生物大分子相互作用分析技术共91页文档

生物大分子与生物小分子的相互作用研究生物大分子和生物小分子是生物学领域中的两个重要概念。

前者包括蛋白质、核酸和多糖等，后者包括氨基酸、核苷酸和单糖等。

这些分子在生物体内存在着相互作用，形成了各种生物学现象。

因此，深入了解生物大分子和生物小分子的相互作用机制，对于理解生物学原理和研究生物学问题都具有重要的意义。

一、生物大分子的相互作用1.1 蛋白质的结构和功能蛋白质是一类由氨基酸串联而成的生物大分子。

其具有多样性的结构和功能，包括酶、激素、抗体等。

其中最重要的是酶，其在生物体内起着如同催化剂一般的作用，加速了化学反应的进行。

蛋白质的结构包括四个层次：一级、二级、三级和四级结构。

一级结构指的是蛋白质中氨基酸的线性序列；二级结构指的是蛋白质中氨基酸序列的局部折叠，如alpha-螺旋和beta-折叠等；三级结构指的是整个蛋白质分子的空间构型，由多个二级结构组成；四级结构指的是由多个蛋白质分子组成的超级分子结构。

1.2 多肽的相互作用多肽是由少于100个氨基酸组成的生物大分子。

其在生物体内起着诸如携带氧气和运输铁离子等作用。

多肽之间可以通过非共价和共价键的相互作用形成复杂的三维结构。

非共价键包括静电作用、氢键和范德华力等，共价键包括硫醚键等。

多肽遇到环境变化时，如温度、pH 值的变化等，其结构也会发生改变。

其中，氢键的断裂是影响多肽结构的关键因素。

当温度或 pH 值发生改变时，氢键的断裂会导致多肽中各种结构的丧失，最终导致蛋白质的完全失活。

1.3 核酸的相互作用核酸是由核苷酸组成的生物大分子。

其在生物体内起着如同蓝图一般的作用，控制了基因表达和维持遗传物质的稳定。

核酸之间可以通过氢键和静电作用等非共价键的相互作用形成双螺旋结构。

该结构为 DNA 和 RNA 分子的基本结构，也是遗传信息传递的基础。

二、生物小分子的相互作用2.1 代谢途径生物小分子是生物体内参与代谢途径的化合物。

代谢途径包括糖原代谢、脂肪代谢、蛋白质代谢等。

生物大分子相互作用的热力学原理及分析方法生物大分子相互作用是维持生物体各种生理活动的关键，也是许多生命过程中发生的基础反应。

其运动、结构、功能和调控的机制都与充电和热力学相关。

此文旨在介绍生物大分子相互作用的热力学原理及其分析方法。

一、热力学基础热力学是研究能量转化与宏观现象之间的关系的学科。

能量转化是指从一种形式的能量转移到另一种形式，从而驱动宏观过程。

而生物大分子相互作用存在于生物体内，因此必须重视化学反应热力学的基础知识。

热力学中有几个重要的概念需要特别说明。

（一）系统与环境在本文中，系统指的是被研究的生物大分子样品，而环境是指不包括系统的所有其他物质，两者间通过作用力所交换的能量就是热力学热力。

热力学研究的重点是如何将系统和环境之间相互转移的能量描述，并对系统和环境特征作出测量。

（二）热力学第一定律和第二定律热力学第一定律指的是能量不会消失或产生，只能转化成其他形式。

第二定律主要说明了能量转化的方向：永远不会从自己低温的物体转移热量到高温的物体上，也不会从无序的系统到有序的系统上。

因此，生物大分子相互作用过程中能量的转移必须遵循第一和第二定律的规律。

（三）熵和自由能热力学中有一个重要的概念是熵（entropy）。

在生物大分子相互作用的过程中，随着体系的复杂化，熵增加，从而使有序变为混沌的情况变得不可避免。

自由能（Gibbs free energy）是能量转移和过程中的有助于实现生物大分子相互作用的因素。

要能够提高系统中有组织的状态，并使其达到最大的稳定状态，就需要使系统的自由能达到最小。

在预测反应的方向和速率上，自由能变化是非常重要的。

二、常用的生物化学分析方法生物大分子相互作用的研究涉及到多种现代生物化学和物理化学方法。

