生化实验 设计试验--PAGE

实验一：分光光度法一：定义：分光光度法是根据物质对不同波长的光波具有选择性吸收的特性---即可以产生吸收光谱，而建立起来的一种定量，定性分析的方法。

分类：根据波长范围可分为紫外，可见和红外分光光度法。

特点：1，与其它光谱分析方法相比，起仪器设备和操作都比较简单，费用少，分析速度快，2，灵敏度高3，选择性好4，精密度和准确度较高5，用途广泛。

二：分光光度法基本原理：物质对光的选择性吸收1：光的基本性质：波动性，微粒性2：物质对光的选择性吸收：一种物质呈现何种颜色，是与入射光的组成和物质本身的结构有关。

溶液呈现不同的颜色是由溶液中的质点（离子或分子）对不同波长的光具有选择性吸收而引起的。

能复合成白光的两种颜色的光也称为互补色光。

3：吸收曲线（光谱）物质的分子内部存在状态：电子能级，振动能级，转动能级组成：紫外--可见吸收光谱，红外吸收光谱，远红外吸收光谱4、透光率和吸光度当一束单色光通过均匀的溶液时，入射光强度为I0，吸收光强度为Ia，透射光强度为It，反射光强度为Ir，则I0 = Ia + It + Ir 透光率(transmittance)T：透射光的强度It与入射光强度I0之比。

透光率愈大，溶液对光的吸收愈少；透光率愈小，溶液对光的吸收愈多。

吸光度A:透光率的负对数。

A愈大，溶液对光的吸收愈多。

5、Lambert-Beer定律Lambert定律：当一适当波长的单色光通过一固定浓度的溶液时，其吸光度与光通过的液层厚度成正比。

式中b为液层厚度，k1为比例系数，它与被测物质性质、入射光波长、溶剂、溶液浓度及温度有关，Lambert定律对所有的均匀介质都是适用的。

三：分光光度计的基本组成(1)光源光源的作用：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度，稳定。

可见光区：钨灯，碘钨灯(320～2500 nm)紫外区：氢灯，氘灯(180～375 nm)(2) 单色器单色器的作用：从光源的连续光谱中，分出某一波长范围的光，作为吸光光度分析的光源。

第1篇一、实验目的1. 掌握生化反应的基本原理和操作方法。

2. 通过实验验证不同生化反应的特性和规律。

3. 提高实验操作技能和数据分析能力。

二、实验原理生化反应是指生物体内发生的化学反应，主要包括酶促反应、非酶促反应等。

本实验选取了以下几种生化反应进行探究：1. 酶促反应：以淀粉酶催化淀粉水解为例，研究酶促反应的特性和影响因素。

2. 非酶促反应：以蛋白质变性为例，研究非酶促反应的特性和影响因素。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 淀粉酶- 淀粉- 碘液- 氢氧化钠- 蛋白质溶液- 乙醇- 硫酸铜- 水浴锅- 试管- 移液枪- 滴管- 研钵- 研杵2. 实验仪器：- 恒温水浴锅- 酶标仪- 紫外可见分光光度计- 精密天平- 移液枪- 试管架- 移液器四、实验方法1. 酶促反应实验：（1）将淀粉酶与淀粉按一定比例混合，加入适量水，置于恒温水浴锅中，在一定温度下反应一段时间。

