生化实验 设计试验--PAGE

实验一：分光光度法一：定义：分光光度法是根据物质对不同波长的光波具有选择性吸收的特性---即可以产生吸收光谱，而建立起来的一种定量，定性分析的方法。

分类：根据波长范围可分为紫外，可见和红外分光光度法。

特点：1，与其它光谱分析方法相比，起仪器设备和操作都比较简单，费用少，分析速度快，2，灵敏度高3，选择性好4，精密度和准确度较高5，用途广泛。

二：分光光度法基本原理：物质对光的选择性吸收1：光的基本性质：波动性，微粒性2：物质对光的选择性吸收：一种物质呈现何种颜色，是与入射光的组成和物质本身的结构有关。

溶液呈现不同的颜色是由溶液中的质点（离子或分子）对不同波长的光具有选择性吸收而引起的。

能复合成白光的两种颜色的光也称为互补色光。

3：吸收曲线（光谱）物质的分子内部存在状态：电子能级，振动能级，转动能级组成：紫外--可见吸收光谱，红外吸收光谱，远红外吸收光谱4、透光率和吸光度当一束单色光通过均匀的溶液时，入射光强度为I0，吸收光强度为Ia，透射光强度为It，反射光强度为Ir，则I0 = Ia + It + Ir 透光率(transmittance)T：透射光的强度It与入射光强度I0之比。

透光率愈大，溶液对光的吸收愈少；透光率愈小，溶液对光的吸收愈多。

吸光度A:透光率的负对数。

A愈大，溶液对光的吸收愈多。

5、Lambert-Beer定律Lambert定律：当一适当波长的单色光通过一固定浓度的溶液时，其吸光度与光通过的液层厚度成正比。

式中b为液层厚度，k1为比例系数，它与被测物质性质、入射光波长、溶剂、溶液浓度及温度有关，Lambert定律对所有的均匀介质都是适用的。

三：分光光度计的基本组成(1)光源光源的作用：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度，稳定。

可见光区：钨灯，碘钨灯(320～2500 nm)紫外区：氢灯，氘灯(180～375 nm)(2) 单色器单色器的作用：从光源的连续光谱中，分出某一波长范围的光，作为吸光光度分析的光源。

第1篇一、实验目的1. 掌握生化反应的基本原理和操作方法。

2. 通过实验验证不同生化反应的特性和规律。

3. 提高实验操作技能和数据分析能力。

二、实验原理生化反应是指生物体内发生的化学反应，主要包括酶促反应、非酶促反应等。

本实验选取了以下几种生化反应进行探究：1. 酶促反应：以淀粉酶催化淀粉水解为例，研究酶促反应的特性和影响因素。

2. 非酶促反应：以蛋白质变性为例，研究非酶促反应的特性和影响因素。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 淀粉酶- 淀粉- 碘液- 氢氧化钠- 蛋白质溶液- 乙醇- 硫酸铜- 水浴锅- 试管- 移液枪- 滴管- 研钵- 研杵2. 实验仪器：- 恒温水浴锅- 酶标仪- 紫外可见分光光度计- 精密天平- 移液枪- 试管架- 移液器四、实验方法1. 酶促反应实验：（1）将淀粉酶与淀粉按一定比例混合，加入适量水，置于恒温水浴锅中，在一定温度下反应一段时间。

