Recombinant_DNA

dNTP nppi
OH 5′ 3′
用途：
Co2+ dNTP nppi 5′
(A/G/C/T)n 3′
（1）主要作用是在载体或目的基因 3’末端加上 同源多聚尾巴，形成人工黏性末端，便于DNA重组。
（2）DNA 3’末端的同位素标记。
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（二）碱性磷酸酶 （alkaline phosphatase） 能特异地切除DNA、RNA和dNTP上5’-磷酸基团。
——基因工程的手术刀---- “切”
是一类能识别双链DNA中的某些特定核苷酸序 列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶，又称为限 制酶（restriction enzyme）。主要是从原核生物 中分离纯化而来。
与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限 制外源DNA，保护自身DNA。
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载体应具备的基本条件：
① 含有复制起始点，具有自主复制的能力；
② 具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；
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③ 具有一个以上的选择性遗传标记，便于重组体 的筛选和鉴定；
④ 分子质量相对较小，以容纳较大的外源DNA；
⑤ 拷贝数较多，易于与受体细胞的染色体DNA分开；
⑥ 具有较高的遗传稳定性。
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
Bg lⅡ
AGATCT TCTAGA
G CCTAG
+
GATCC G
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A TCTAG
+
GATCT A
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4.可变酶
识别DNA序列中的一个或几个碱基是可变的，并且 识别序列往往超过6个核苷酸。为Ⅱ型限制酶的特例。

过重组可加快物种变异的过程。此外，DNA重组还参与许
多重要的生物学过程，比如重组在DNA损伤修复中发挥重 要作用。
DNA重组包括:
同源重组（homologous recombination）
位点特异性重组（site-specific recombination）
1、同源重组（homologous recombination）
3.1％，分别属于5个不同的转座子家族，分别是Ty1，Ty2，
Ty3，Ty4和Ty5。这5个转座子家族在结构和转座机制上均类 似于反转录病毒。
2.2、非病毒型反转录转座子
长散布元件（long interspersed elements, LINES ） 和短散布元件（short interspersed elements, SINES）
录病毒的包膜蛋白基因，因此LTR反转录转座子不能形成有感染能力的胞外病
毒粒子，而只能形成局限于宿主细胞内病毒样颗粒。
(2)第二类反转录转座子的成员不含LTRs，也称为非病毒型反转录转座子。
2.1、LTRs反转录转座子(P538)
Ty因子
Ty是酵母转座子（transponson yeast）的缩写。酵母基 因组中随机分布着331个拷贝的Ty因子，约占酵母基因组的
同源单链，形成Holliday结构。
RecA介导的链交换可以分为三个阶段： RecA聚集在ssDNA上形成丝状结构的联会前阶段； RecA－ssDNA丝装结构寻找同源双链DNA分子并与之配对的 联会阶段，在这一阶段可能形成三螺旋（triplex）结构； 发生链的交换，形成连接分子的阶段，入侵的单链置换出 双链中的同源单链，产生一个长的异源双链区。
同源重组（homologous recombination ）发 生在两个同源DNA分子之间。真核细胞减数分裂过

重组DNA技术重组DNA技术（recombinant DNA technique）又称遗传工程，在体外重新组合脱氧核糖核酸（DNA）分子，并使它们在适当的细胞中增殖的遗传操作。

这种操作可把特定的基因组合到载体上，并使之在受体细胞中增殖和表达。

因此它不受亲缘关系限制，为遗传育种和分子遗传学研究开辟了崭新的途径。

广义的遗传工程包括细胞水平上的遗传操作（细胞工程）和分子水平上的遗传操作，即重组DNA技术（有人称之为基因工程）。

狭义的遗传工程则专指后者。

简史重组DNA技术来源于两个方面的基础理论研究——限制性核酸内切酶（简称限制酶）和基因载体（简称载体）。

限制酶的研究可以追溯到1952年美国分子遗传学家S．E．卢里亚在大肠杆菌中所发现的一种所谓限制现象——从菌株甲的细菌所释放的噬菌体能有效地感染同一菌株的细菌，可是不能有效地感染菌株乙；少数被感染的菌株乙的细菌所释放的同一噬菌体能有效地感染菌株乙可是不能有效地感染菌株甲。

经过长期的研究，美国学者W．阿尔伯在1974年终于对这一现象提出了解释，认为通过噬菌体感染而进入细菌细胞的DNA分子能被细菌识别而分解，细菌本身的DNA则由于已被自己所修饰（甲基化）而免于被分解。

但有少数噬菌体在没有被分解以前已被修饰了，这些噬菌体经释放后便能有效地感染同一菌株的细菌。

被甲（或乙）这一菌株所修饰的噬菌体只能有效地感染甲（或乙），而不能有效地感染乙（或甲），说明各个菌株对于外来DNA的限制作用常常是专一性的。

通过进一步的研究发现这种限制现象是由于细菌细胞中具有专一性的限制性核酸内切酶的缘故。

重组DNA技术中所用的载体主要是质粒和温和噬菌体（见转导）两类，而在实际应用中的载体几乎都是经过改造的质粒或温和噬菌体。

英国微生物遗传学家W．海斯和美国微生物遗传学家J．莱德伯格等在1952年首先认识到大肠杆菌的F因子（见细菌接合）是染色体外的遗传因子。

1953年法国学者P．弗雷德里克等发现大肠杆菌产生大肠杆菌素这一性状为一种染色体外的大肠杆菌素因子所控制。

基因克隆技术名词解释基因克隆技术是指通过人工手段将一个生物体的基因从其源生物体中抽取并插入到另一个宿主生物体中的过程。

以下是一些基因克隆技术的常见术语的解释：1. DNA复制（DNA replication）：在细胞分裂或基因克隆过程中，DNA的双链被解开，通过酶的作用，在每个单链上合成一条新的互补链，从而产生两条完全相同的DNA分子。

2. 基因库（gene library）：基因库是一个储存基因序列的集合，通常通过将DNA分子从一个组织或生物提取出来，并将其插入到载体（如细菌或酵母）中来构建。

3. 重组DNA技术（recombinant DNA technology）：重组DNA技术是一种通过将不同来源的DNA片段连接到一起来生成新的DNA分子的方法。

这种方法可用于将特定基因插入宿主生物体的基因组中。

4. 基因放大（gene amplification）：基因放大是指通过体外复制方法制备大量特定DNA序列的过程，如聚合酶链式反应（PCR），从而获得足够量的DNA来进一步研究。

5. 基因表达（gene expression）：基因表达是指基因通过转录和翻译的过程产生功能性蛋白质的过程。

基因克隆技术可以用于将外源基因（来自其他物种）插入宿主生物体的基因组中，从而使宿主生物体表达该基因及其编码的蛋白质。

6. 表达载体（expression vector）：表达载体是一种DNA分子，其中包含了一个外源基因的表达序列，如启动子、转录终止子和转录调控元件等。

表达载体可以在宿主生物体中将外源基因表达出来。

7. 选择标记（selection marker）：选择标记是一种用于帮助筛选转化成功的宿主生物体的方法。

常用的选择标记包括耐抗生素基因，只有含有特定基因的宿主生物体才能在含有相应抗生素的培养基中生长。

8. 基因敲除（gene knockout）：基因敲除是指通过特定的基因编辑技术（如CRISPR/Cas9）来使宿主生物体中的特定基因失去功能。