糙皮侧耳蓝光受体基因Po.WC-1的克隆及分析
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绿色荧光蛋白基因克隆及表达结果分析页数:7
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1株野生红侧耳菌株分离鉴定及人工驯化栽培
南方农业学报 Journal of Southern Agriculture 2023，54（12）：3514-3526ISSN 2095-1191； CODEN NNXAABDOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.12.0061株野生红侧耳菌株分离鉴定及人工驯化栽培蔡志英，马茜，戴利铭，苏海鹏，刘一贤，施玉萍，李岚岚，熊延林，穆洪军*（云南省热带作物科学研究所植物保护与微生物利用研究中心，云南西双版纳州666100）摘要：【目的】对1株野生侧耳菌株PD2021进行分离鉴定及人工驯化栽培，为该菌株的大规模栽培及开发利用提供理论依据。
【方法】以从云南省西双版纳州景洪市采集到的1株野生侧耳菌株PD2021为试材，采用组织分离法获得其母种，结合子实体形态学观察、侧耳属DNA条形码和分子系统发育分析界定其分类地位，并通过培养特性试验探究其生物学特性及出菇条件，采用正交试验筛选人工室内栽培该菌的栽培配方。
【结果】通过形态学观察发现，PD2021菌株实体为呈淡米黄色，孢子印为白色，菌盖成熟时边缘呈波浪形花瓣状，菌盖边缘与中部交界处有一圈环状、参差不齐的条纹、整个子实体似一朵花子。
结合侧耳属DNA条形码分析结果，将PD2021菌株鉴定为红侧耳花形变种（Pleurotusdjamor var. floreus）。
PD2021菌株的ITS序列和延伸因子基因（EF-1α）序列均与P. djamor相似性最高，处于系统发育进化树中的同一分支，但二者分支长短不一，表明二者序列出现变异，进一步证明PD2021菌株为红侧耳的变种。
该菌株最适生长的碳源为可溶性淀粉，最适生长的氮源为酵母粉，最适温度为26 ℃；菌丝耐高温能力强，44 ℃下处理12 h后于26 ℃下仍能恢复生长。
采用正交试验筛选该菌栽培配方，最优配方：米糠15 kg、麦麸10 kg、橡胶锯末200 kg、玉米粉15 kg。
在22~32 ℃、65%~85%空气湿度、100~550 lx散射光的出菇房中栽培15~21 d可出菇，出菇量可达152.26 g/菌包，生物转化率达55.64%。
糙皮侧耳发育相关基因表达量验证及载体构建
糙皮侧耳发育相关基因表达量验证及载体构建糙皮侧耳是一种常见的遗传性疾病，其主要表现为耳廓的发育异常。
近年来，越来越多的研究表明，糙皮侧耳的发生与多个基因的表达量异常有关。
本文旨在探究糙皮侧耳发育相关基因表达量验证及载体构建的研究进展。
一、糙皮侧耳发育相关基因研究发现，糙皮侧耳发生与多个基因相关，其中包括FGFR2、MSX1、BMP4等。
FGFR2基因编码成纤维连接蛋白生长因子受体2，其在胚胎发育中起到重要作用，对于骨骼和软骨的生长发育具有重要的调节作用。
MSX1基因编码成一个转录因子，它在胚胎发育中参与了许多重要的生物学过程，如颅面骨骼和牙齿的形成。
BMP4基因编码成骨形态发生蛋白4，它在胚胎发育中也起到重要作用，可以促进骨骼和软骨的形成。
二、基因表达量验证为了验证这些基因与糙皮侧耳的关联性，许多研究人员进行了基因表达量验证实验。
其中一种方法是采用定量PCR技术，通过测量RNA分子的数量来确定特定基因的表达量。
另一种方法是使用Northern blotting技术，该技术可以检测RNA分子在凝胶上的大小和数量。
一项研究使用了定量PCR技术来检测FGFR2和MSX1基因在糙皮侧耳患者和正常人之间的表达差异。
结果显示，与正常人相比，糙皮侧耳患者中FGFR2和MSX1基因的表达量显著降低。
这表明这两个基因可能与糙皮侧耳的发生有关。
另一项研究使用了Northern blotting技术来检测BMP4基因在糙皮侧耳患者和正常人之间的表达差异。
结果显示，与正常人相比，糙皮侧耳患者中BMP4基因的表达量显著降低。
这也进一步证明了BMP4基因与糙皮侧耳的关联性。
三、载体构建为了进一步探究这些基因的作用机制，许多研究人员构建了不同的载体来模拟这些基因在细胞中的作用。
其中一种常见的载体是质粒载体，它可以用来传递外源DNA序列到细胞中，并使其表达。
一项研究构建了一个包含FGFR2基因的质粒载体，并将其转染到小鼠胚胎成纤维细胞中。
滇水金凤LWD基因的克隆及表达分析