（2）取一定量的反应液，加入碘液，观察颜色变化。

（3）以未加淀粉酶的反应液为对照组，分析酶促反应的特性和影响因素。

2. 非酶促反应实验：（1）将蛋白质溶液与氢氧化钠按一定比例混合，观察颜色变化。

（2）将混合液加入乙醇，观察沉淀形成情况。

（3）将沉淀加入硫酸铜溶液，观察颜色变化。

（4）以未加氢氧化钠的反应液为对照组，分析非酶促反应的特性和影响因素。

五、实验结果与分析1. 酶促反应实验结果：通过实验观察，加入淀粉酶的反应液颜色逐渐变浅，说明淀粉被水解。

在对照组中，未加淀粉酶的反应液颜色未发生变化。

这说明淀粉酶具有催化淀粉水解的作用。

2. 非酶促反应实验结果：通过实验观察，加入氢氧化钠的反应液颜色逐渐变深，说明蛋白质发生变性。

在对照组中，未加氢氧化钠的反应液颜色未发生变化。

这说明氢氧化钠可以导致蛋白质变性。

六、实验结论1. 酶促反应具有高效、专一性等特点，是生物体内重要的化学反应类型。

2. 非酶促反应也具有重要的作用，如蛋白质变性等。

生物化学期末设计实验报告——考马斯亮蓝法测蛋白质含量实验名称__________________________________________________专业__________ 班级__________ 指导老师____________报告人__________ 学号__________ 报告时间__________ 选择考核形式___自主答辩____ 考试具体时间地点另行通知该考试模式共分为两个阶段：自主安排内容设计实验、递交实验设计报告、进行现场解答辨析(也可通过考生自行准备ppt展示配合解说)、最后呈交实验报告。

内容自定，最好在原本所学基础上深化拓展，有创新和实践意义的为佳。

一、实验目的1.熟练应用分光光度计2.掌握标准曲线法测定物质含量的方法3.掌握关于蛋白质测定（学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度的原理和方法）的原理和方法。

二、实验原理考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。

考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。

它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’s law）。

此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。

蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5µL/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，比紫外吸收法灵敏10～20倍。

测定范围为10－100µg蛋白质，微量测定法测定范围是1－10µg蛋白质。

生化实验总结报告实验名称：SDS - PAGE法测定蛋白质的相对分子量作者：田景辉（201306230114）专业：生物工程指导教师：许培雅日期：2015.12.30组员：杨瑞徐巧妹尹彪程健刘嘉南目录一、实验介绍 (3)二、实验原理 (3)三、实验材料、试剂、器皿 (4)四、操作步骤 (5)五、注意事项 (7)六、实验数据记录与处理 (7)七、总结与建议 (8)八、术语表 (9)九、参考文献 (9)十、附录 (9)一、实验介绍1.实验目的掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法和测定蛋白质分子量的技术。

2.实验背景在实验一中，用100g新鲜酵母用甲苯自溶法、研磨法、SDS（十二烷基苯磺酸钠）法进行了蔗糖酶的提取以及粗提取，得到初提取液A、热提取液B、乙醇提取液C。

最终得到9.0ml蔗糖酶初提取液。

实验二采用QAE-葡聚糖凝胶离子交换柱层析法进行蔗糖酶的纯化，得到经线性阶梯洗脱的分离液D1和经阶梯梯度洗脱的分离液D2。

实验三采用苯基琼脂糖凝胶柱层析法进行进一步纯化，得到经2mol/L(NH4)2SO4的0.05mol/L Tris-HCl ph7.3 缓冲液洗脱的分离液E1和经2mol/L NaCl的0.05mol/L Tris-HCl ph7.3 缓冲液洗脱的分离液E2。

二、实验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。

当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

生物化学大实验一、装柱及标准样品的分子筛层析：把柱子固定在夹子上，打开下面的盖，用取液器匀速加入介质。

保证介质均匀沉淀，且要缓慢加入，防止产生气泡。

待介质完全沉降打开柱的上盖，剪一与柱内径大小一致的圆形滤纸片放入柱中，沉淀于介质表面。

液体接近界面时加入3ml超纯水，同时在层析杯中加入100ml超纯水，连接泵洗柱15min，同时配制平衡液200mL（20mmol Tris-HCl,pH 8.0; 20mmol NaCl）。

