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UPLC（超高效液相色谱）简介超越HPLC随着科学技术的进步，对液相色谱技术的要求也不断提高，单从技术角度的改进已经不行。
这就需要同时从科学与技术的角度出发，或者说从理论高度对液相色谱重新认识。
因此，UPLC（超高效液相色谱）概念得以提出，将HPLC的极限作为自己的起点。
在1996年，Waters公司推出Alliance HPLC时的主要目标是提高液相色谱的"精度"。
当时多数公司都认为HPLC技术已经发展到极致了、而同时用户对性能没有更高的需求，因此HPLC的目标应该是降低成本、走向更低的价格以获得更广泛的应用。
针对这样的观念，Waters公司提出：HPLC的技术没有到达极限，用户对HPLC有更高的要求，HPLC精度的提高对更好、更可靠的结果有极大的益处，对法规的遵从也是一个极大的促进。
站在当今世界科技前沿的液相色谱用户现在又有了新的需求。
首先是改进生产力的需求，因为大量的样品需要在很短的时间内完成，例如代谢组学分析；其次是在生化样品及天然产物样品的分析中，样品的复杂性对分离能力提出了更高的要求；第三是在与MS及MS/MS等检测技术联用时，对连接的质量提出了更高的要求。
简而言之，我们需要"更快地得到更好的结果"。
今天我们发现，随着科学技术的进步，对液相色谱技术的要求也不断提高，单从技术角度的改进已经不行。
这就需要同时从科学与技术的角度出发，或者说从理论高度对液相色谱重新认识。
因此UPLC（超高效液相色谱）概念的提出也就十分自然。
简而言之，UPLC是用HPLC的极限作为自己的起点。
理论基础早在1956年，J.J van Deemter就发表了他著名的理论：van Deemter曲线及其方程式。
最早这个理论是用在气相色谱上的，但是后来出现的液相色谱上也能应用这个理论。
Waters公司引入UPLC的概念就是由研究这个著名的方程式开始。
首先探讨一下这个著名的方程式。
UPLC色谱柱沃特世科技（上海）有限公司赵嘉胤Jiayin_zhao@ACQUITY UPLC色谱柱背景知识简介—UPLC色谱柱技术—VanGuard™ 保护柱如何选择ACQUITY UPLC色谱柱—ACQUITY UPLC BEH色谱柱—ACQUITY UPLC HSS色谱柱—ACQUITY UPLC CSH色谱柱色谱柱使用维护ACQUITY UPLC色谱柱背景知识简介—UPLC色谱柱技术—VanGuard™ 保护柱如何选择ACQUITY UPLC色谱柱—ACQUITY UPLC BEH色谱柱—ACQUITY UPLC HSS色谱柱—ACQUITY UPLC CSH色谱柱色谱柱使用维护原产厂家化学键合厂柱填充厂分销商硅胶颗粒和杂化颗粒合成填料键合Source & control of silica gel can make a big difference in your chromatography填料键合Waters分拨与销售柱填充分拨与销售柱填充分拨与销售分拨与销售柱填充•Manufactures under cGMP , ISO 9001 and ISO 13485 guidelines •Registered with FDA as a medical device manufacturer填料颗粒的合成坚固高效的1.7 µm BEH 、CSH 和1.8 µm HSS 颗粒迄今为止技术最先进的全多孔颗粒柱效最高，PH 使用范围最宽和卓越的机械强度设计特点全新硬件设计低谱带展宽新型过滤片色谱柱装填柱床稳定，耐受UPLC 工作压力沃特世专有的新型装填技术新的测试仪器软件采用eCord TM 技术无纸追踪色谱柱使用历史支架系绳包嵌式16 mm 微芯片eCord 永久附在色谱柱上智能芯片自动下载关键参数到色谱柱历史文件提供色谱柱全程使用历史 信息不可删除存在芯片上的信息可减少记录纸张色谱柱无纸使用记录VanGuard™ 保护柱特为UPLC®使用而设计ACQUITY UPLC色谱柱背景知识简介—UPLC色谱柱技术—VanGuard™ 保护柱如何选择ACQUITY UPLC色谱柱—ACQUITY UPLC BEH色谱柱—ACQUITY UPLC HSS色谱柱—ACQUITY UPLC CSH色谱柱色谱柱使用维护BEH亚乙基桥杂化颗粒130Å, 200Å, 300ÅHSS高强度硅胶颗粒100ÅCSH表面带电杂化颗粒130Å行业领先的化学稳定性•宽pH范围，耐受性最强•通用性极佳•固定相种类与柱规格丰富•除通用于小分子化合物，还有专用于生物制药行业的BEH柱产品提高选择与保留•T3 ：增强对极性分子的反相保留能力•C18：提供常规硅胶C18选择性•C18SB:高硅醇活性以增强对碱性分析物的保留，而同时维持好的峰形•Cyano，PFP：提供不同的选择性同时保证色谱峰形使选择性最大化•独特的选择性•低离子强度酸性条件下，对碱性化合物的高载量与优异峰形•较宽pH范围，高低pH条件切换时平衡迅速BEH C 18BEH C 8BEH Phenyl BEH Shield RP18BEH HILICFive particle substrates•130Å, 200Å and 300Å BEH [Ethylene Bridged Hybrid], HSS [HighStrength Silica] and CSH [Charged Surface Hybrid]•All are available in HPLC and UPLC particle sizes Wide and growing selection of column chemistries•15 stationary phases•BEH 130Å C 18, C 8, Shield RP 18, Phenyl, HILIC and Amide •BEH 300Å C and C BEH Amide CSH C 18CSH Fluoro-Phenyl 184•BEH 200Å SEC•HSS C 18, T3, C 18SB,PFP ,Cyano•CSH C 18, Fluoro-Phenyl and Phenyl-HexylProven application-based solutions•AAA, OST, PST, PrST and GlycanTransferability between HPLC and UPLCXBridge HPLC and ACQUITY UPLC BEH columns HSS HPLC and ACQUITY UPLC HSS columnsXSelect HPLC and ACQUITY CSH columnsVanGuard Pre-columns CSH Phenyl-HexylHSS T3HSS C 18HSS C 18SB HSS PFP HSS CyanoACQUITY UPLC色谱柱背景知识简介—UPLC色谱柱技术—3.0mm ID UPLC色谱柱—VanGuard™ 保护柱如何选择ACQUITY UPLC色谱柱—ACQUITY UPLC BEH色谱柱—ACQUITY UPLC HSS色谱柱—ACQUITY UPLC CSH色谱柱UPLC-HPLC方法无缝转换UPLC生物分子分析方案New 2.5 µm eXtended Performance Columns 介绍U.S. Patent No. 6,686,035 B2Bridged Ethanes within a silica matrixWide pH range (1-12)High pressure toleranceEnhanced efficiency (1.7 µm)XTerra ®MS C 18BEH C 18测试终止(估计>250 h)测试终止(估计>250 h)BEH HILIC 050100150200250300在50mM TEA 中实验时数(pH 10, 50°C)Symmetry ® C 18Silica C 18–品牌A Silica C 18–品牌BOH -OH -•仅需打断四个硅氧键即可腐蚀一个硅单位•表面腐蚀所产生的硅酸离子在流动相中溶解度大,使硅胶基体溶解的反应向右移动, 从而加快了溶解速度•pH >7时上述腐蚀过程容易发生•须同时断裂六个键才可以去除经乙基桥键连接的两个硅单位(该过程极难发生)•填料基体溶解所产生的有机硅离子在流动相中的溶解度较低, 因此容易累积在填料微孔表面, 有时可能会重新连接回颗粒表面, 形成所谓的‘自我修复’机制。
超高效液相色谱(UPLC TM)：重新定义液相色谱分离科学的能力随着首次成功地使用小颗粒得到惊人的分离能力而进入了一个新的时空。
这个新的色谱领域，所谓超高效液相色谱（UPLC TM），与传统的HPLC技术相比提供了更高的效率，因而具有更强的分离能力。
作为世界第一个商品化UPLC TM产品的Waters ACQUITY UPLC TM超高效液相色谱系统，利用创新技术进行整体设计，大幅度地改善了液相色谱的分离度、样品通量和灵敏度。
UPLC TM的商品化，是分离科学和技术的巨大进步，液相色谱亦由此进入了全新的时代。
基于1.7 μm小颗粒技术的UPLC TM，与人们熟知的HPLC技术具有相同的分离原理。
不同的是：UPLC TM不仅比传统HPLC具有更高的分离能力，而且结束了人们多年不得不在速度和分离度之间取舍的历史。
使用UPLC TM可以在很宽的线速度、流速和反压下进行高效的分离工作，并获得优异的结果。
小颗粒分离的理论与科学基础图1：填料技术的沿革液相色谱30年的发展史是颗粒技术的发展史。