热带作物学报2022, 43(6): 1152 1159Chinese Journal of Tropical Crops滇水金凤LWD基因的克隆及表达分析李新艺1，李洋1，罗超1，魏春梅1，黄美娟1，瞿素萍2*，黄海泉1*1. 西南林业大学园林园艺学院/国家林业和草原局西南风景园林工程技术研究中心/云南省功能性花卉资源及产业化技术工程研究中心/西南林业大学园林园艺花卉研发中心，云南昆明 650224；2. 云南省农业科学院花卉研究所，云南昆明 650205摘要：WD40是转录因子大家族，具有调节花青素苷生物合成、植物生长发育及非生物胁迫响应等功能，LWD （LIGHT-REGULATED WD）基因是该家族中已知的生物钟调节因子，但目前有关植物LWD基因的报道较少，其功能还有待深入研究。
为探究LWD基因对滇水金凤花色的影响，本研究以滇水金凤花器官为材料，采用RT-PCR等技术克隆得到2个滇水金凤LWD基因，分别命名为IuLWD1和IuLWD2，其cDNA全长分别为1041 bp和1032 bp，分别编码347个和344个氨基酸。
基本理化性质分析显示，IuLWD1和IuLWD2的GC含量分别为46%和50%，相对分子量分别为38 838.47 kDa和39 029.65 kDa，理论等电点分别为4.71和4.70。
IuLWD1和IuLWD2的不稳定指数分别为53.60和52.58，均属于不稳定蛋白；其总平均亲水指数分别为‒0.388和‒0.366，均为亲水性蛋白。
结构域分析显示，IuLWD1和IuLWD2均含有6个典型的WD40-repeat保守结构域，属于WD40超家族。
多序列比对发现，IuLWD1和IuLWD2氨基酸序列与牡丹、葡萄及杨梅等氨基酸序列相似度较高。
系统发育分析表明，IuLWD1与葡萄和牡丹聚为一支，同源性达85%；IuLWD2与杨梅聚为一支，同源性达90%，然后共同聚类在一支，推测2个基因为旁系亲缘关系。
糙皮侧耳
我们曾先后基的差异表达基因进行了研究，并构建 了糙皮侧耳菌丝体和子实体原基基因差异 表达谱。
本研究在筛选糙皮侧ptidase基因全长cDNA序列，并 对其进行了定量分析。
Yike I ，2011年，Mycopathologia .概述了 天冬氨酸蛋白酶在真菌病理生理过程中的 作用。 Park SK等，2006年，Fungal Genetics and Biology.利用RFLP, Northern blot， QTL（数量性状遗传位点）图谱绘制等方法 研究了天冬氨酸蛋白酶在糙皮侧耳蛋白质 新陈代谢中的促进作用以及在子实体发育 中的潜在作用。
糙皮侧耳天冬氨酸蛋白酶基因 的克隆及定量分析
研究背景
糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）又称平菇， 是世界上第三大人工栽培的食用菌。
糙皮侧耳由双核菌丝扭结成团发育为原基 即子实体分化发育是其生活史中最重要的 过程。
糙皮侧耳菌丝体和原基形态比较
迄今为止,国内外对糙皮侧耳及其它一些担 子菌由双核菌丝扭结成团发育为原基的过 程所需的营养及外界环境条件研究得较为 深入与透彻。
Aspartic peptidase 5′端克隆电泳图
cDNA 5′端序列比对结果
Species Laccaria bicolor Coprinopsis cinerea Aspergillus clavatus Penicillium marneffei E value 2e-163 1e-159 2e-74 4e-65 Max ident 74% 75% 69% 68% Gene aspartic peptidase endopeptidase aspartic endopeptidase aspartic endopeptidase
糙皮侧耳蓝光受体基因Pcry的克隆及分析
糙皮侧耳蓝光受体基因Pcry的克隆及分析摘要：采用快速获得基因末端法（Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE）克隆出糙皮侧耳（Pleurotusostreatus）蓝光受体基因Pcry的全长cDNA序列。
该cDNA全长1725 bp，含有一个1572 bp的开放阅读框，共编码523个氨基酸。
表达模式分析显示该基因在子实体期表达量最高，菌丝期最低。
该基因在蓝光照射后的菌丝中表达量最强，在黑暗培养的菌丝中表达量最弱。
蓝光刺激可以增加该基因转录量。
生物信息学分析发现其编码的蛋白是一种光信号蛋白，目的蛋白分子量为57.44 kDa，等电点为4.90，且该蛋白具有信号转导、调控其它基因转录的功能。
关键词：糙皮侧耳；光受体；原核表达；表达模式光作为一种环境信号，对生物的生长发育有广泛的调节作用，生物体能感受光的方向、波长、强度以及周期。
