基因工程教程课件

基因工程简明教程○C版权所有，翻版必究出版：05生物工程制作：梦幻之旅技术支持：【Ctrl+C &Ctrl+V】Chapter1 基因工程概述第一节基因操作与基因工程一、基因操作与基因工程关系1，1953年Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构；2，遗传学的兴起与发展，特别是发现DNA 是生命遗传信息的物质基础，从而导致分子生物学的诞生；3，分子生物学：从分子水平或核酸水平对生命现象和本质进行阐述和研究的生物学学科，内容包括：DNA和RNA的结构、复制、表达、调控、遗传和变异等4，基因操作：是研究分子生物学的手段，同时也用来改造基因或者及其相关的大分子或者生物体，目的是为人类的需求服务，基因操作的内容包括：分离、分析、改造、检测、表达、重组、转移等5，基因克隆和基因重组：是基因操作中最重要的环节。

PCR技术为基因的体外扩增提供了强大的工具。

6，基因工程：在各种酶的作用下，将目的基因的DNA分子与载体DNA分子相连接，形成重组的DNA分子，以一定的方式导入原无该类分子的宿主细胞，并使宿主生物变为自然界原来没有并能连续传代的新生物。

基因工程具体的操作过程包括：1目的基因的获得；2目的基因连接到克隆载体或表达载体，形成重组DNA分子；3重组DNA分子转化受体细胞，并与之增殖；4筛选受体细胞克隆，表达目的基因。

二、基因工程的诞生与发展1、60年代末－70年代初：DNA连接酶，限制性核酸内切酶；2、1972年P.Berg (80年获得诺贝尔化学奖) 完成世界上第一个体外重组DNA：对(SV40 +λphage) DNA→EcoRI↓T4 ligaseSV40 λ重组分子3、1973年S.Cohen 和N.Boyer完成第一个细菌克隆，用R6-5(Kanr)+pSC101(Tetr) →EcoRI↓T4 ligase转化E.coli→Kanr，Kanr转化子↓分离转化子，pSC101完整，R6-5部分4、1974年异源真核生物基因在E.coli中表达，S.Cohen, H.Boyer用非洲爪蟾的编码核糖体基因与pSC101重组导入E.coli，分析转化子，在E.coli细胞内有外源的mRNA 转录产物。

此后，基因工程迅速发展：1981年，第一个转基因哺乳动物小鼠在美国问世；1982年，基因工程胰岛素商品在美国由Eli Lilly公司投向市场；1982年，转基因烟草获得成功；1985年，基因工程微生物杀虫剂通过美国环保署的审批；1990年，基因治疗开始进入临床试验；1996年，克隆羊多莉诞生；主要应用于：1遗传改良2生物反应器3基因治疗等各种基因工程产品有：抗病毒剂；抗癌因子;新型抗生素;重组疫苗免疫辅助剂;心血管防护急救药;抗衰老药生长因子；基因治疗及诊断Kit等国家中长期科学和技术发展规划纲要(2006-2020年）前沿技术1 ．生物技术（ 1 ）靶标发现技术（ 2 ）动植物品种与药物分子设计技术（ 3 ）基因操作和蛋白质工程技术（ 4 ）基于干细胞的人体组织工程技术（ 5 ）新一代工业生物技术第二节基因工程是生物科学发展的必然产物一、基因是基因重组的物质基础1.遗传因子：①19世纪中期，孟德尔提出遗传性状是由来自父母的一种“因子”决定的②1902年，美国科学家W.H.Sutton基于实验猜测遗传因子就是染色体。

③1910年，摩尔根提出一条染色体决定一个性状。

④Willard Johnnsen第一次引出基因的概念：染色体上的基因是遗传因子。

⑤后来发现这些基因是由DNA组成的。

2.DNA与遗传的关系①1928年Frederick Griffith 细菌转化实验证明：细菌的某些性状可以通过与另一种细菌的碎片混合而发生改变。

②Oswald Avery等证实碎片中的转化物质就是DNA。

③1952年，Alfred Hershey和Martha Chase设计了著名的Hershey- Chase实验，通过噬菌体感染细菌表明DNA可以独立指导子代噬菌体的复制，噬菌体DNA包含了合成噬菌体蛋白和噬菌体DNA的遗传信息，从而直接证明DNA是遗传物质。

二、DNA的结构和功能1.DNA的结构①DNA的组成部分：脱氧核糖、磷酸基团、四种含氮碱基②DNA的三维结构：DNA的双螺旋结构，脱氧核糖和磷酸基团彼此交错连接在一起形成链状结构，碱基在双链内部通过氢键相互配对排列，腺嘌呤-胸腺嘧啶（A-T），鸟嘌呤-胞嘧啶（G-C）2.DNA的复制：半保留复制方式3.传递遗传信息：基因-蛋白质4.指导蛋白质合成：中心法则三、基因操作技术的发展促进基因工程的诞生和发展1.基因工程的工具①基因操作的车间-大肠杆菌和病毒②获得基因片段的工具-限制性核酸内切酶③连接基因片段的工具-连接酶④基因操作的载体-质粒和病毒2.重组DNA实验：基因操作工具的开发为基因重组打下了坚实的基础。

四、基因工程的内容1.基因操作基本原理①目的基因的获得：PCR技术、DNA纯化、电泳技术等②目的基因连接到克隆载体或表达载体，产生重组DNA分子：DNA分子的分离、纯化、检测、切割、连接等③重组DNA分子转化受体细胞，并与之增殖：转化和鉴定技术等④筛选受体细胞克隆，表达目的基因：筛选和表达技术等2.基因工程应用：包括植物基因工程、细菌基因工程、动物基因工程、病毒基因工程等。

