. NF-κB信号通路NF-κB（Nuclear factor kappa B）信号通路被认为是一个重要的炎症调节通路。

肿瘤微环境分子调控研究及肿瘤治疗新策略随着科技的不断发展，人们对肿瘤的研究也越来越深入。

肿瘤的发生与进展不仅与遗传因素有关，还与肿瘤微环境密切相关。

肿瘤微环境是指肿瘤周围细胞、细胞外基质和细胞间信号分子等因素构成的一个复杂的环境，它们共同参与了肿瘤生长、转移和治疗反应等过程。

因此，研究肿瘤微环境分子调控机制和肿瘤治疗新策略对于临床治疗和预后评估具有重要意义。

一、肿瘤微环境分子调控研究1、肿瘤相关细胞因子肿瘤微环境中最为重要的分子调控机制之一就是细胞因子的作用。

肿瘤周围的纤维细胞、免疫细胞和内皮细胞等不同类型的细胞可以产生不同的细胞因子，通过相互作用影响肿瘤生长、转移等过程。

一些细胞因子已经被广泛应用于临床治疗中，如EGF、VEGF等。

2、肿瘤微环境细胞间通讯细胞间通讯是肿瘤微环境中另一个非常重要的分子调控机制。

细胞间通讯可以通过连接蛋白、细胞外基质分子、整合素和其他信号分子等多种方式实现。

这种通讯机制可以加速细胞分裂、促进血管形成、促进肿瘤生长等生理过程，也可以抑制肿瘤的生长和转移。

3、肿瘤微环境的免疫调控肿瘤微环境中的免疫细胞起着重要的调控作用，免疫细胞通过识别和清除肿瘤细胞来维持机体内稳态。

免疫细胞与肿瘤细胞之间的相互作用不仅可以影响肿瘤生长和转移，还可以影响治疗的效果和预后。

二、肿瘤治疗新策略肿瘤微环境分子调控研究不仅为肿瘤预后评估提供了参考标准，还为肿瘤治疗的新策略提供了思路。

以下是几个当前在研究中的肿瘤治疗新策略。

1、克服肿瘤免疫逃逸针对肿瘤细胞逃避免疫攻击的机制，研究人员正在寻找适合的方案来攻击肿瘤。

其中包括免疫检查点阻滞剂的应用，促进免疫反应的发生，如PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂等。

这类治疗的优点是具有持续的治疗效果，但需要对治疗反应进行评估。

2、靶向肿瘤微环境通过攻击肿瘤微环境中的某些分子，以达到治疗肿瘤的效果。

比如，抑制血管生成因子，抑制肿瘤侵袭的氧吸收分子等。

这类药物的疗效可能会有限，但对于一些难以治愈的肿瘤，可以发挥重要作用。

调控肿瘤免疫微环境重编程的研究
引言:
肿瘤免疫微环境是指肿瘤细胞及其周围的复杂生态系统,包括免疫细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞等多种类型的细胞以及它们分泌的细胞因子和细胞外基质。

肿瘤免疫微环境对肿瘤的发生、进展和转移起着关键作用。

近年来,调控肿瘤免疫微环境成为癌症免疫治疗的热点研究领域。

研究内容:
1. 免疫检查点抑制剂:
这是目前最成功的免疫治疗方法之一,通过阻断免疫抑制信号通路(如PD-1/PD-L1、CTLA-4等),激活并增强机体的抗肿瘤免疫应答。

2. 肿瘤疫苗:
通过提供肿瘤相关抗原,激发或增强机体对肿瘤的免疫应答。

包括蛋白质疫苗、肽疫苗、核酸疫苗和细胞疫苗等。

3. 采集并活化患者自身免疫细胞:
如嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法和肿瘤渗漫淋巴细胞(TIL)疗法。

将患者的免疫细胞体外活化和改造后,再回输给患者以杀伤肿瘤细胞。

4. 免疫佐剂:
通过施用细胞因子(如IL-2、IFN-α等)或小分子化合物来激活和增强抗肿瘤免疫应答。

5. 改变肿瘤代谢和血管生成:
研究发现,调节肿瘤代谢和血管生成也可影响肿瘤免疫微环境。

一些新型药物在这方面具有应用前景。

6. 微生物组调控:
人体内源性微生物群与肿瘤免疫微环境存在密切关联。

通过改变肠道菌群等方式,可能为肿瘤免疫治疗提供新的靶点。

深入研究肿瘤免疫微环境及其调控机制,对于开发新型肿瘤免疫治疗策略至关重要。

这是目前生物医学研究的前沿热点。

应用基因表达谱芯片研究人胃癌细胞周期和细胞凋亡相关基因马万山;葛汝村;高辉;汪运山【期刊名称】《中华肿瘤防治杂志》【年(卷),期】2007(14)8【摘要】目的:筛选胃癌发生过程中与正常组织差异表达的细胞周期和细胞凋亡相关基因并作初步功能分析。

方法:应用Trizol一步法抽提胃癌及正常组织总RNA,分离纯化mRNA并逆转录合成荧光分子(Cy3/Cy5)标记cDNA探针,与含有8464种cDNA基因的表达谱芯片杂交,分析胃癌与正常组织间差异表达的基因,对所获得的基因进行分子生物信息学分析。

结果:胃癌与正常组织间差异表达的细胞周期和细胞凋亡基因有17条,占芯片基因总数的0.2%。

其中与细胞周期相关的基因11条,与细胞凋亡相关的基因6条。

在胃癌组织中表达量增加的10条,表达量下降的7条。

生物信息学分析显示,该17条差异表达的细胞周期和细胞凋亡相关基因,与胃癌组织细胞的生长和凋亡有关。

结论:胃癌的发生、发展过程中存在多基因表达调控的改变,细胞周期和细胞凋亡基因与胃癌组织细胞的生长和凋亡有相关性,对于该相关基因群的进一步研究有助于阐释胃癌的发病机制。

【总页数】4页(P569-572)【关键词】胃肿瘤;基因表达;细胞周期;细胞凋亡【作者】马万山;葛汝村;高辉;汪运山【作者单位】山东省千佛山医院检验科;山东省交通医院中心实验室;济南市中心医院检验科【正文语种】中文【中图分类】R730.51;Q73【相关文献】1.应用基因表达谱芯片研究人腹主动脉瘤细胞周期和细胞凋亡相关基因 [J], 郑月宏;管珩;李拥军;刘昌伟;刘暴;盛齐;缪时英2.应用基因表达谱芯片研究内毒素诱导的人树突细胞成熟前后免疫相关基因的差异表达 [J], 郝群;梁元姣;吴元赭;汪灏3.应用组织芯片技术研究霍奇金淋巴瘤细胞凋亡和细胞周期相关基因蛋白的表达[J], 王晋芬;郗彦凤;刘冬梅;王全红;Clive R Taylor4.用基因表达谱芯片研究人正常胃和胃癌中与发育相关基因的价值 [J], 汪运山;马万山;吕晓霞5.应用基因表达谱芯片研究人肺鳞癌相关基因 [J], 沈晨阳;赵辉;王丹蕾;王俊因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。