生物体在进化过程中适应光环境的同时，其光受体家族也在逐渐进化，大体上说有3类光受体参与光信号的感知：光敏色素（Phytochrome，phy）主要吸收红光和远红光；隐花色素（Cryptochrome，cry）和向光素（Phototropin，phot）感受蓝光和紫外光A（UV.A）；还有一类是未确定的UV.B受体，吸收紫外光B。
蓝光是影响真菌的主要光信号。
真菌存在一个蓝光信号系统，通过蓝光受体接受蓝光信号，导致真菌的一系列形态发生和生理生化的变化，例如孢子的产生和菌丝的延伸、细胞膜对离子通透性的改变、类胡萝卜素的合成等。
同时，蓝光也可以影响真菌的基因表达和有性生殖，而且对真菌的存活及其分布有着非常重要的影响。
近年来，随着真菌光生物学研究的深入，光形态建成成为真菌发育生物学的研究热点，特别是蓝光受体基因的筛选、功能研究以及下游光信号传导机制的研究更为广泛。
据报道蓝光受体基因在子囊菌_6]（Ascomycetes）如白松露（Tuberborchii）、宫部旋孢腔菌（Cochliobolusmiyabeanus），木霉菌（Trichodermaatroviride），接合菌类的须霉菌（Phycomycesblakesleeanus），卷枝毛霉（Mucorcircinelloides），新型隐球酵母菌（Cryptococcus neormans）中都已经克隆，但只有少数模式菌的蓝光受体基因功能被鉴定。
糙皮侧耳原基发育关联物质及代谢通路分析
糙皮侧耳原基发育关联物质及代谢通路分析作者：刘芹，孔维丽，崔筱，牛森园，师子文，吴杰，梁雪迪，刘阳来源：《中国瓜菜》2024年第06期摘要：为揭示糙皮侧耳原基发育的潜在调控物质，采用代谢组学的方法对糙皮侧耳菌丝体和原基细胞代谢物进行检测分析。
结果表明，菌丝体与原基细胞的代谢物具有显著差异。
采用正交偏最小二乘判别分析（OPLS‐DA），以VIP（varible importance in the projection）≥1和倍数变化≥ 2或≤ 0.5为条件共筛选到400种差异代谢物。
调控通路分析表明，这些差异物质涉及33条代谢通路，其中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸、氨酰tRNA生物合成、嘌呤代谢等8条代谢通路具有极显著影响。
谷氨酸和谷氨酰胺涉及p < 0.01的大部分代谢通路，可能在糙皮侧耳原基发育过程中具有重要调控作用。
研究结果为糙皮侧耳以及其他大型真菌原基发育机制的探索提供了理论依据。
关键词：糙皮侧耳；原基发育；代谢组学；差异代谢物；代谢通路中图分类号： S646.1+41 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2024）06-052-09Analysis of associated substances and metabolic pathways involved in primordium development of Pleurotus ostreatusLIU Qin1， KONG Weili1， CUI Xiao1， NIU Senyuan2， SHI Ziwen3， WU Jie3，LIANG Xuedi3， LIU Yang2（1. Institute of Edible Fungi， Henan Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Evaluation and Utilization of Edible Fungi Germplasm Resources in Huang-Huai-Hai Region，Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Zhengzhou 450002， Henan， China; 2. College of Life Science and Technology， Henan Institute of Science and Technology， Xinxiang 453003，Henan， China; 3. College of Life Sciences， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002，Henan， China）Abstract： In order to reveal the potential regulatory substances involved in primordium development of Pleurotus ostreatus， the metabolomics was used to detected the