待液体接近界面时，在柱中加入3ml平衡液（其余平衡液加到层析杯中），调节流速，控制滴速为3ml/10min（一分钟约6-7滴）。

平衡柱过中午。

实验材料：牛血清蛋白、糜蛋白酶二者比例为2:1 溶于20mmol Tris-HCl，pH 8.0; 20mmol NaCl（教师统一配制）。

缓慢向柱中加入样品（4ml）打开层析柱上下端，使样品靠重力流出。

当样品接近界面时在柱中加入3ml 上样缓冲液（即平衡液），连接泵，调T=100 A(0.5A)=0 ，开启记录仪，同时配制100ml 0.1M Nacl。

待两个峰都出来后，把层析杯中的液体换为0.1M Nacl洗柱20min，再用超纯水洗柱30min，封柱，关机。

实验二BAP的诱导表达1.在5ml培养基中加入Amp2.5μl（母液为100mg/ml）和10μl菌液。

在摇床上37℃ 130转过夜预培养。

2.取2.5ml菌液加入50ml含有Amp (25μl)的LB培养基中（1:20扩培）。

37℃恒温摇床，180-200rpm培养40-60min左右。

测OD600,使其值达到0.5-0.7。

3.加入终浓度为1mM的IPTG(500μl)进行外源基因的诱导表达。

于室温诱导4-5小时。

4.取出后进行细胞超声破碎，留1ml破碎前菌液处理后进行western及PAGE，其余放入冰箱于4度保存。

实验三BAP的亲和层析纯化一、破碎细菌A.盐酸胍破碎1.100ml诱导后的菌液分别放于大离心管中，配平，5000rpm离心15min。

一、实验目的1. 掌握从生物组织中提取DNA的基本原理和方法。

2. 学习使用酚-氯仿法进行DNA的粗提取和纯化。

3. 熟悉DNA的鉴定方法。

二、实验原理DNA是生物体内的重要遗传物质，具有独特的碱基序列。

在提取过程中，利用DNA与蛋白质、RNA等物质的溶解性差异，通过适当的化学试剂和操作步骤，将DNA从细胞中分离出来。

三、实验材料与仪器1. 材料：鸡血、无菌生理盐水、无水乙醇、氯化钠、酚-氯仿、NaCl溶液、DNA标准样品等。

2. 仪器：离心机、玻璃棒、量筒、烧杯、滴管、吸管、移液器、酒精灯、显微镜等。

四、实验步骤1. 鸡血采集：取鸡血2ml，加入10ml无菌生理盐水，充分混匀。

2. 细胞裂解：取2ml鸡血混合液，加入等体积的酚-氯仿，充分混匀后静置5分钟。

3. DNA沉淀：取上述混合液，加入2.5倍体积的无水乙醇，充分混匀后静置10分钟。

4. DNA纯化：将上述混合液转移到离心管中，离心5分钟（8000r/min），弃去上清液。

5. DNA溶解：将沉淀用50μl NaCl溶液溶解，混匀。

6. DNA鉴定：取少量溶解后的DNA溶液，加入2μl DNA标准样品，观察颜色变化。

五、实验结果1. 在实验过程中，观察到鸡血混合液与酚-氯仿混合后分层，上层为红色，下层为无色。

2. 在DNA沉淀过程中，观察到白色沉淀形成。

3. 在DNA溶解过程中，观察到溶液颜色由白色变为无色。

4. 在DNA鉴定过程中，观察到溶液颜色与DNA标准样品颜色相似。

六、实验结论1. 成功从鸡血中提取了DNA。

2. 酚-氯仿法是提取DNA的有效方法。

3. DNA在生物组织中的提取具有实际应用价值。

七、实验讨论1. 实验过程中，酚-氯仿的加入有助于细胞裂解和DNA的提取。

2. 无水乙醇的加入有助于DNA的沉淀。

3. NaCl溶液的加入有助于DNA的溶解。

4. 实验过程中，注意操作规范，避免污染。

5. DNA提取过程中，温度、pH值等条件对实验结果有影响。