时间分辨荧光共振能量转移(tr-fret)结果

荧光共振能量转移(FRET)的定量检测及其应用张建伟;陈同生【摘要】荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)技术被广泛应用于活细胞中生物大分子构象变化和分子间动态相互作用的实时研究.针对光谱串扰和供体受体间的浓度比等困扰FRET效率定量检测的两大难题,已经发展了多种定量检测FRET效率的方法.作者结合自己的研究结果介绍了多种FRET 效率定量检测技术在细胞信号转导机制研究中的应用.%Fluorescence resonance energy transfer (FRET) is the most widely used technology to study the protein - protein real - time dynamic interactions and the change of macromolecular conformation in living cells. Spectral cross - talks and acceptor - to - donor concentration ratio are the tissues harassing the quantitative measurement of FRET efficiency. Many different methods to quantitate FRET efficiency, such as FLIM - FRET, spectral FRET, acceptor photobleaching FRET and sensitized emission FRET methods, have been proposed. In this report, we introduce some quantitative FRET methods to study the mechanism of cell signal translation.【期刊名称】《华南师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(044)003【总页数】6页(P12-17)【关键词】荧光共振能量转移(FRET);FRET效率;定量检测;荧光蛋白【作者】张建伟;陈同生【作者单位】华南师范大学生物光子学研究院生命科学教育部重点实验室,广东广州510631;华南师范大学生物光子学研究院生命科学教育部重点实验室,广东广州510631【正文语种】中文【中图分类】Q631荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)是依赖于供体和受体分子间距离的光物理进程，处于激发态的荧光团通过偶极子间的相互作用将能量以非辐射的方式转移给邻近的受体分子[1-2], 从而导致供体荧光淬灭和受体荧光发射的增加. 供体和受体之间的FRET效率(E)与分子间的空间距离(r)满足6次方的关系[3]：FRET效率是依赖于供体与受体间的距离r和Forster距离R0的. R0由下式给出[3-4]：已知主要有2个因素影响FRET效率的定量检测：一个是光谱串扰, 包括供体荧光串扰到受体通道(发射光谱串扰)和激发供体时直接激发受体(激发光谱串扰)[7-8]. 由于有机荧光团的光物理特性, 绝大数现有的FRET供体受体对都存在光谱串扰. 在定量检测FRET效率时必须消除这些串扰, 选择2个发射光谱分离较大的供体受体对, 能够减小串扰, 但同时J()会减小. 影响FRET定量检测的另一个因素是参与FRET作用的供体与受体对所占整个荧光基团的比例[9-10]. 自由的供体与受体相互作用时, 往往不是所有的供体或受体分子都参与相互作用. 参与相互作用分子的百分数难以知晓, 因此, 各种FRET效率的定量检测方法对有自由的供受体存在时都不能完全地反映FRET效率, 只能测量表观FRET效率. 另外, 活细胞中荧光蛋白表达水平和背景噪音等其它因素也可能影响FRET效率的定量检测.绿色荧光蛋白(green fluorescent proteins, GFP)是从维多利亚水母中分离出来的,受紫外或蓝光激发而发出绿色荧光[11]. 与GFP融合的蛋白在细胞中仍然能够行使正常的功能, 因此GFP成为了检测蛋白质分子间相互作用的报告分子. 近年来又发现了GFP的多种变体, 与迅速发展的荧光显微镜技术结合极大地改善了活细胞成像和FRET技术在活细胞中的应用,使得FRET技术在细胞生物学和化学方面的应用得到了质的飞跃. 基于荧光蛋白的FRET(FPs-FRET)技术已被广泛应用于活细胞实验研究中,极大促进了生物学的发展[12]. 利用基因转导技术和共聚焦荧光显微成像可以在活细胞中研究蛋白质定位、信号的传递、蛋白质分子间的相互作用和蛋白质分子的构象变化. 将荧光蛋白(FPs)接到感兴趣的蛋白质分子上, 可以对细胞进行实时动态检测, 也可视化监测细胞内蛋白质与蛋白相互作用的生理过程[13]. FPs-FRET 传感器主要可以分为3类: 分子内的FRET传感器、双分子FRET传感器和基于双分子荧光互补传感器(BiFC)[13]. FPs-FRET传感器已经成为在活细胞中实时检测钙离子浓度、pH值、各种激酶活化、蛋白质磷酸化以及蛋白质分子间相互作用等动态过程的重要技术[13-14].FRET定量检测的常用方法有寿命成像(FLIM-FRET), 光谱成像(spectral FRET), 受体光漂白(acceptor photobleaching FRET)和敏化发射测量(sensitized emission FRET)等方法, 下面介绍FRET技术在细胞信号转导机制研究中的应用.FLIM方法主要是通过测量受体存在和不存在时的供体分子的荧光寿命 D和 DA来确定FRET效率E[5],FLIM方法检测的结果一般作为其他FRET定量检测方法的对照标准. 要求供体通道选择性探测供体荧光, 而且FLIM系统价格昂贵, 同时也需要熟练的操作人员进行操作, 这些都限制了FLIM方法的推广应用. 事实上用时间相关单光子计数(TCSPC)进行精确地拟合时可能带来了其他的方法没有的复杂问题[10], 尤其是复杂的光物理性质增加了寿命法分析的困难[15, 17]. 为了精确地对分子的荧光寿命进行多指数拟合, 在每个像素点上需有大量的光子[18], 这将大大延长成像时间, 使得FLIM方法不适合于活细胞中的实时动态检测[19-20].每一个荧光团都有各自的激发和发射光谱, 不同于采用荧光通道获得数据的强度测量方法和寿命测量方法的是光谱法获得的分别是供体、受体和供体与受体样本的发射光谱. 通过供体和受体的光谱对供体-受体样本的光谱进行拟合得到FRET效率. THALER等人[21]提出了一种利用光谱成像的FRET效率定量测量方法. 存在FRET 时混合光谱Fcomplex包括3个部分：供体的荧光、受体的荧光和从供体转移到受体的那部分荧光：Fcomplex=d×(1-E)×Fd+a×Fa+d×E×(Φa/Φd)×k()×Fa,本研究小组最近也提出了一种基于荧光光谱拟合的FRET定量分析方法[22]. 该方法通过测量细胞内供体-受体对的荧光发射谱, 然后按照供体和受体的荧光发射谱进行拟合得到FRET效率. 该方法有效地解决光谱串扰问题, 可用于检测蛋白质之间的相互作用. 