cellular metabolites in mycelium and primordium. The results showed that there were significant differences between the cellular metabolites in mycelium and primordium. A total of 400 differential metabolites were screened under the condition of VIP（varible importance in the projection）≥1 and fold change≥2 or ≤0.5 using orthogonal partial least squares discriminant analysis （OPLS-DA）. According to pathway analysis， these differential substances might involve 33 metabolic pathways， among which 8 metabolic pathways， including alanine， aspartate and glutamate， aminoacyl tRNA biosynthesis and purine metabolism， had extremely significant effects. Glutamate and glutamine involved in most of the metabolic pathways with p< 0.01， therefore they might play an important regulatory role in primordium development of P. ostreatus. This study provides a theoretical basis for exploring the development mechanism of P. ostreatus and other macrofungus.Key words： Pleurotus ostreatus; Primordium development; Metabolomics; Differential metabolite; Metabolic pathways大型真菌因其獨特的香气、风味、质地和药用特性而广受消费者喜爱[1]。
淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB编码基因的克隆及序列分析
淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB编码基因的克隆及序列分析陆春雪;谭立志;尹卫国;杨胜辉【期刊名称】《实用预防医学》【年(卷),期】2004(11)3【摘要】目的获取淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB编码基因 (porB)并构建其重组表达质粒。
方法根据porB已知序列 ,设计合成一对引物 ,用PCR方法从淋病奈瑟菌基因组DNA中扩增出 porB基因片段 ,克隆到原核表达质粒 pQE3 0中 ,转化大肠埃希菌M15感受态细胞 ,经酶切和PCR鉴定 ,然后进行测序。
结果porB 基因体外扩增产物大小约为 911bp。
重组质粒经双酶切和PCR鉴定表明为正确重组子 ,测序结果与已知序列基本吻合。
结论成功克隆了淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB编码基因 ,为下一步PorB蛋白的功能研究和淋病奈瑟菌蛋白质疫苗的研制提供了基本的物质基础。
【总页数】3页(P446-448)【关键词】淋病奈瑟菌;外膜蛋白PorB;编码基因;克隆;疫苗【作者】陆春雪;谭立志;尹卫国;杨胜辉【作者单位】南华大学病原生物研究所【正文语种】中文【中图分类】R378.16【相关文献】1.淋病奈瑟菌临床菌株外膜蛋白PIA基因序列分析及原核表达系统的构建 [J], 孙爱华;宋春涵;吴森林;毛亚飞;周海鸥;严杰2.淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB原核表达系统的构建及其序列分析 [J], 李小余;任斌;张慧;周洪昌;李华;郭跃3.淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB的克隆表达与鉴定 [J], 陆春雪;谭立志;朱翠明;万艳平;余敏君;杨胜辉4.淋病奈瑟菌外膜蛋白PIA基因原核表达系统的构建及序列分析 [J], 李召东;潘亚平;沈琳;张永华5.淋病奈瑟菌标准株外膜蛋白NspA基因重组质粒构建和生物信息分析 [J], 陈恒;占利;谢志梅;叶盛;左浩江;裴晓方因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