颗粒度的改变直接影响到柱效，从而对分离结果产品直接影响。
由上图可知：随着颗粒度的不断降低，色谱分离度不断提高。
事实上，上述规律的理论基础是著名的范德米特(van Deemeter)方程――这是全世界所有从事色谱研究的科学家熟知的理论。
由此得到的范德米特(van Deemeter)曲线，亦是色谱科学家预测颗粒度变化而引起的色谱变化的根本依据。
该曲线预测最佳柱效与相应的流动相流速。
由曲线得知：随着颗粒度减小，相应的理论塔板高度（HETP）也下降，得到的柱效会更高。
还应该注意到1.7 μm颗粒的HETP最小值区域扩大了，这表明可以在比大颗粒更宽的流量范围内得到最高的柱效，结果可以不损失高分离度的同时来优化流速（分析速度）。
小颗粒为色谱分离带来如此的高柱效和速度优势，使利用小颗粒技术成为色谱科学家梦寐以求的目标。
然而HPLC系统的设计，一直苦于难于发挥出最小颗粒的优点。
UPLC 操作规程
1更换与质谱相连数据线
2更换“水”相流动相
3开电源，泵，气路
4灌注待指示灯等变绿后，打开UPLC软件，灌注注塞杆（prime seal wash）10min
灌注流动相管路，泵（prime A/B）5min
5正常运行
6关机
UPLC使用注意事项
1水相流动相每次使用前必须更换，所有流动相更换后必须超声2min。
2更换色谱柱时要小心操作，右边“细线易断”。
3每次方法平衡时，“波动”需<50才可运行，纯有机相一般需5min，有水相和缓冲液需平衡至少20min。
4在“AB”软件界面，勿点击“四”标。
5样品运行完毕后，需①冲洗色谱柱,在UPLC操作界面,如方法用到甲酸和水,用100%甲醇(A 1)0.2ml/min流速冲30min如方法用到乙酸铵,先用90%水10%甲醇冲洗色谱柱30min流速0.2ml/min,再用100%甲醇冲洗30min。
②灌注水路和缓冲液路,将水路/缓冲液路管路放在甲醇中,灌注该路5min。
UPLC日常使用操作
1.日常开关机
2.测试：
⑴测试，需要做的工作是调谐：首先做的是对仪器进行seal wash（出口有水
滴流出为准）和灌注（1min/3min），然后给测试者建立项目（推荐以已有项目建项目，保留需要部分，删去数据部分），各操作详见资料。
1)接柱子（检漏通过后），打开流速：0→0.2→0.4且保持B1缓慢为80%。
2)调谐：①手动调谐②自动调谐
①手动调谐：放好需要调谐样品(通常在B号位)，在仪器上计算质量数
及母离子。
a流动相比例切换为初始流动相比例，待Delta<40，使A1和B1均为50%
且流速为0.2
b打开气：开API（轻轻点击API，达到预设值）电：即开高压（待Desolvation
Temp 达到预设值）水：Waste→LC。
c MS Tune界面下，灌注样品溶液（灌注同时，命名调谐化合物，输入
调谐化合物的母离子数(输入原则是四舍六入五成双)，打开两个离子响
应界面，后Enter）→（set Mass：母离子，Start Mass，End
Mass，Scan Time=（End Mass-Start Mass）/1000），并回车→把LC调为
combined/infusion，infusion Flow Rate 为适度后（从5,20,50,100试）→
→回到Mass lynx界面，点开Chromatogram时时查看碎片裂解信息，并通过改变MS Tune界面下的Collision
（4-10-20-30-）使目标子离子与母离子丰度比为3:1且响应值达到1X e7
或8/9X e6，手动调谐成功→点击进样器终止进样。
记录调谐化合物的调谐浓度，流速，响应值，碰撞电量，离子对。
②自动调谐：待手动调谐好，在MS Console 界面，Intellistart→Start→
输入手动调谐信息及命名（compound name，分子量；Method Details中
Sample Tune Name选择ipr文件，MRM和Save Report as命名一致；Flow
path和sample solution同手动调谐一致），参数设置好后save，回到MS
Tune界面，点击进样，并再次回到MS Console 界面点击Start进行自动
调谐。
详细输入信息参见资料
调谐时注意： 两处正负离子模式选择处要保持一致；进行调谐进样前，
LC调为combined/infusion状态
调谐结束后：
调谐结束后，把甲醇换上，infusion Flow Rate为200，purge 3次→combined 调为infusion→进样→infusion调为Waste且使infusion Flow Rate恢复为5，Collision调为4。
进行冲柱子过程，如上2步骤。
3)建立方法：包括质谱条件和液相条件