最近, LEVY等[23]提出了基于2种不同激发光条件的发射光谱测量FRET效率的方法, 该方法能够测量很小的FRET效率和参与作用的供体与受体摩尔比, 而且能够通过仔细的校准来消除自发荧光和背景光的影响.sFRET方法是测量FRET效率最为灵敏的方法, 在目前已知的方法中只有光谱法能够探测出小于5%FRET信号. sFRET方法能够有效地解决光谱串扰问题, 也能够很好地消除背景光和自发荧光的影响, 因此sFRET方法可以用于测量蛋白质分子间弱的FRET信号. 但是sFRET方法对于数据采集要求很高, 因为较小的干扰就可能对结果造成较大影响, 所以须对数据要进行严格的校正, 特别是须对背景光和自发荧光进行严格校正.光漂白方法(Pb-FRET)通过检测光漂白受体前后供体的荧光强度来获得FRET效率, 光漂白受体会导致供体的荧光强度上升. 光漂白方法分为完全光漂白方法和部分光漂白方法.供体和受体发生FRET时, 供体的荧光减少, 即供体荧光会产生淬灭, 而受体的荧光增加. 一般采用最大的受体激发光完全漂白掉受体后, 供体就不再把能量传递给受体, 导致供体的荧光增加. 通过测量完全光漂白受体前后供体的荧光强度和就可以得出FRET效率[24]：ELDER等[20]提出了一种通过检测部分受体光漂白前后供体的荧光强度和受体光漂白程度来测量FRET效率的部分受体光漂白方法,受体光漂白方法(Pb-FRET)操作简单, 在共聚焦显微镜上也很容易实现. Pb-FRET方法测量FRET效率既不依赖于系统参数，也不依赖于供体与受体的量子产率和消光系数, 只依赖于受体光漂白前后供体的荧光强度变化. 但是, 受体光漂白会对生物体造成的损伤, 不利于在单细胞中进行多次测量, 也不能在细胞中进行实时动态检测[20, 27]. 必须注意的是：受体光漂白过程中用最大的光强的受体激发光也可能漂白掉供体分子,最近发现在光漂白过程中YFP分子可以光转换成CFP分子[28].敏化发射测量(SE-FRET)方法被广泛应用于活细胞中FRET效率的动态检测[20, 27]. SE-FRET既可以在共聚焦显微镜上实现, 也可以在宽场显微镜上实现. 传统的SE-FRET方法是利用3个滤光块组的方法, 每个滤光块组都是采用一个激发带宽滤光块来选择性激发供体或受体, 并用发射滤光块来收集供体或受体发射的荧光. 可是, 受体敏化发射荧光包括直接激发受体的荧光和供体串扰到受体通道的荧光, 其串扰路径如图1.在实际的实验中, 除了测量待测FRET样本实验外, 还需增加对3个参考样本来对系统进行串扰校正：只有供体荧光团的供体对照样本, 只有受体荧光团的受体对照样本和已知FRET效率的校正样本. 增加的供体对照样本测量供体发射串扰(图1中path2), 受体对照样本测定直接激发受体发射串扰(图1中path1), 已知FRET效率的校正样本获得给定条件下成像系统的校正因子G[27]. 也有文献报道用2个化学计量比为1∶1且FRET效率差别较大的参考样本来获得校正因子G[29].SE-FRET方法具有无损伤的特性, 成为在活细胞中最为适合于动态监测的方法[20, 26], 而且能够较好对光谱串扰和系统参数进行校正. 但是, SE-FRET方法也有其自身的限制，需要利用对照样本(至少3个)对光学检测系统以及荧光基团的光学性质进行事先校正，一旦校正完成,后续实验不能再改变任何系统参数, 且每次实验都要重新校正, 极大地增加了SE-FRET实验的工作量和难度, 也限制了该方法的推广应用. SE-FRET实验必须同时转染4个样本, 其中的任何一个样本没有转染成功, 都会导致实验的失败.FRET技术已经成为在活细胞中研究蛋白质之间相互作用和蛋白质分子构象变化的广泛应的工具. 本研究小组近几年利用FRET技术在活细胞中研究了细胞增殖和细胞凋亡过程中的分析调控机制[30-34]. 通过构建基于GFPs的FRET质粒，利用共聚焦荧光显微镜在单个活细胞中研究各种诱导刺激条件下细胞凋亡的分子调控机理[32-36].FRET技术在生物上的重要应用是通过实时检测荧光蛋白之间FRET的效率变化来研究荧光蛋白标记蛋白质分子间的相互作用. 利用FRET技术并结合共聚焦显微成像技术，本研究小组证明了在碱性条件下诱导细胞凋亡过程中Bid被切割成tBid 并转位到线粒体上，并且证明凋亡过程中Caspase-3活化[31]. 为了在活细胞中实时研究Caspase-3的动态活化过程，筛选了稳定表达SCAT3的细胞系，在此基础上通过检测细胞凋亡期间SCAT3 FRET效率的动态变化，实现了在单个活细胞中实时检测caspase-3的动态活化过程[32].利用ECFP标记Bax蛋白和EYFP标记PUMA蛋白，本实验室利用FRET技术在活细胞中首次证明了在紫外诱导的细胞凋亡过程中PUMA可以直接促进Bax的活化和转位，并抑制Bcl-XL蛋白活化[37]. 本研究小组还证明了低功率激光辐照能够通过GSK-3β未活化的机制来抑制Bax转位的上游过程[38]，以及P53不依赖于PUMA转录因子而是通过Akt/FOXO3a介导的Bax活化和细胞凋亡[39].FRET技术已被广泛应用于活细胞中蛋白质之间相互作用和蛋白质分子构象变化的动态研究. 影响FRET定量检测的因素主要有光谱串扰和供体与受体的浓度比. GFP 及其变种的发现以及显微荧光技术的发展使得FRET技术在活细胞中的应用更加广泛. 本文介绍了寿命测量法、光谱法、部分受光漂白方法和敏化发射等几种常用的FRET定量检测方法，并对上述各种方法在定量检测FRET效率上进行了简单的评述.【相关文献】[1] LAKOWICZ J R. Energy Transfer: In Principles of Fluorescence Spectroscopy[M]. New York: Plenum Press, 1983.[2] CLEGG R. 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两个荧光发色基团在足够靠近时当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态在该电子回到基态前通过偶极子相互作用实现了能量向邻近的受体分子转移即发生能量共振转移fret是一种非辐射能量跃迁通过分子间的电偶极相互作用将供体激发态能量转移到受体激发态的过程使供体荧光强度降低而受体可以发射更强于本身的特征荧光敏化荧光也可以不发荧光荧光猝灭同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延长
原理
合呈 S1 状态，发出荧光。 随着温度升高，分子信标与靶标分离，分子信标重新恢复为发卡式结构即 S2 状态，从而荧光强度减弱。 温度持续增高，将导致分子信标熔链即 S3 状态，荧光基团与淬灭基团分离， 导致荧光恢复。
荧光共振能量转移（FRET）
黎景景
• 两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子 吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能 态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作 用，实现了能量向邻近的受体分子转移（即发 生能量共振转移） • FRET是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电 偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体 激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体 可以发射更强于本身的特征荧光（敏化荧光）， 也可以不发荧光（荧光猝灭），同时也伴随着 荧光寿命的相应缩短或延长。