（2）取一定量的反应液，加入碘液，观察颜色变化。

（3）以未加淀粉酶的反应液为对照组，分析酶促反应的特性和影响因素。

2. 非酶促反应实验：（1）将蛋白质溶液与氢氧化钠按一定比例混合，观察颜色变化。

（2）将混合液加入乙醇，观察沉淀形成情况。

（3）将沉淀加入硫酸铜溶液，观察颜色变化。

（4）以未加氢氧化钠的反应液为对照组，分析非酶促反应的特性和影响因素。

五、实验结果与分析1. 酶促反应实验结果：通过实验观察，加入淀粉酶的反应液颜色逐渐变浅，说明淀粉被水解。

在对照组中，未加淀粉酶的反应液颜色未发生变化。

这说明淀粉酶具有催化淀粉水解的作用。

2. 非酶促反应实验结果：通过实验观察，加入氢氧化钠的反应液颜色逐渐变深，说明蛋白质发生变性。

在对照组中，未加氢氧化钠的反应液颜色未发生变化。

这说明氢氧化钠可以导致蛋白质变性。

六、实验结论1. 酶促反应具有高效、专一性等特点，是生物体内重要的化学反应类型。

2. 非酶促反应也具有重要的作用，如蛋白质变性等。

生物化学期末设计实验报告——考马斯亮蓝法测蛋白质含量实验名称__________________________________________________专业__________ 班级__________ 指导老师____________报告人__________ 学号__________ 报告时间__________ 选择考核形式___自主答辩____ 考试具体时间地点另行通知该考试模式共分为两个阶段：自主安排内容设计实验、递交实验设计报告、进行现场解答辨析(也可通过考生自行准备ppt展示配合解说)、最后呈交实验报告。

内容自定，最好在原本所学基础上深化拓展，有创新和实践意义的为佳。

一、实验目的1.熟练应用分光光度计2.掌握标准曲线法测定物质含量的方法3.掌握关于蛋白质测定（学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度的原理和方法）的原理和方法。

二、实验原理考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。

考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。

它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’s law）。

此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。

蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5µL/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，比紫外吸收法灵敏10～20倍。

测定范围为10－100µg蛋白质，微量测定法测定范围是1－10µg蛋白质。

生化实验总结报告实验名称：SDS - PAGE法测定蛋白质的相对分子量作者：田景辉（201306230114）专业：生物工程指导教师：许培雅日期：2015.12.30组员：杨瑞徐巧妹尹彪程健刘嘉南目录一、实验介绍 (3)二、实验原理 (3)三、实验材料、试剂、器皿 (4)四、操作步骤 (5)五、注意事项 (7)六、实验数据记录与处理 (7)七、总结与建议 (8)八、术语表 (9)九、参考文献 (9)十、附录 (9)一、实验介绍1.实验目的掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法和测定蛋白质分子量的技术。

2.实验背景在实验一中，用100g新鲜酵母用甲苯自溶法、研磨法、SDS（十二烷基苯磺酸钠）法进行了蔗糖酶的提取以及粗提取，得到初提取液A、热提取液B、乙醇提取液C。

最终得到9.0ml蔗糖酶初提取液。

实验二采用QAE-葡聚糖凝胶离子交换柱层析法进行蔗糖酶的纯化，得到经线性阶梯洗脱的分离液D1和经阶梯梯度洗脱的分离液D2。

实验三采用苯基琼脂糖凝胶柱层析法进行进一步纯化，得到经2mol/L(NH4)2SO4的0.05mol/L Tris-HCl ph7.3 缓冲液洗脱的分离液E1和经2mol/L NaCl的0.05mol/L Tris-HCl ph7.3 缓冲液洗脱的分离液E2。

二、实验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。

当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

生物化学大实验一、装柱及标准样品的分子筛层析：把柱子固定在夹子上，打开下面的盖，用取液器匀速加入介质。

保证介质均匀沉淀，且要缓慢加入，防止产生气泡。

待介质完全沉降打开柱的上盖，剪一与柱内径大小一致的圆形滤纸片放入柱中，沉淀于介质表面。

液体接近界面时加入3ml超纯水，同时在层析杯中加入100ml超纯水，连接泵洗柱15min，同时配制平衡液200mL（20mmol Tris-HCl,pH 8.0; 20mmol NaCl）。