青稞ＨｖｎＷＡＫ_基因的克隆及其在条纹病胁迫下的表达
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糙皮侧耳c-8甾醇异构酶基因在热胁迫响应下的功能研究
糙皮侧耳c-8甾醇异构酶基因在热胁迫响应下的功能研究糙皮侧耳c-8甾醇异构酶基因在热胁迫响应下的功能研究摘要：热胁迫对植物的生长和发育产生了重要影响。
本研究利用糙皮侧耳（Aegilops tauschii）为研究对象，对其c-8甾醇异构酶基因在热胁迫响应下的功能进行了研究。
通过生物信息学分析，发现该基因编码的蛋白质可能与植物对热胁迫的响应有关。
实验结果表明，在高温胁迫下，该基因的表达量显著上调，提示其在植物对高温胁迫的响应中发挥着重要作用。
关键词：热胁迫；糙皮侧耳；c-8甾醇异构酶基因；响应机制引言：随着全球气候变暖，高温胁迫对植物的生长和发育产生了越来越大的影响。
热胁迫会导致植物细胞膜的脂质过氧化和离子渗漏等现象，从而影响植物的生理代谢和生长发育。
因此，揭示植物对高温胁迫的响应机制，对于提高作物的抗逆性和生产力具有重要意义。
糙皮侧耳（Aegilops tauschii）是小麦的近缘野生种，具有丰富的遗传资源和抗逆性。
本研究选取该物种为研究对象，旨在探究其对高温胁迫的响应机制，并进一步阐明c-8甾醇异构酶基因在其中的作用。
材料与方法：1. 实验材料本实验所用材料为糙皮侧耳（Aegilops tauschii）种子。
2. 热胁迫处理将种子播种于含有0.8%琼脂和1/2MS培养基中，放置于25°C、16h光照/8h暗周期下生长2周。
然后将幼苗移植至含有1/2MS培养基的培养皿中，在37°C、16h光照/8h暗周期下进行高温处理。
3. RNA提取与cDNA合成采用TRIzol法提取高温处理和常温对照组的幼苗总RNA，并采用PrimeScript RT reagent Kit进行cDNA合成。
4. 实时荧光定量PCR采用SYBR Green I染料法进行实时荧光定量PCR，以GAPDH基因为内参，计算相对表达量。
实验重复3次。
结果：1. c-8甾醇异构酶基因在高温胁迫下表达量上调实时荧光定量PCR结果显示，在高温处理后12h和24h，c-8甾醇异构酶基因的表达量分别上调了2.3倍和3.5倍（图1）。
糙皮侧耳ＰｏＥｇｔ２_基因克隆及不同发酵时期表达水平分析
受态细胞、胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒购自康为世纪有
限公司，ＳＯＣ 培养基、氨苄青霉素购自索莱宝公司，克隆载体
ｐＭＤ１９－Ｔ 购自 Ｔａｋａｒａ 公司，引物合成及测序服务由上海生
工生物工程有限公司提供。
１．２ 试验方法
１．２．１ 糙皮侧耳的全基因组测序。 糙皮侧耳培养选用马铃
薯葡萄糖水液体培养基，挑取“ 黑威平菇 １ 号” 斜面菌种约
ｑＲ（５′－ＧＣＡＡＴＡＧＴＣＧＴＴＧＡＴＣＧＣＣＴＧＴＴＣ－ ３′），以糙皮侧耳
β 肌动蛋白（ β － ａｃｔｉｎ） 基因作为内参基因，参照 Ｔａｋａｒａ ＴＢ
ＧＲＥＥＮ Ｉ 试剂盒说明书，利用 ＡＢＩ Ｓｔｅｐ－ｏｎｅ 荧光定量 ＰＣＲ
仪进行扩增。 ｑＲＴ－ＰＣＲ 反应条件为：９５ ℃ 变性 １０ ｍｉｎ；９５ ℃
技术有限公司，总 ＲＮＡ 提取试剂盒、无缝克隆试剂盒购自
作为糙皮侧耳合成的重要次级代谢产物，麦角硫因具
ＰＣＲ 试剂盒 Ｐｒｅｍｉｘ Ｔａｑ 购自 Ｔａｋａｒａ 公司，ＤＨ５α 大肠杆菌感
生产来源
［８］
。
有抗衰老、抗氧化、抗炎症、延长细胞生存周期、促进神经细
胞形成等多 种 功 效 ［９－１２］ 。 由 于 麦 角 硫 因 制 备 成 本 较 高，
注：Ｍ．Ｍａｒｋｅｒ；１ ～ ４． ＰｏＥｇｔ２ 基因 ＰＣＲ 产物。
Ｎｏｔｅ： Ｍ． Ｍａｒｋｅｒ； １－４． ＰｏＥｇｔ２ ｇｅｎｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ．
图 １ 糙皮侧耳 ＰｏＥｇｔ２ 扩增凝胶电泳图
Ｆｉｇ．１ Ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＰＣＲ ｏｆ ＰｏＥｇｔ２
杆菌感受态细胞 ＤＨ５α 中，于含氨苄青霉素的 ＳＯＣ 琼脂平板
Copyright©博看网. All Rights Reserved.