荧光共振能量转移（FRET）技术在生物研究中的应用高裕锋分析化学B200425012摘要：简要综述了荧光共振能量转移（FRET）技术在生物研究中的一些应用。

核酸的结构、DNA测序、核酸杂交、蛋白质结构和蛋白质相互作用等的研究是生命科学研究重要组成部分，相关工作一直备受关注，而FRET技术被广泛应用于相关领域研究中，并取得了较突出的结果。

关键词：荧光共振能量转移（FRET），核酸结构，DNA测序，核酸杂交，蛋白质结构，蛋白质相互作用。

生命科学被誉为21世纪的科学，为了揭示生命的奥妙，人们投入了大量的工作。

其中对于核酸和蛋白质的研究备受关注，大量的新技术与新方法被用于该领域的研究中。

荧光共振能量转移技术是一项经典的荧光技术，但是随着荧光成像技术的发展，二者相互结合，成为了生命科学领域的一个重要研究手段[1,2]。

本文简单介绍了基于FRET原理的新技术在生物研究中的一些应用。

一、FRET基本原理[3]FRET现象是Perrin在20世纪初首先发现的，1948年，Foster[4,5]创立了理论原理。

FRET 指荧光能量给体与受体间通过偶极－偶极耦合作用以非辐射方式转移能量的过程，又称为长距离能量转移。

产生FRET的条件（图1）主要有三个：（1）给体与受体间在合适的距离（1～10 nm）；（2）给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠，这是能量匹配的条件；（3）给体与受体的偶极具一定的空间取向，这是偶极－偶极耦合作用的条件。