待液体接近界面时，在柱中加入3ml平衡液（其余平衡液加到层析杯中），调节流速，控制滴速为3ml/10min（一分钟约6-7滴）。

平衡柱过中午。

实验材料：牛血清蛋白、糜蛋白酶二者比例为2:1 溶于20mmol Tris-HCl，pH 8.0; 20mmol NaCl（教师统一配制）。

缓慢向柱中加入样品（4ml）打开层析柱上下端，使样品靠重力流出。

当样品接近界面时在柱中加入3ml 上样缓冲液（即平衡液），连接泵，调T=100 A(0.5A)=0 ，开启记录仪，同时配制100ml 0.1M Nacl。

待两个峰都出来后，把层析杯中的液体换为0.1M Nacl洗柱20min，再用超纯水洗柱30min，封柱，关机。

实验二BAP的诱导表达1.在5ml培养基中加入Amp2.5μl（母液为100mg/ml）和10μl菌液。

在摇床上37℃ 130转过夜预培养。

2.取2.5ml菌液加入50ml含有Amp (25μl)的LB培养基中（1:20扩培）。

37℃恒温摇床，180-200rpm培养40-60min左右。

测OD600,使其值达到0.5-0.7。

3.加入终浓度为1mM的IPTG(500μl)进行外源基因的诱导表达。

于室温诱导4-5小时。

4.取出后进行细胞超声破碎，留1ml破碎前菌液处理后进行western及PAGE，其余放入冰箱于4度保存。

实验三BAP的亲和层析纯化一、破碎细菌A.盐酸胍破碎1.100ml诱导后的菌液分别放于大离心管中，配平，5000rpm离心15min。

一、实验目的1. 掌握从生物组织中提取DNA的基本原理和方法。

2. 学习使用酚-氯仿法进行DNA的粗提取和纯化。

3. 熟悉DNA的鉴定方法。

二、实验原理DNA是生物体内的重要遗传物质，具有独特的碱基序列。

在提取过程中，利用DNA与蛋白质、RNA等物质的溶解性差异，通过适当的化学试剂和操作步骤，将DNA从细胞中分离出来。

三、实验材料与仪器1. 材料：鸡血、无菌生理盐水、无水乙醇、氯化钠、酚-氯仿、NaCl溶液、DNA标准样品等。

2. 仪器：离心机、玻璃棒、量筒、烧杯、滴管、吸管、移液器、酒精灯、显微镜等。

四、实验步骤1. 鸡血采集：取鸡血2ml，加入10ml无菌生理盐水，充分混匀。

2. 细胞裂解：取2ml鸡血混合液，加入等体积的酚-氯仿，充分混匀后静置5分钟。

3. DNA沉淀：取上述混合液，加入2.5倍体积的无水乙醇，充分混匀后静置10分钟。

4. DNA纯化：将上述混合液转移到离心管中，离心5分钟（8000r/min），弃去上清液。

5. DNA溶解：将沉淀用50μl NaCl溶液溶解，混匀。

6. DNA鉴定：取少量溶解后的DNA溶液，加入2μl DNA标准样品，观察颜色变化。

五、实验结果1. 在实验过程中，观察到鸡血混合液与酚-氯仿混合后分层，上层为红色，下层为无色。

2. 在DNA沉淀过程中，观察到白色沉淀形成。

3. 在DNA溶解过程中，观察到溶液颜色由白色变为无色。

4. 在DNA鉴定过程中，观察到溶液颜色与DNA标准样品颜色相似。

六、实验结论1. 成功从鸡血中提取了DNA。

2. 酚-氯仿法是提取DNA的有效方法。

3. DNA在生物组织中的提取具有实际应用价值。

七、实验讨论1. 实验过程中，酚-氯仿的加入有助于细胞裂解和DNA的提取。

2. 无水乙醇的加入有助于DNA的沉淀。

3. NaCl溶液的加入有助于DNA的溶解。

4. 实验过程中，注意操作规范，避免污染。

5. DNA提取过程中，温度、pH值等条件对实验结果有影响。

生化实验技术实验设计实验设计题目：高效液相色谱-质谱联用技术测定大米中农药的残留课程：生物学实验技术概述专业：生物化学与分子生物学学号：2015116105姓名：杨洁舒高效液相色谱-质谱联用技术测定大米中农药的残留一、方案必要性与可行性分析我国是水稻种植大国，大米是我国人民的主食，占口粮消费的63％以上。