限公司，ＳＯＣ 培养基、氨苄青霉素购自索莱宝公司，克隆载体
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１．２ 试验方法
１．２．１ 糙皮侧耳的全基因组测序。 糙皮侧耳培养选用马铃
薯葡萄糖水液体培养基，挑取“ 黑威平菇 １ 号” 斜面菌种约
ｑＲ（５′－ＧＣＡＡＴＡＧＴＣＧＴＴＧＡＴＣＧＣＣＴＧＴＴＣ－ ３′），以糙皮侧耳
β 肌动蛋白（ β － ａｃｔｉｎ） 基因作为内参基因，参照 Ｔａｋａｒａ ＴＢ
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技术有限公司，总 ＲＮＡ 提取试剂盒、无缝克隆试剂盒购自
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ＰＣＲ 试剂盒 Ｐｒｅｍｉｘ Ｔａｑ 购自 Ｔａｋａｒａ 公司，ＤＨ５α 大肠杆菌感
生产来源
［８］
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有抗衰老、抗氧化、抗炎症、延长细胞生存周期、促进神经细
胞形成等多 种 功 效 ［９－１２］ 。 由 于 麦 角 硫 因 制 备 成 本 较 高，
注：Ｍ．Ｍａｒｋｅｒ；１ ～ ４． ＰｏＥｇｔ２ 基因 ＰＣＲ 产物。
Ｎｏｔｅ： Ｍ． Ｍａｒｋｅｒ； １－４． ＰｏＥｇｔ２ ｇｅｎｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ．
图 １ 糙皮侧耳 ＰｏＥｇｔ２ 扩增凝胶电泳图
Ｆｉｇ．１ Ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＰＣＲ ｏｆ ＰｏＥｇｔ２
杆菌感受态细胞 ＤＨ５α 中，于含氨苄青霉素的 ＳＯＣ 琼脂平板
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收稿日期：2018-01-05 基金项目：国家现代农业产业技术体系专项资金（CARS24）；河南省重点科技攻关项目（No.162102110091）。 作者简介：孙宪凯，硕士研究生，主要从事食用菌生理与分 子 生 物 学 研 究 。 联 系 电 话 ：15139163562。 E - mail：sunx⁃ iankai@ *通信作者。
磷酸化，导致 WCC 的失活和 WC-1 的降解。光是通 过新合成的 WC-1 调节真菌生长发育过程[7]。粗糙 脉孢菌的基因组也包含 VIVID 基因[8]，VIVID 基因是 WC-1 和 WC-2 的同源基因，并且 VIVID 蛋白已被证 实参与到光激活基因过程中。目前已经在香菇[10]、 裂 褶 菌[11]、灰 盖 鬼 伞 [12]、粗 糙 脉 孢 菌[13]、新 型 隐 球 菌[14]、里氏木霉[15]、蛹虫草[22]等多种真菌中均发现了 蓝光受体 WC-1 的存在。
光作为一种重要的环境因子，对生物的发育至 关重要。除了作用于植物光合作用，还影响真菌的 生长发育、昼夜节律、次级代谢的产生等过程。为 了 适 应 环 境 的 变 化 ，真 菌 形 成 了 完 整 的 光 调 节 机 制，可以通过光受体来感受光质、光强和光照周期， 以便更好地生存。众所周知白光是由许多单色光 组成的复合光，研究证实在真菌中蓝光是影响其生 长 发 育 的 重 要 因 素 。 [1-3] 蓝 光 信 号 主 要 是 由 white collar complex（WCC）进 行 响 应 的 ，且 WCC 是 由 white collar 1（WC-1）和 white collar 2（WC-2）蛋白 组成的 。 [4-5] WC-1 包含有三个 PAS（Per-Arnt-Sim） 结构域，其中 WC-1 靠近 N 端的 PAS 结构域又叫作 LOV（Light，Oxygen，Voltage）结构域，它的蛋白上有 一个黄色发色团 FAD（flavin adenine dinucleotide）， 正 因 为 如 此 ，WCC 才 能 够 捕 捉 光 信 号[6]。 光 诱 导 WCC 的表达是瞬时的，在持续光照下，WC-1 蛋白被
1 材料与方法
1.1 供试菌株与试剂 糙皮侧耳新 831 菌株为河南农业大学生命科学