质谱条件：调出各个化合物的调谐文件整合成一个方法。
液相条件：先是大梯度，然后细分。
4)测试开始：日常操作打开仪器后，装好柱子（检漏通过），检查好强弱洗，
换上测试者流动相，测试者把样品放于样品室（检查放置是否合格）。
①Seal wash：清洗密封垫
②灌注: Start up system（设置信息，并核对）
③Inlet Method 窗口下：打开测试者方法，先小流速0.2保持B1为80%
平衡20min左右，在缓慢过渡到初始比例流动相平衡（Delta<40）。
④打开质谱：（流动相梯度在过渡过程中即可打开质谱）
打开气：开API（轻轻点击API，达到预设值）电：即开高压（待Desolvation
Temp 达到预设值）水：Waste→LC。
⑤测样：待Delta<40，选择需要进的样品序列，进行测样（进样原则，
样品浓度由低到高，针与针之间可设溶剂洗针）。
3.测试完冲柱子:
首先，关质谱：
①关水：LC→Waste
②关电：即关高压（待Desolvation Temp < 100℃）
③关气：关API（轻轻点击API）。
对于氩气（COL），只要不测样，就可以关掉，测样时，仪器会自动打开。
其次，冲柱子：
①流速下调零：当前流速→0.2→0，含甲酸水相（A1）→超纯水（200mL左
右，每天都需要更换新的）
②灌注：prime A/B 选A1→2min→OK，系统进行灌注。
③打开流速：0→0.2→0.4 B1（0.5%/1%），每次调流速，过渡5-20分钟，使1min内Delta<40。
保持0.4流速且B1为1%，冲50min（如果测样很多，可多冲50min），然后，流速切换为0.2且B1为80%冲20-30min，使1min钟内压力差在40以下，最后，流速切换为0，关掉柱温和样品室温度。
[整个过程，观看UPLC Console 界面，保证psi<10000]
如果柱子压力在8000-10000psi，此时，可采取使B1为0.5%且流速可稍微高为0.42或者0.45，冲50min（压力控制在10000之内），再保持0.4流速，冲50min
最后，关显示器：
用手轻触屏，关显示器。
✓每次超纯水不能超过两天，最好现配现用。
保证瓶内在光下无可视物。
⌧且记，不可关掉仪器的三个界面（Mass lynx，MS Console，MS Tune）
UPLC日常使用注意事项
1.适时清洗锥孔：清洗锥孔前，首先把离子源温度降至50℃以下（输入50，
选择Enable Manual Controls，回车），降温时可把API打开。
⑴配置清洗锥孔洗液（45:45:10=水:MEOH:甲酸），每次100-200mL
⑵拆卸锥孔：用工具小心拆卸，拿出锥孔，方可关上离子源舱门。
用工
具缓慢剥离锥孔并轻放于布上，用棉棒蘸甲醇沿锥孔棱壁自上而下擦拭锥孔，锥孔内需要擦。
⑶清洗锥孔：①用夹子把锥孔放于清洗液中，超声30min；②超纯水超声
3-4遍，每次超声5-10min；③用纯甲醇超声5min；④氮吹：把锥孔吹干。
超声过程中可用棉棒蘸甲醇擦拭离子源舱门内脏处（切记避开针）
⑷安装锥孔：用工具小心安装，离子源温度升高至150℃（输入150，取
消Enable Manual Controls，回车），关上舱门，需要进行一下灌注。
2.强洗：乙腈/甲醇：水=9:1；弱洗：乙腈/甲醇：水=1:9。
3.振气：UP长期测试，需振气（一个是使泵油回流，另一个是使溶解在泵
油中的有机溶剂挥发出去。
）方法：打开振气阀，三点一线，约30min后，关上振气阀，三点垂直。
振气时需注意：质谱舱门必须关，API必须关，此时可进行实验前的冲柱子及平衡柱子。
4.体内样品，进样量为1μL（通常<5μL）；体外样品为2μL。
5.当样品或者流动相中避免不了有磷酸盐时，处理的方法：在MS File中，
options→Method events→设置action：0 waste；0.5 LC，点击ok保存方法。
6.进样进行中，若要终止进样操作，则必须等当前针已进了至少0.1min，
然后在Inlet 页面点一下“ ”，进行Reset Communication一下。
7.换液氮时：仪器会出现N2 Failure问题，解决办法为：在MS Tune 界面，
Gas→“√”override Sourse Pressure Test；Fluidics页面重新purge 使恢复正常。
8.如果仪器较长时间无测试，则需要保持A和B两个管路都灌注且保持在
甲醇中。
9.如果柱压呈现锯齿状，首先考虑管路中有气泡（此时Degasser也非正常，
正常值为0.55-0.62）。
解决办法：把A、B相均换成有机相灌注5min冲10-20min观察；滤头贴壁，也可造成气泡。
10.柱压过高时，首先要对柱子检漏，其次看一下滤片是否脏了（可用工具
拆下甲醇超声一定时间）。