目前，常用于热力学研究的方法主要包括等温滴定量热法、差示扫描量热法、圆二色性光学光谱法、荧光共振能量转移法、表面等离子共振法等。

下面将分别介绍这些方法的原理和应用。

（一）等温滴定量热法等温滴定量热法（Isothermal titration calorimetry，ITC）是研究生物大分子相互作用最常用的实验技术之一。

生物大分子间相互作用的研究随着生物科技的不断发展，研究生物大分子间相互作用的越来越深入。

生物大分子是指在生物体内大量存在的具有重要生物功能的高分子化合物，包括蛋白质、核酸、多糖等。

在生物体内，这些大分子通过相互作用，形成了复杂的生物系统，完成了众多的生物功能，因此，研究生物大分子间相互作用，对于理解生命活动的本质，以及发现和开发新的治疗手段具有重要的价值。

1. 蛋白质之间的相互作用蛋白质是构成生物体的重要组成部分，具有极其重要的生物功能。

蛋白质之间的相互作用是生物体内重要的分子相互作用之一。

其相互作用形式多样，主要包括：氢键相互作用、范德瓦尔斯力相互作用、离子键相互作用等。

在蛋白质的三级结构中，同源二聚体是一种重要的相互作用形式。

同源二聚体是指由两个完全相同的蛋白质链构成的二聚体，其通过相互作用，形成一个具有新的功能的蛋白质结构体。

同源二聚体在生物体内广泛存在，具有很高的生物功能性。

研究同源二聚体的结构、功能和调控，对于探索新的生物功能分子具有重要的意义。

2. 核酸之间的相互作用核酸是生物体内最具有代表性的大分子之一。

在生物体内，核酸通过配对相互作用，形成了重要的生物结构和机体功能。

核酸之间的相互作用主要包括：氢键相互作用、范德瓦尔斯力相互作用等。

在生物体内，RNA与蛋白质之间的相互作用是一种重要的分子相互作用形式。

RNA的特点是在其不同区域上具有不同的功能结构和序列，这使得RNA能够通过与蛋白质的相互作用实现其不同的生物功能。

研究RNA与蛋白质之间的相互作用机制，对于理解生命分子的功能机理具有重要的意义。

3. 生物大分子与其它分子之间的相互作用生物大分子不仅与自身相互作用，还与其它物质之间相互作用。

例如，血红蛋白是一种具有重要生物功能的蛋白质，在生物体内与氧气之间的相互作用实现了氧气的转运功能。

同样，DNA与荧光染料之间的相互作用也是一种重要的生物相互作用形式，可以通过检测荧光信号实现DNA的检测和诊断。

生物大分子间相互作用的研究生命的出现和发展，是由大分子水平上的化学相互作用和微观结构的演变而驱动的。

生物大分子是生命起源和生命进化的基础。

在生物学中，我们通常指的大分子是指DNA，RNA，蛋白质和多肽等具有生物活性和功能的巨大分子。

这些大分子之间的相互作用是非常重要的，它们不仅能够编码和储存遗传信息，还可以构建细胞结构和运输信号。

因此，生物大分子间相互作用的研究，是生命科学领域的重要领域之一。

生物大分子的分类生物大分子主要包括：蛋白质，RNA，DNA和多肽等。

蛋白质是细胞中最为重要的大分子之一，它们占据了细胞干重的70%左右。

蛋白质是由氨基酸连接而成的线性链状聚合物，具有多种功能。

RNA是遗传信息的主要携带者，同时还在细胞中直接参与蛋白质的合成。

RNA分为mRNA、tRNA、rRNA三类，它们在细胞中所扮演的角色不同。

DNA是基因的载体，是所有生物的遗传信息的储存库。

脱氧核糖核酸是由鸟嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鳞喉嘌呤四种碱基构成的。

多肽是由数十个氨基酸通过肽键连接而成的分子，在生物体内进行各种生理代谢反应，如肽类激素，如胃泌素等都是重要的多肽分子。

生物大分子间的相互作用生物大分子间的相互作用主要包括两种，一种是外部作用于分子表面的物理化学效应，包括静电相互作用、范德华相互作用等；另一种是基于结构的分子生物学相互作用。