图1 产生FRET条件示意图FRET 的效率用E 表示，E 用式（1）计算：其中R 0为Foster 距离，表示某一给定给体与受60660R E R R=+ （1） 240D DA R const n J κφ−=⋅⋅⋅⋅ （2）体间能量转移效率为50％时的距离；R 为给体与受体的实际距离。

R 0可由式（2）计算：其中κ2 是方向因素,n 是溶剂的反射系数,φD 是供体探针结合到蛋白的量子效率, J DA 是供体发射波长和受体吸收波长的交叠系数。

解决方案
• 稀土离子掺杂的无机纳米晶优点 • （1）与有机染料和量子点相比：长的荧光寿
命（微秒-毫秒范围），大的斯托克斯位移（>50纳米），窄的发 射频段宽度（<10纳米），低毒性，以及高电阻光漂白，结合荧 光的时间分辨（TR）技术
• （2）相对氧化铁纳米颗粒：Gd3 +可诱导水质子的纵 向弛豫，是T1 MRI造影剂，无机纳米晶KGdF4比临床使用的螯 合Gd3 +的络合物可以更有效地降低游离Gd3 +的毒性
结果与讨论
• T1磁共振成像
(a) RT magnetization as a function of magnetic field for KGdF 4NCs. (b)1H spin−lattice relaxation rates (1/T1)o fH2O asafunction of molar concentration (mM) of KGdF4 NCs in a 80/20 (v/v) H2O /D2O mixture at RT and 9.4 T.
• .
FTIR spectra of biotinylated (upper line) and nonbiotinylated (bottom line) KGdF4 NCs.
1397,cm− 1是C −N 键的伸缩振动， 2930 cm− 1和2836 cm− 1分别是 C −H键不对称和对称伸缩振动 1630 cm−1 是氨基的N-H弯曲振动 EDC 1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基） 1685cm−1 是酰胺键伸缩振动
应用
• 精密时间分辨荧光共振能量转移探针可 用于检测微量生物分子：测定抗生物素 蛋白，检测下限降低到纳摩尔范围
结果与讨论

卡尔·古斯塔法·莫桑德尔 （Carl·Gustaf·Mosander）
背景简介——镧
镧的发现
镧于1839年1月，由在斯德哥尔摩的卡罗林斯卡研究所的卡尔·古斯 塔法·莫桑德尔（Carl·Gustaf·Mosander）发现。他从在1803已 经发现的铈中提取了它。莫桑德尔注意到他的大多数氧化铈样本不 可溶，而有些是可溶的，他推断这是一种新元素的氧化物。他从铈 中提取出了第二种元素，他称之为didymium（镨钕混合物）。然而 他没有意识到didymium也是混合物，在1885年它被分离成了镨和钕。
利用长发射半衰期的稀土镧系元素作为供体荧光团，HTRF技术结合了荧光共振能量转移 （FRET，Fluorescence Resonance Energy Transfer）和时间分辨荧光（TRF, Time-Resolved Fluorescence） 两种技术。这种结合将TRF 的低背景特点和FRET 的均相实验方式融合在一起，使得 HTRF 技术拥有 如下优势：实验方式灵活、可靠，并且具有更高的灵敏度、 稳定，实验结果的假阳性率较低
镧系元素：lanthanide element
镧以及接着发现的铒、铽打开了发现稀土元素的第二道大门， 是发现稀土元素的第二阶段。他们的发现是继铈和钇两个元素后又 找到稀土元素中的三个。镧以及接着发现的铒、铽打开了发现稀土 元素的第二道大门，是发现稀土元素的第二阶段。他们的发现是继 铈和钇两个元素后又找到稀土元素中的三个。
二、荧光共振能量转移
荧光共振能量的缺点：
然而，这些生物测定法在荧光检测方面具有很大的缺点，因为它被来自散射激发光的背 景噪声显着抑制，并且受到样品中共存材料荧光（荧光化合物和粉尘/线）的显着干扰，使其 变得困难以获得高度敏感的测量而且在 FRET 实验中使用的供体和受体是快速荧光基团，半衰 期非常短，其背景荧光较强。

荧光共振能量转移fret寿命
荧光共振能量转移（FRET）是一种非辐射能量转移过程，它涉及到两个相互作用的荧光分子，一个作为供体，另一个作为受体。

在FRET中，供体分子的激发态能量通过非辐射耦合传递给受体分子的激发态，这种转移是距离依赖性的。

FRET的寿命是指供体分子在激发态下发生FRET的平均时间，通常以寿命来描述FRET的效率。

FRET的寿命可以从几个方面来理解和解释。

首先，从技术角度来看，FRET的寿命可以通过实验测量得到。

通过激发供体分子并观察受体分子的荧光寿命的变化，可以推断出FRET的发生和效率。

其次，从理论角度来看，FRET的寿命受到供体和受体之间的距离、取向、介质环境等因素的影响。

这些因素会影响FRET的速率和效率，进而影响FRET的寿命。

此外，FRET的寿命还可以用来研究供体和受体之间的相对运动、结构变化等动力学过程。

总之，FRET的寿命是描述供体分子激发态能量转移给受体分子的平均时间，它既可以通过实验测量得到，也可以从理论上解释和研究。

理解FRET的寿命有助于揭示分子间相互作用的动力学过程，对于生物学、化学和材料科学等领域具有重要意义。

一、实验目的1. 了解荧光共振能量转移（FRET）的基本原理及实验方法；2. 掌握FRET技术在生物分子相互作用研究中的应用；3. 通过实验，观察并分析FRET现象，验证供体与受体分子之间的相互作用。