主要应用于：1生物反应器：生产蛋白质和酶2生物遗传改良：培育抗虫抗病品种3基因治疗：基因修正、基因替换、基因增补等第三节基因的结构-基因操作的理论基础1.基因是遗传信息的基本单位，特定基因决定特定蛋白质的结构、功能和性质2.通常认为基因包括mRNA所代表的整个序列，其中包括编码区以外的一段序列。

3.编码蛋白质的基因片段，以及启动子、终止子和复制区等功能片段。

一、基因的结构组成对基因操作的影响1.基因及其产物的共线性：基因决定蛋白质的序列组成，当一个基因的核苷酸序列与其产物的氨基酸序列是一一对应时，则表明它们是共线性的；2.基因及其产物的非共线性：间断基因，即基因间存在内含子，它不能翻译为蛋白质，但可以转录。

；3.基因的重叠性与可变性DNA序列与蛋白质序列的对应关系不是单一的。

单个基因可通过不同部位的起始或终止表达而形成不同的蛋白质。

4．启动子和终止子（1）启动子：是基因转录过程中控制起始的部位，一般转录起始了，表达就可以进行。

启动子又是RNA聚合酶的结合位点。

从启动区到终止区为转录单位。

原核生物的启动子与真核生物的启动子不同，认识这一点对构建与认识表达载体以及穿梭载体具有重要作用。

（2）终止子：一种依赖ρ因子，一种不依赖ρ因子，后者主要是形成特定的二级结构的DNA序列。

二、基因克隆的通用策略：1用限制性内切酶切割目的DNA和载体DNA分子，2连接，3转化大肠杆菌，4筛选。

作业及思考题：1，基因工程的具体操作步骤有哪些？2，谈谈你对基因工程的理解和认识，举例说明你所熟悉的基因工程的应用情况。

Chapter2分子克隆工具酶第一节：限制性内切酶一、限制与修饰1.限制与修饰现象2.限制酶的发现命名：宿主属名第一个字母，＋种名头两个字母，＋菌株号＋罗马序号。

名称属名种名株名序数来源菌株EcoRI E Co R 1 Escherichia coli R HindIII H In d III Haemaphilus influenzae HindII H In d II Haemaphilus influenzae HindI H In d IHaemaphilus parainfluenzae4；ds-DNA结构: 切口，缺口，断口二、限制酶识别的序列1、限制酶识别序列的长度；一般4-8bp，常见6bp ，当识别序列为4或者6bp时，他们可识别的序列在完全随机的情况下，平均每44=256和46=4096bp中会出现一个识别位点。

2、限制酶识别序列的结构：一般为回文对称结构Eco RI：G↓AATTCCTTA A↑G3、限制酶切割的位置三、限制酶切割产生的末端1、匹配黏端(matched end)识别位点为回文对称结构，产生的末端为匹配黏端(黏性末端，cohesive end)，形成的两个末端是相同的，也是互补的。

2、平末端(Blunt end)在回文对称轴上同时切割DNA的两条链，则产生平末端。

3、非对称突出末端许多限制酶切割DNA 产生非对称突出端。

当识别序列为非对称序列时，切割的DNA 产物的末端是不同的，如BbvCⅠ，它的识别切割位点CC↓TCAGCGGAGT↑CG有些限制酶识别简并序列，其识别的序列中有几种是非对称的。

如AccⅠ，它的识别切割位点如下，其中GTAGAC 和GTCTAC 为非对称。

GT↓A T/CGACCATA/GC↑TG有些限制酶识别间隔序列，间隔区域的序列是任意的，如DraⅢ和EarⅠ，它们的识别切割位点分别是CAC↑NNN↓GTG 和CTCTTC (1/4)。

4、同裂酶(isoschizomer)：识别相同序列的限制酶称为同裂酶，但切割位点可能不同。

(1)同序同切酶识别序列和切割位置都相同，如HindⅡ与HincⅡ识别切割位点为GTY↓RAC ，HpaⅡ与HapⅡ识别切割位点为C↓CGG ，MobⅠ与Sau3AⅠ识别切割位点为↓GATC 。

(2)同序异切酶KpnⅠ和Acc65Ⅰ识别的序列是相同的，但它们的切割位点不同，分别为GGTAC↓C 和G↓GTACC。

另外，Asp718Ⅰ识别和切割位点为G↓GTACC 。

(3)“同功多位” 许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。

如EcoRⅠ识别和切割位点为G↓AA TTC，ApoⅠ识别和切割位点为R↓AA TTY ，后者可识别前者的序列。

另外，HpaⅠ和HincⅡ的识别位点也有交叉，它们的识别和切割位点分别为GTT↓AAC和HincⅡ。

(4)其它有些限制酶识别的序列有交叉，如在pUC 系列质粒的多克隆位点中有一个SalⅠ位点（识别切割位点为G↓TCGAC），该位点也可被AccⅠ（识别切割位点为GT↓MKAC）和Hinc Ⅱ（识别切割位点为GTY↓RAC）切割。

5、同尾酶(isocaudarner) 不同的限制酶切割DNA产生的末端是相同的，且是对称的，即它们可产生相同的黏性末端。

6、归位内切酶(homing endonuclease)内含子编码的内切酶，内含肽等。

四、DNA末端长度对限制酶切割的影响1、限制酶切割DNA时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求。

2、酶单位：在适合的缓冲液及温度下，在20μl反应体系中反应1h，使1μgDNA完全消化所需要的酶量。

3、在设计PCR引物时，如果要在末端引入酶切位点，就需要考虑加上一些满足酶切要求的碱基数目。

五、位点偏爱(site preference)对同一底物中的有些位点表现出偏爱性切割，导致其对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率。