它们之间有多层次、多方面、协同作用的积累。

例如，蛋白质和DNA 之间的相互作用，往往涉及到多个层次的结构，如氨基酸残基上的静电相互作用，氢键和水合作用，这些相互作用都是在共同构建分子结构的过程中发挥作用的。

生物大分子的相互作用机制生物大分子间的相互作用机制是非常复杂的，其主要包括两种：电荷效应和立体效应。

电荷效应是指同性电荷相斥，异性电荷相吸，这是最基本的相互作用，也是分子间相互识别的基础；立体效应是指分子之间相互作用形成的结构和几何构象相互匹配，这种作用是高级别的相互作用。

细胞分子生物学领域中，特别是酶反应、离子沟通和相互识别等过程中，这些作用机制非常重要。

生物大分子相互作用和调控机制生命体系中存在着一系列的大分子，如蛋白质、核酸、多糖等，它们在细胞中的相互作用和调控机制对细胞的正常生理功能至关重要。

本文将从生物大分子的相互作用和调控机制两个方面进行探讨。

一、生物大分子的相互作用生物大分子之间的相互作用包括物理和化学作用两种。

物理作用主要为范德华力、静电力、水合作用和疏水作用等。

而化学作用则主要为共价键、离子键、氢键和金属键等。

这些相互作用的强度决定了生物大分子的空间结构和功能。

1. 蛋白质的相互作用蛋白质作为细胞中最复杂的大分子之一，其相互作用方式多种多样。

其中，蛋白质与蛋白质之间主要靠氢键、离子键、疏水作用和范德华力来相互作用，形成蛋白质配位。

另一方面，许多蛋白质还可以与其他分子形成复合物，如酶与底物的复合、抗体与抗原的复合等。

这些复合物的形成有助于生命体系中各种分子的交流和协调，进而实现了生物大分子的相互作用。

2. 核酸的相互作用核酸分为DNA和RNA两种，与蛋白质相比，其分子之间的相互作用更容易产生静电力，氢键等物理力学作用。

两根单链的DNA分子可以通过交叉连锁的作用形成双螺旋结构，在所有的生物大分子中，DNA的结构最为规则且稳定，从而为生命的长度遗传提供了基础。

二、生物大分子的调控机制生物大分子的调控机制是指生物大分子在特定条件下通过一系列生物化学反应进行分子结构和功能的调控。

下文将从蛋白质的调控、核酸的调控两个方面进行介绍。

1. 蛋白质调控蛋白质调控包括翻译后修饰、蛋白质的定位和蛋白质相互作用等各个层面。

翻译后修饰主要包括磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化等，这些化学修饰可以改变蛋白质的结构和电荷性质，进而调控蛋白质的功能。

蛋白质的定位包括靶向蛋白质、定位信号和质膜结合等，这些机制可以调控蛋白质在细胞中的分布。

而蛋白质之间的相互作用除了在生物大分子间的互动中起到重要的作用外，也可以通过蛋白质与蛋白质之间的结构调控来实现对生命体系的调控。

2. 核酸调控核酸的调控机制主要为RNA的催化活性。

第五节生物大分子相互作用研究技术2015-07-16 70976 0生物大分子之间可相互作用并形成各种复合物，所有的重要生命活动，包括DNA的复制、转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等，都是由这些复合物所完成。

研究细胞内各种生物大分子的相互作用方式，分析各种蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA复合物的组成和作用方式是理解生命活动基本机制的基础。