二、实验原理荧光共振能量转移（FRET）是一种基于光学现象的生物分子相互作用检测方法。

其原理是：当供体分子吸收能量后，能量可以通过共振转移到相邻的受体分子上，使其激发并发出荧光。

这种能量转移是非辐射的，即能量转移过程中不涉及光子的发射和重新吸收。

FRET现象的发生需要满足以下条件：1. 能量匹配：供体分子的发射光谱与受体分子的激发光谱有显著重叠；2. 作用距离：供体分子与受体分子的距离一般在1-10nm范围内；3. 偶极-偶极作用：供体分子与受体分子作用时的向量必须满足一定条件。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 标记供体和受体的荧光蛋白；- 细胞培养液；- 细胞培养板；- 封口膜；- 荧光显微镜；- 激光光源；- 荧光光谱仪；- 数据采集系统。

2. 实验仪器：- 超净工作台；- 培养箱；- 电子天平；- 移液器；- 离心机；- 超声波细胞破碎仪；- 荧光显微镜成像系统。

四、实验步骤1. 细胞培养：将标记供体和受体的荧光蛋白转染至细胞中，培养至适宜的密度。

2. 细胞裂解：将细胞用细胞裂解液处理，裂解细胞并释放细胞内物质。

3. 荧光显微镜观察：使用荧光显微镜观察供体和受体分子在细胞内的共定位情况。

4. FRET实验：a. 激光激发供体分子，检测受体分子的荧光强度；b. 改变供体与受体之间的距离，观察FRET现象的变化；c. 通过荧光光谱仪检测供体和受体分子的荧光光谱，分析能量转移效率。

5. 数据分析：对实验数据进行统计分析，验证供体与受体分子之间的相互作用。

五、实验结果与分析1. 荧光显微镜观察：供体和受体分子在细胞内存在共定位现象，表明供体与受体分子之间存在相互作用。

2. FRET实验：a. 当供体与受体之间的距离小于10nm时，观察到明显的FRET现象；b. 随着供体与受体之间距离的增加，FRET现象逐渐减弱；c. 通过荧光光谱仪检测，发现供体和受体分子的荧光光谱存在显著重叠，证实了能量转移的发生。

单分子fret测量单分子FRET测量是一种用于研究分子间相互作用的技术，它通过测量荧光共振能量转移（FRET）来揭示分子的结构和功能。

本文将介绍单分子FRET测量的原理、方法和应用。

一、单分子FRET测量原理荧光共振能量转移是一种非辐射能量传递过程，它发生在两个共振荧光染料之间。

在单分子FRET测量中，通常选择一个受体分子和一个给体分子，它们之间通过一个称为“桥链”的染料分子连接。

当给体分子被激发后发出荧光，如果受体分子与给体分子靠近并在适当的距离范围内，那么一部分给体分子的能量将通过FRET转移到受体分子上，导致受体分子发出荧光。

通过测量受体分子的荧光强度，我们可以推断出受体和给体分子之间的距离。

二、单分子FRET测量方法单分子FRET测量主要有两种方法：时间分辨FRET（TR-FRET）和频率分辨FRET（FR-FRET）。

1. 时间分辨FRET时间分辨FRET利用分子的荧光寿命差异来测量FRET效应。

给体分子和受体分子在受到光激发后，会分别发出荧光信号。

通过测量这两个信号的时间延迟，可以确定它们之间的FRET效应。

时间分辨FRET具有高分辨率和高灵敏度的优点，但需要复杂的实验装置和数据处理。

2. 频率分辨FRET频率分辨FRET利用分子的荧光发射光谱来测量FRET效应。

给体分子和受体分子发出的荧光信号具有不同的发射波长。

通过测量这两个发射波长的比值，可以确定它们之间的FRET效应。

频率分辨FRET相对简单易行，但分辨率较低。

三、单分子FRET测量应用单分子FRET测量在生物物理学和生物化学研究中有广泛的应用。

1. 蛋白质结构研究单分子FRET可以用于研究蛋白质的结构和构象变化。

通过将荧光染料标记在蛋白质的不同部位，可以测量蛋白质分子内部的距离和构象变化。

这对于揭示蛋白质的折叠过程、构象变化和功能机制非常重要。

2. DNA和RNA的结构和动力学研究单分子FRET可以用于研究DNA和RNA的结构和动力学。

荧光共振能量转移(fret)技术下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。

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. ,11,28.
surface plasmon resonance , SPR
SPR的优点：