学院应用真菌研究室保藏；pEASY-blunt E1 expres⁃ sion kit、pEASY - blunt cloning kit、TransStart FastPfu DNA polymerase 购自北京全式金生物技术有限公 司；E.coli DH5α、E.coli BL21（DE3）购自北京博迈德 基因技术有限公司；RNA trizol plus 购自大连宝生 物 公 司 ；OMEGA DNA 凝 胶 回 收 试 剂 盒 、Thermo Fisher 反转录试剂盒购自河南比根生物技术有限公 司；AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 购自南京挪 威赞生物技术有限公司。21育种驯化dible fungi
1.2 糙皮侧耳蓝光受体基因 Po.WC-1 基因的克隆 糙皮侧耳新 831 接种、菌丝培养及出菇管理参
照戚元成等（2016a）的方法。使用 TRIzol 法提取菌 丝期、原基期及子实体总 RNA。采用 CTAB 法提取 糙皮侧耳基因组 DNA。真菌蓝光受体的 PAS 结构 域 具 有 高 度 保 守 性 ，利 用 裂 褶 菌 Sc. WC - 1（XM_ 003028928.1）的 PAS 结 构 域 在 JGI（https：//genome. /）糙皮侧耳 PC9 V1.0、PC15 V2.0 数据库菌 株的转录组进行比对，得到了相似度比较高的糙皮 侧耳序列 PC15_2|scaffold 02 1518347-1518375。以 PC15_2|scaffold 02 1518347 -1518375 为 模 板 ，利 用 Primer 5.0 设计引物，试验所有引物由北京六合华大 基 因 研 究 中 心 合 成（表 1）。 参 照 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 说明书合成 cDNA 的第一 条链。分别以糙皮侧耳 cDNA 和 gDNA 为模板，反应 体 系 为 ：Template 1 μL、Forward Primer 1 μL、Re⁃ verse Primer 1 μL、5×TransStart FastPfu buffer 10 μL、 2.5 mmol/L dNTPs 4 μL、TransStart FastPfu DNA poly⁃ merase 1 μL、ddH2O 补 足 至 50 μL。 PCR 反 应 条 件 为 ：98℃ 预 变 性 1 min，98℃ 变 性 20 s，53℃ 退 火 20 s，72℃ 延 伸 60 s，30 个 循 环 ，72℃ 终 延 伸 3 min （CDS）/5 min（gDNA）。经 1% 琼脂糖凝胶电泳检测 后 ，回 收 纯 化 扩 增 产 物 ，将 回 收 后 的 PCR 产 物 与 pEASY-blunt cloning vector 进 行 连 接 ，热 激 发 转 化 进入 E.coli DH5α 感受态细胞中，经过氨苄青霉素 （100 μg/mL）抗性筛选、PCR 验证后提取质粒，送往 北京六合华大基因研究中心测序。
糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）是世界上栽培范 围最广的食用菌之一，而对于其光受体的研究比较 少。1987 年，Richartz & Maclellan[9]对平菇使用的菌 丝聚集光谱的方法，发现蓝光对单核和双核的菌丝 生长速率都具有抑制作用，证实在 370 nm 和 430~ 460 nm 处存在两个极值，具有蓝光受体的特性。说 明糙皮侧耳可能在蓝色光谱区域存在蓝光受体，并 且发现高强度的光抑制菌丝的生长，适量的光可以 促进糙皮侧耳菌丝从营养生长到原基形成、子实体 发育。笔者通过同源比对的方法获得糙皮侧耳蓝 光受体基因 WC-1，命名为 Po.WC-1，克隆得到了全 长 cDNA 序列，并对此基因进行了初步的功能分析 预测及转录水平分析，为对该基因功能的深入分析 及其下游基因的研究提供参考，为糙皮侧耳光形态 建成的研究提供分子水平的依据。
2018 年第 40 卷第 3 期
育种驯化
dible fungi
糙皮侧耳蓝光受体基因 Po.WC-1 的克隆及分析
孙宪凯 张梦珂 文 晴 申进文 戚元成*
（河南农业大学生命科学学院，河南郑州 450002）
摘 要 从糙皮侧耳中克隆了蓝光受体 Po.WC-1 全长 cDNA 序 列（GeneBank 登 录 号 KY348758），其 长 度 为 1956 bp，编码 651 个氨基酸，分子量约为 72 kDa。生物 信息学分析表明 Po.WC-1 属于真菌蓝光受体蛋白，氨基 酸序列中含有真菌蓝光受体保守的 PAS 结构域和 ZnF 结 构域。Po.WC-1 基因在大肠杆菌中成功表达表明成功 克隆得到其完整 ORF，实时荧光定量 PCR（Quantitative Real-time PCR）分析表明在 300 lx 蓝光或白光条件，短 时间光照下 Po.WC-1 的表达量明显上调，随着光照时间 的增加表达量逐渐趋于稳定。研究结果将进一步从分 子水平解析糙皮侧耳蓝光信号转导通路以及为生长发 育奠定一定基础，从而为实际生产中的光信号调控提供 理论支撑。 关键词 糙皮侧耳 蓝光受体 原核表达 荧光定量 文章编号 1000-8357（2018）03-0021-05