大米除被制成米饭直接食用外，还被加工成米粉、甜点及酒精饮料等。

我国大米人均年消费量在140kg以上。

水稻生产中为了保证水稻的高产，往往不可避免地需要使用各种农药。

据报道，在农药的使用过程中，真正起作用的仅占喷施量的0.1%，其余99.9%的农药都分散于环境中，中国每年受农药污染的农田面积达到6.67×106hm2。

因此，在大米的进出口中，世界各主要农业大国都对大米的农药残留制定了严格的限量标准。

研究大米中农药残留的检测方法，既是保障人类健康的需要，又是促进进出口贸易的需要。

为了保证水稻的产量，种植者施用大量的化学农药，不仅造成环境污染，而且直接影响大米的食用安全，威胁人们的健康。

鉴于上述原因，世界各国严格规定了包括大米在内的食品中农药最大残留限（MRLs）和每日最大摄入量。

目前大部分实验室监测食品中农药残留的方法是采用经典的气相色谱法，选择性检测器包括电子捕获检测器（ECD）、氮磷检测器（NPD）和火焰光度检测器（FPD），然而这些检测器限制了农药残留的检测范围。

其原因是萃取共存物的干扰存在假阳性和不准确性，用单一方法检测呈阳性后，还必须做确证试验。

此外，经典的预处理方法操作复杂，耗时且溶剂消耗量大，因此，有必要研究新的样品预处理及检测方法。

随着联用技术的日趋完善,高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS）逐渐成为最热门的分析手段之一。

特别是在分子水平上可以进行蛋白质、多肤、核酸的分子量确认,氨基酸和碱基对的序列测定及翻译后的修饰工作等,这在HPLC-MS联用之前都是难以实现的。

HPLC一MS 作为已经比较成熟的技术,目前国内外己在生化分析、天然产物分析、药物和保健食品分析以及环境污染物分析等许多领域得到了广泛的应用。

蛋白质与核酸的定性与定量一. 实验目的1. 学习和掌握纯化蛋白质的原理和方法、蛋白质等电点的测量原理和方法。

2. 掌握使用双缩脲法对蛋白质的定性测定。

3. 学会利用定糖法对核酸的定性与定量测定二. 实验原理1. 区分蛋白质和核酸：蛋白质在碱性溶液中可与Cu2+紫红色反应。

这是蛋白质分子中肽键的反应，肽键越多反应颜色越深。

核酸由单核苷酸所组成，无此反应。

另外，核酸组成成分嘌呤及嘧啶碱基具有强烈的紫外吸收，所以核酸也具有强烈的紫外吸收，最大吸收值在260mn ，利用这一性质亦可鉴别核酸样品和蛋白质样品。

2. 蛋白质的纯化方法：（1）粗分离：中性盐对蛋白质胶体的稳定性有显著的影响。

一定浓度的中性盐可破坏蛋白质胶体的稳定因素而使蛋白质盐析沉淀。

盐析沉淀的蛋白质一般保持着天然构象而不变性。

（2）蛋白质类别及分子量的确定：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术测定样液中含有几种蛋白质，每种蛋白质的分子量大小。

由于SDS 是阴离子，使多肽表面覆盖的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了原来的电荷差异。

改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白质的SDS 复合物的短轴长度都相同，长轴长度随其分子量的大小成正比变化（3）蛋白质的精制：根据上一步骤得到的蛋白质的分子量，采用葡聚糖凝胶层析的方法。

聚糖凝胶层析，是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而在层析柱中以不同的速度移动。

分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此流程短，而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程延长，而最后从层析柱中流出。

若被分离物的分子量介于完全排阻和完全进入网孔物质的分子量之间，则在两者之间从柱中流出，由此就可以达到分离目的。

3. 蛋白质的含量测定以及等电点、比旋度等性质（1）蛋白质的含量测定：采用Folin- 酚试剂法。

实验设计：酶偶联反应测定血清中的肌酐一、广泛查阅文献、确定候选方法：经过查阅相关文献，根据方法选择的要求对各种方法进行比较，充分了解各方法的科学依据和真实的使用价值，再根据临床应用价值、实验室条件等综合分析后，目前主要的肌酐测定方法有化学测定法(碱性苦味酸法)、酶法、高效液相层析法、拉曼散射法、同位素稀释质谱法、毛细管电泳法及电极法等。

二、候选方法设计：1、实验原理：肌酐经肌酐水合酶催化生成肌酸，肌酸与肌酸激酶、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶的级联催化作用下生成乳酸，并将NADH变成NAD+，测量在340nm处监测NADH吸光度变化速率，其降低程度与肌酐含量呈正比例，反应式如下P教材1982、反应最适条件探讨：设计一系列实验分别探讨该候选方法的最适试剂浓度、缓冲体系的种类、离子强度、pH值、反应温度和时间、检测波长等。