有关研究技术发展迅速，本节选择性介绍部分方法的原理和用途。

一、蛋白质相互作用研究技术目前常用的研究蛋白质相互作用的技术包括酵母双杂交、各种亲和分离分析（亲和色谱、免疫共沉淀、标签蛋白沉淀等）、FRET效应分析、噬菌体显示系统筛选等。

本部分简要介绍标签蛋白(tagged protein)沉淀和酵母双杂交技术(yeast two-hybrid system)。

（一）标签蛋白沉淀标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。

该方法利用一种带有特定标签( tag)的纯化融合蛋白作为钓饵，在体外与待检测的纯化蛋白或含有此待测蛋白的细胞裂解液温育，然后用可结合蛋白标签的琼脂糖珠将融合蛋白沉淀回收，洗脱液经电泳分离并染色。

如果两种蛋白有直接的结合，待检测蛋白将与融合蛋白同时被琼脂糖珠沉淀( pull-down)，在电泳胶中见到相应条带（图20-6）。

图20-6 标签融合蛋白沉淀实验流程示意图目前最常用的标签是谷胱甘肽S-转移酶( GST)，有各种商品化的载体用于构建GST融合基因，并在大肠杆菌中表达为GST融合蛋白。

利用GST与还原型谷胱甘肽(glutathione)的结合作用，可以用共价偶联了还原型谷胱甘肽的琼脂糖珠一步纯化GST融合蛋白。

另一个常用的易于用常规亲和色谱方法纯化的标签分子是可以与镍离子琼脂糖珠结合的6个连续排列组氨酸( 6xHis)标签。

标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。

生物大分子相互作用的热力学原理及分析方法热力学原理：热力学是研究系统热力学性质的理论，可以用来描述生物大分子相互作用的驱动力和平衡状态。

热力学第一定律是能量守恒定律，它表示系统的内能变化等于吸收的热量减去对外界做功的量，即ΔU = Q - W。

其中，ΔU是系统内能的变化，Q是系统吸收的热量，W是系统对外界做的功。

热力学第二定律是描述系统的方向性和可逆性的定律，它表明自然界中存在一个不可逆的过程，即熵增原则。

熵是描述系统的无序程度的物理量，系统的熵变ΔS = S_final - S_initial，在一个孤立系统中，熵不会减少，只会增加或保持不变。

热力学第三定律是描述系统在绝对零度温度下的性质的定律，它表明所有物质在绝对零度时熵趋于0。

分析方法：1.热力学数据分析：热力学实验可用来测定生物大分子相互作用的热力学参数，如焓变（ΔH）和熵变（ΔS）。

根据热力学公式ΔG=ΔH-TΔS，可以计算出自由能变化（ΔG），并进一步分析生物大分子相互作用的驱动力和稳定性。

热力学数据分析可以通过比较不同条件下的热力学参数来研究生物大分子相互作用的影响因素。

2.结构生物学分析：结构生物学是研究生物大分子结构的学科，其中包括X射线晶体学、核磁共振（NMR）等技术。

通过结构生物学分析，可以获得生物大分子的三维结构信息，进而研究其在相互作用中所扮演的角色和相互作用的模式。

结构生物学分析可以从原子级别揭示生物大分子相互作用的机制。

3.分子力学模拟：分子力学模拟是通过计算机模拟的方法来研究生物大分子相互作用的过程和机制。

分子力学模拟可以通过计算大量分子的运动和相互作用力来预测分子的结构和性质。

通过分子力学模拟，可以模拟生物大分子在不同环境条件下的相互作用，研究其物理性质和动力学行为。

4.生物物理化学实验方法：生物物理化学实验方法包括光谱方法（如紫外吸收光谱、荧光光谱等）、动力学方法（如酶动力学、质谱分析等）和热力学方法（如差示扫描量热法、等温滴定量热法等）。