可以实时、连续监测反应的动态过程， 灵敏度较高 。
可实时记录反应的结合与解离过程。 每次检测结束后，结合在金属膜芯片
上的反应物可以用洗脱液洗脱使芯片 再生，可重复使用，节约耗材。 可以得到高通量数据。
ITC是一种热量连续变化的量热器。主 要由隔热夹套包裹着的样品池(反应池) 和参比池、注射器和一台计算机组成， 注射器同时具有搅拌作用，计算机控 制温度控制装置和信息反馈系统。
受体-配体复合物的形成伴随着能量的释放或吸收，导致样品池温度的变化，参比池 始终保持在实验温度，反馈系统提供热或降低热量来补偿样品池的温度变化，每注 射一次后系统恢复至平衡状态再进行下一滴滴定。结果以峰的形式表示平衡温度偏 移所需要的能量，峰的面积相当于反应释放或吸收的热量。
射次数、注射量等，计算机就可以完成整个实验，再由软件分析ITC得到的数据。 ➢ 量热实验完毕的样品未遭破坏，还可以进行后续生化分析。
ITC的用途： 获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常数(Ka)、结合位点数(n)、摩 尔结合焓(△H）、摩尔结合熵（ △S）、摩尔恒压热容（ △ Cp），和动力学参数
surface plasmon resonance , SPR 表面等离子共振（SPR）原理
消逝波：当入射光到达界面时并不是直 接产生反射光，而是先透过光疏介质约 一个波长的深度，再沿界面流动约半个 波长再返回光密介质，透过光疏介质的 波被称为消逝波。
等离子波：当金属受电磁干扰时，金属内部 的电子密度分布会变得不均匀。因为库仑力 的存在，电子不会在引力与斥力的平衡位置 停下而向前运动一段距离，之后电子间存在 的斥力会迫使已经聚集起来的电子再次离开 该区域。由此会形成一种整个电子系统的集 体震荡，而库仑力的存在使得这种集体震荡 反复进行震荡，并以波的形式表现。

荧光共振能量转移（FRET）技术荧光标记所依赖的化合物称为荧光物质。

荧光物质是指具有共轭双键体系化学结构的化合物，受到紫外光或蓝紫光照射时，可激发成为激发态，当从激发态恢复基态时，发出荧光。

荧光标记技术指利用荧光物质共价结合或物理吸附在所要研究分子的某个基团上，利用它的荧光特性来提供被研究对象的信息。

荧光标记的无放射物污染，操作简便等优点，使得荧光标记物在许多研究领域的应用日趋广泛。

人们利用利用荧光标记的多肽来检测目标蛋白的活性，并将其发展的高通量活性筛选方法应用于疾病治疗靶点蛋白的药物筛选和药物开发（例如，各种激酶、磷酸酶、肽酶等）。

专肽生物经过长期开发，能够提供技术成熟的各种荧光标记多肽。

•荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer, FRET)荧光共振能量转移（FRET)是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程。

此过程没有光子的参与，所以是非辐射的。

该分析方法具有快速、敏感和简单等优点。

用于FRET试验的染料是可以相同的。

但在大多数应用中其实是使用不同的染料。

例如，一个供体基团（EDANS）和接受基因（DABCYL）匀被连接到一HIV蛋白酶的天然底物上，当该底物未被切断时，DABCYL可淬灭EDANS，从而检测不到荧光。

当该底物被HIV-1蛋白酶切断后，EDANS不再被DABCYL淬灭，随即可检测到EDANS荧光。

蛋白酶抑制剂的有效性可凭借EDANS荧光强度的变化进行监测。

FRET肽是研究肽酶特异性的便利工具，由于其反应过程可被连续监测，为酶活性的检测提供了一个便捷的方法。

供体/受体对的肽键水解后产生的荧光可衡量纳摩尔级浓度的酶活性。

当FRET肽是完整的，表现出的是内部的荧光猝灭，但当供体/受体对的任何肽键断裂就会释放出荧光，此荧光可被连续检测，从而可对酶的活性进行定量分析。

FRET 肽可作为各类酶研究的合适底物，比如：肽酶、蛋白酶、激酶、磷酸酶的动力特征和功能特征；对新的蛋白水解酶的筛选和检测；对多肽折叠的构象研究等。

时间分辨荧光共振能量转移(tr-fret)结果时间分辨荧光共振能量转移技术（tr-FRET）是一种通过测量分子间距离变化的荧光共振能量转移技术。

本文将介绍tr-FRET的基本原理、优点、应用和一些相关研究。

基本原理荧光共振能量转移（FRET）是指一种荧光标记分子采用荧光共振原理，通过相互作用，在能量转移过程中从一个荧光分子（供体D）向另一个荧光分子（受体A）传递能量。