3、候选方法的初步试验：——对候选方法做初步评价试验，包括：①标准曲线和重复性；②质控血清和新鲜标本的重复试验；③分析浓度不同的标本，并与公认的参考方法的结果对比。

三、方法学评价：（一）重复性试验：检测候选方法的随机误差。

批内重复性试验：目的是测定实验方法的偶然误差，但产生偶然误差的原因也可能由于仪器、温度、试剂、标准品缺乏稳定性，吸量、计时、混匀等操作缺乏重现性造成，应排除这些因素才能把试验所产生的误差归于方法学的误差。

重复性试验依据时间间隔可分为批内、天内、天间三种重复性试验。

方法学评价重复性试验应由实验者作批内(或天内)及天间重复性试验原理：批内重复性试验是指在相同条件下(用同样的方法，同一种试剂和标准品，同一台仪器，在同一实验室由同一人操作，并保持实验期间准确度不变)对同一标本在尽可能短的时间内进行m轮，每轮n次重复测定，以获得批内精密度数据的试验方法。

其结果能反映各次测定结果相互接近的程度，用于客观评价酶偶联反应测定血清中的肌酐随机误差的大小。

操作步骤：将血清标本用酶偶联反应测定血清中的肌酐作5轮，每轮4次血糖测定，即可获得20个测定数据。

细胞因子分子量（还原型SDS-PAGE）测定标准操作规程依据：《中华人民共和国药典》2005年版第三部。

范围：适用于细胞因子蛋白质分子量测定。

目的：测定待检品分子量是否符合《中华人民共和国药典》2005年版要求原理：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是利用丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合成大分子凝胶后再进行电泳。

因此它兼具了分子筛效应与电泳效应。

其催化系统为过硫酸铵-TEMED系统。

而SDS这种阴离子表面活性剂的加入，它能使蛋白质氢键、疏水键打开，并按一定比例与蛋白质分子结合成带负电的复合物，其负电荷远远超过了蛋白质原有的电荷，因而掩盖了不同种类的蛋白质间原有的电荷差别。

这样就使电泳的迁移率只取决于分子量大小这一因素，从而达到分离不同组分的蛋白质的目的，并在还原剂巯基乙醇的存在下，（定量的巯基乙醇可以使蛋白质分子内的二硫键彻底还原；以使SDS定量的结合到蛋白质分子上去，使蛋白质具有相同的构象），可以检测到是否有蛋白质聚合体的产生。

内容：1材料1．1样品：经二人复核批号无误后检测1．2试剂甲醇 CH3OH 分析纯无水乙醇 C2H5OH 分析纯浓盐酸 HCl 分析纯甘油 C3H8O3分析纯硝酸银 AgNO3分析纯重铬酸钾 K2Cr2O7分析纯正丁醇 C4H9OH 分析纯甲醛 HCHO 分析纯丙烯酰胺 CH2CHCONH2分析纯甲叉双丙烯酰胺 [（CH2CHCONH2）2]CH2分析纯过硫酸铵（NH4）2S2O8分析纯TEMED （四甲基乙二胺）(CH 3)2N(CH 2)2N(CH 3)2 分析纯 甘氨酸 C 2H 5NO 2 分析纯 SDS （十二烷基硫酸钠）C 12H 25O 4SNa 分析纯 乙酸 CH 3COOH 分析纯 碳酸钠 Na 2CO 3 分析纯 β-巯基乙醇 HSCH 2CH 2OH 分析纯 溴酚蓝 C 19H 10Br 4O 5S 分析纯 1．3分子量标准品：法玛西亚公司。

1．4注射用水：符合《中华人民共和国药典》2005年版要求 1．5设备扭力天平 上海第二天平仪器厂 垂直板状电泳槽 北京东方仪器厂 恒温恒流电泳仪 法玛西亚公司 快速电泳槽 BIORAD USA 全自动扫描仪 CS-930日本岛津TS-1型摇床1．6器皿：500ml 瓶、100ul 移液器、1ml 吸管、10ml 吸管、3000ml 三角瓶、平皿、1000ml 烧杯、80ml 烧杯，以上器皿经本室洗刷组处理。