生物大分子之间的交互作用研究生物大分子是构成生命体系的基本单位之一，包含核酸、蛋白质、多糖等。

它们通过特定的结构和功能，在生物体内发挥着各种不同的生物学作用。

而这些分子之间的交互作用，则是维持其生物学功能的重要基础。

核酸的特殊结构与功能核酸是生物大分子的一种，包括DNA和RNA两种类型。

它们具有一定的特殊结构和功能，能够储存和传递生物体信息。

DNA 是生物遗传信息的主要存储介质，通过双链螺旋结构，将遗传信息保存在其中。

而RNA则作为信息的中间传递者，能将DNA中的信息转录成RNA，并带领RNA到细胞质内进行翻译，最终合成多种蛋白质。

核酸之间的相互作用是维持其信息传递功能的重要基础。

RNA 能够通过互补配对，将自身与DNA相连结，形成mRNA-DNA复合体，从而实现信息的传递。

此外，还有许多蛋白质可以与RNA 相互作用，如RNA聚合酶、剪切体等，它们能够将RNA进行后续的修饰或处理，保证其功能的完整性和精确性。

蛋白质的高度多样性与特殊结构蛋白质是生物体内构成酶、结构蛋白、激素等多种生物分子的重要组成部分，具有高度多样性和特殊结构。

蛋白质的结构可以分为四个级别，即一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。

其中，一级结构是由组成蛋白质的氨基酸序列确定的，而其他三个级别则是由一级结构与各种相互作用相互影响而形成的。

蛋白质之间通过多种作用方式相互影响，发挥着各自的生物学功能。

最基础的是氢键作用，其次是离子键作用、范德华力作用等。

此外，蛋白质还能够通过特定的结构域、配体结合等方式，与其他生物分子相互作用，形成一系列多种多样的复合物。

多糖的生物学功能和重要性多糖是一类由单糖分子组成的生物高分子，包括多种不同的类型，如糖类、淀粉质、纤维素等。

多糖具有重要的生物学功能，能够作为储存能量的物质，还能够在生物体内起到结构支撑和信号传递等作用。

多糖之间的相互作用则是维持其生物学功能的重要保障之一。

多糖通过特定的结构域和作用方式，与其他生物分子形成复合体，最终发挥各种生物学功能。

第二十章 常用分子生物学技术第一节 核酸分子杂交第二节 聚合酶链反应第三节 基因文库第四节 生物芯片技术第五节 生物大分子相互作用研究技术一、蛋白质相互作用研究技术n常用蛋白质相互作用的研究技术•酵母双杂交•各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）•荧光共振能量转换效应分析•噬菌体显示系统筛选（一）标签蛋白沉淀标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。

标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。

标签融合蛋白沉淀实验流程示意图GST-tag:谷胱甘肽S-转移酶标签（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途DNA结合功能域（DNAbindingdomain,DNA-BD）转录激活结构域（activationdomain，DNA-AD）n酵母双杂交系统的应用•证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测。

•分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。

•将拟研究的蛋白质的编码基因与BD基因融合成为“诱饵”表达质粒，可以筛选AD基因融合的“猎物”基因表达文库，筛选未知的相互作用蛋白质。

二、DNA-蛋白质相互作用分子分析技术（一）电泳迁移率变动测定电泳迁移率变动测定(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)或称凝胶迁移变动实验(gel shift assay)最初用于研究DNA结合蛋白与相应DNA序列间的相互作用，可用于定性和定量分析，已经成为转录因子研究的经典方法。

目前这一技术也被用于研究RNA结合蛋白和特定RNA序列间的相互作用。

放射自显影未结合探针结合有蛋白的探针标记探针1X 1X 1X 1X 核蛋白提取物1X 10X 10X未标记探针10X n 凝胶迁移实验结果示意图（二）染色质免疫沉淀法染色质免疫沉淀技术(c h r o m a t i n immunoprecipitation assay, ChIP)是目前可以研究体内DNA与蛋白质相互作用的主要方法。