能量转移的发生在一定距离（通常小于10nm）内，该距离也被称为FRET距离。

在FRET的过程中，FRET现象被一系列因素所影响，如荧光分子的数量、荧光分子的吸收和辐射频率、荧光分子的寿命和荧光分子的共振距离等。

时间分辨荧光共振能量转移技术是一种用于获取活体分子间的相互作用距离的技术，最早是由Becker and Hickl在1993年开发出来的。

在该技术中，荧光标记分子的差异被利用来测量静态和动态的相互作用。

采用这种技术的主要优点是其高时间分辨率，使得动态分子相互作用的研究成为可能。

优点时间分辨荧光共振能量转移技术具有以下优点：1、高时间分辨率：能够在亚纳秒到微秒的时间尺度上测量分子相互作用。

2、非破坏性：tr-FRET技术不会破坏样本，因此，可以用于在生理条件下收集数据。

3、能够测量交替的能量转移路径：Nanoscale动力学的复杂性往往使得当一个传递能量通道关闭时，决定一个分子体系内分子间距离的其他通道也开始发挥作用。

在这种情况下，tr-FRET技术能够探测多个能量转移路径和物种。

4、操作简单：tr-FRET技术所需要的机器和维护成本低，静态或动态样品都可以使用。

应用时间分辨荧光共振能量转移技术已经被广泛应用于生物和材料科学领域，其应用研究内容包括但不限于以下方面：1、膜蛋白的分子相互作用：时间分辨荧光共振能量转移技术可以测量在生物膜中嵌入的蛋白质分子间的距离和分子相互作用（例如药物与膜受体的相互作用）。

2、蛋白质叠加：时间分辨荧光共振能量转移技术也可以测量蛋白质叠加状态下的分子间距离。

FRET荧光共振能量转移本词条由“科普中国”科学百科词条编写与应用工作项目审核。

当一个荧光分子（又称为供体分子）的荧光光谱与另一个荧光分子（又称为受体分子）的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。

FRET 程度与供、受体分子的空间距离紧密相关，一般为7～10 nm 时即可发生FRET; 随着距离延长，FRET呈显著减弱。

供体和受体之间FRET的效率，可以由E=1/1+(R/R0)exp6反映，其中R表示供体和受体之间的距离，R0表示福氏半径，依赖供体发射谱和受体激发谱的重叠程度，以及供体和受体能量转移的偶极子的相对方位。

中文名•荧光共振能量转移外文名•Förster resonance energy transfer, fluorescence resonance energy transfer(FRET)条件•激发光谱相重叠时简介•供体荧光分子自身的荧光强度衰减范围•两个不同的荧光基团中发生原理荧光共振能量转移是指在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团（供体 Donor）的发射光谱与另一个基发生条件能量供给体－接受体（D–A）对之间发生有效能量转移的条件是苛刻的，主要包括：(1)能量供体的发射光谱与能量受体的吸收光谱必须重叠；(2)能量供体与能量受体的荧光生色团必须以适当的方式排列；(3)能量供体、能量受体之间必须足够接近，这样发生能量转移的几率才会高。

此外，对于合适的供体、受体分子在量子产率、消光系数、水溶性、抗干扰能力等方面还有众多的要求。

可见，要找到一个合荧光共振能量转移适的D–A对是很不容易的。

N O
S
O O
340-350 nm
N
energy transfer
O2 680 nm 1Dg O2
Signal Amplification
Donor: Phthalocyanine（酞菁）
检测波长: 520-620nm
AlphaLISA beads
Donor beads
在AlphaLISA受体微珠中，蒽和红荧烯被一种镧系元素铕 (Europium)螯合物替代。被激发的铕螯合物可以在615nm左右 形成波段更窄的更强的可检测光。该反应的半衰期为0.3秒， 可使用时间分辨的方法检测。
AlphaLISA beads
1O2
N
N
OSi
N
N Si N
N
SiO
N
N
O2 680 nm 1Dg O2
Signal Amplification
Donor: Phthalocyanine （酞菁）
N
N
O
S
1DgO2
S O
O
O
Europium
energy transfer
检测波长: 607-623nm
小结
检测特性 荧光类型 特异性 高通量 灵敏度 检测范围 上样体系 抗体需求 信号稳定性 数据分析 仪器需求
人力
TR-FRET
Alpha
ELISA
均相，无需洗涤
均相，无需洗涤
非均相，需多次洗涤
FRET，物理荧光
化学发光
颜色反应
高 易实现高通量
高 易实现高通量
高 实现高通量较困难
灵敏（皮摩尔）
高灵敏（亚皮摩尔）

Synergy TM H4全功能微孔板检测仪上进PerkinElmer 公司AlphaScreen cAMP试剂盒实验优化Brad Larson, Paul Held, and Peter Banks, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT关键词：AlphaScreen®，cAMP分析，激酶分析PerkinElmer公司的AlphaScreen®产品广泛应用于生物分子技术的研究，包括激酶，G蛋白偶联受体，生物标记分子等。

AlphaScreen技术采用链合霉素包被的供体微球和有特定抗体包被的受体微球来检测感兴趣分子，或者在受体微球上包被亲和标签进行常规分析。

一般情况下检测使用680nm二极管激光作为检测激发光源，但这里我们将以AlphaScreen®cAMP试剂盒为例向大家展示使用Synergy TM系列酶标仪的卤素灯激发也能得到很满意的检测结果。

介绍AlphaScreen®是在微孔板上基于微球来进行生物分子相互作用研究的技术。

“Alpha”是“Amplifi ed Luminescent Proximity Homogeneous Assay”每个单词第一个字母的缩写。

这个技术提供了一种无放射性，均相的，低背景和高信噪比的检测方式。

这个实验很容易整合到自动化系统中，并在多种微孔板上进行微量的检测实验。

AlphaScreen®系统中包含两种微球：供体微球和受体微球来产生信号。

供体微球可以在680nm处被激发，如果受体微球位置离供体微球非常近，激发产生的能量就可以传递给受体微球，并产生520-620nm 波长的发射光。

如果受体微球离供体微球比较远的话，就不会发生能量传递，这样供体微球的能量就会回到基态。

激发供体微球的能量一般是由激光微孔板检测仪的激光提供，虽然激光检测仪可以很好的进行AlphaScreen®实验，但它价格非常高，而且通常不能用到其他检测中。

附件：
FRET 原理和测量方法
一、FRET 是指当两个荧光基团满足一定条件时发生 的一种非辐射性的、偶极-偶极配对 过程，借此过程，能量从激发态荧光供体以非常接近的波长转移到荧光受体。 FRET 产生条件 1 存在荧光供体和受体，而且供体的发色光谱与受体的激发光谱有重叠 2 供体和受体的距离足够近：1-10nm 3 合适的偶极方向 4 足够的荧光寿命
○1 点击快捷键
，打开受体漂白 FRET 计
算窗口。 ○2 将第 5 步获得的时间序列图像选入，并选择 相应通道，点击 New Image 按钮，就会生成 FRET 计算后的图象。
○3 从获得的 FRET 计算结果中可以得出 FRET 在细胞内发生的位置和 FRET 对中供体和受体 的距离值。
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奥林巴斯--北京
CFP/YFP 发生 FRET 时，只用 440nm 光激发 CFP 时 CFP 的能量转移到 YFP，YFP 发光；当受体 YFP 被漂白后，CFP 向 YFP 的能量转移过程打断，原来由于能量转移 而不发光或发光较弱的 CFP 变亮，这就证实了 FRET。原理示意如下：
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奥林巴斯--北京
三、FRET 测量流程
图像特征
胞浆内有 CFP，胞核内 无 CFP 胞浆、胞核内均有 YFP，但 胞核内更亮 CFP 通道，CFP 亮且位于胞 浆内；YFP 通道，YFP 亮且 位于胞浆内
四、受体漂白 FRET 实验操作过程：
1． 点击图像获取窗口中的 ，使其处于按下状态并自动打开荧光，在荧光显微镜 下，寻找有荧光标记的细胞，并初步选择比较明亮的细胞置于视野中央。 目的：定位细胞焦平面和初步定位有荧光标记的细胞
1
奥林巴斯--北京
3. 确认发生 FRET 反应的细胞。 目的：确认已经在视野中并扫描的细胞是否有可能发生 FRET。 ○1 确认同时打开 440 和 515 激光。 ○2 选择 Sequential，然后点击 Focuse x2 或 XY Repeat 进行扫描，分别获得 CFP/YFP 的图 像。 ○3 关闭 515 激光，取消选择 Sequential，然后 点击 Focuse x2 或 XY Repeat 进行扫描，获 得 CFP/YFP 的图像。 注： ○1 .同时打开 440 和 515 并选择 Sequential 后可 以分别获得 CFP 激发-CFP 发射图像和 YFP 激 发-YFP 发射图像。 ○2 .关闭 515，只打开 440 并取消 Sequential 后， 能够获得 CFP/YFP FRET 图像。当图像满足以 下情况时，说明此细胞可能有 FRET 发生。

FRET应用
➢分子定位研究 ➢大分子在细胞内的弥散过程和运输过程研究 ➢蛋白质构象改变研究 ➢分子与分子间相互作用研究 ➢分子合成和降解过程研究 ➢酶活性检测方面
FRET技术应用一:检测两个发光分子间的重合与共定位
Laser
Laser
D
A
FRET技术应用二: 检测分子间的相互作用
Laser
荧光标记
利用FRET技术检测不发光分子间相互作用的策略
FRET技术应用三: 检测分子的折叠与构象变化
Laser
FRET技术应用四：细胞内钙离子浓度的实时测量
(b)
Miyawaki A, et al., Nature 1997, 388:882-887
我们的方向：
荧光共振能量转移在生物医学检测中的应用 ➢ 荧光共振能量转移用于蛋白质分子检测 ➢ 荧光共振能量转移用于核酸分子检测 ➢ 荧光共振能量转移用于糖分子检测 ➢ 荧光共振能量转移用于其他分子检测 ➢ 荧光共振能量转移用于无机盐离子检测
荧光共振能量转移技术
fluorescence resonance energy transfer (FRET)
概念
当供体荧光分子（荧光基团）的发射光谱与受 体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的 距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放 射性的能量转移，即FRET现象，使得供体的 荧光强度比它单独存在时要低的多（荧光猝 灭），而受体发射的荧光却大大增强（敏化荧 光）。
荧光共振能量转移(FRET)现象
1. 供体(Donor, D) 2. 受体(Acceptor, A) 3. FRET现象的特征: 选择性激发供体,却能检测到受体发射的荧光
Donor
Em. 470nm