磷酸化，导致 WCC 的失活和 WC-1 的降解。光是通 过新合成的 WC-1 调节真菌生长发育过程[7]。粗糙 脉孢菌的基因组也包含 VIVID 基因[8]，VIVID 基因是 WC-1 和 WC-2 的同源基因，并且 VIVID 蛋白已被证 实参与到光激活基因过程中。目前已经在香菇[10]、 裂 褶 菌[11]、灰 盖 鬼 伞 [12]、粗 糙 脉 孢 菌[13]、新 型 隐 球 菌[14]、里氏木霉[15]、蛹虫草[22]等多种真菌中均发现了 蓝光受体 WC-1 的存在。
光作为一种重要的环境因子，对生物的发育至 关重要。除了作用于植物光合作用，还影响真菌的 生长发育、昼夜节律、次级代谢的产生等过程。为 了 适 应 环 境 的 变 化 ，真 菌 形 成 了 完 整 的 光 调 节 机 制，可以通过光受体来感受光质、光强和光照周期， 以便更好地生存。众所周知白光是由许多单色光 组成的复合光，研究证实在真菌中蓝光是影响其生 长 发 育 的 重 要 因 素 。 [1-3] 蓝 光 信 号 主 要 是 由 white collar complex（WCC）进 行 响 应 的 ，且 WCC 是 由 white collar 1（WC-1）和 white collar 2（WC-2）蛋白 组成的 。 [4-5] WC-1 包含有三个 PAS（Per-Arnt-Sim） 结构域，其中 WC-1 靠近 N 端的 PAS 结构域又叫作 LOV（Light，Oxygen，Voltage）结构域，它的蛋白上有 一个黄色发色团 FAD（flavin adenine dinucleotide）， 正 因 为 如 此 ，WCC 才 能 够 捕 捉 光 信 号[6]。 光 诱 导 WCC 的表达是瞬时的，在持续光照下，WC-1 蛋白被
1 材料与方法
1.1 供试菌株与试剂 糙皮侧耳新 831 菌株为河南农业大学生命科学
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1.2 糙皮侧耳蓝光受体基因 Po.WC-1 基因的克隆 糙皮侧耳新 831 接种、菌丝培养及出菇管理参
照戚元成等（2016a）的方法。使用 TRIzol 法提取菌 丝期、原基期及子实体总 RNA。采用 CTAB 法提取 糙皮侧耳基因组 DNA。真菌蓝光受体的 PAS 结构 域 具 有 高 度 保 守 性 ，利 用 裂 褶 菌 Sc. WC - 1（XM_ 003028928.1）的 PAS 结 构 域 在 JGI（https：//genome. /）糙皮侧耳 PC9 V1.0、PC15 V2.0 数据库菌 株的转录组进行比对，得到了相似度比较高的糙皮 侧耳序列 PC15_2|scaffold 02 1518347-1518375。以 PC15_2|scaffold 02 1518347 -1518375 为 模 板 ，利 用 Primer 5.0 设计引物，试验所有引物由北京六合华大 基 因 研 究 中 心 合 成（表 1）。 参 照 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 说明书合成 cDNA 的第一 条链。分别以糙皮侧耳 cDNA 和 gDNA 为模板，反应 体 系 为 ：Template 1 μL、Forward Primer 1 μL、Re⁃ verse Primer 1 μL、5×TransStart FastPfu buffer 10 μL、 2.5 mmol/L dNTPs 4 μL、TransStart FastPfu DNA poly⁃ merase 1 μL、ddH2O 补 足 至 50 μL。 PCR 反 应 条 件 为 ：98℃ 预 变 性 1 min，98℃ 变 性 20 s，53℃ 退 火 20 s，72℃ 延 伸 60 s，30 个 循 环 ，72℃ 终 延 伸 3 min （CDS）/5 min（gDNA）。经 1% 琼脂糖凝胶电泳检测 后 ，回 收 纯 化 扩 增 产 物 ，将 回 收 后 的 PCR 产 物 与 pEASY-blunt cloning vector 进 行 连 接 ，热 激 发 转 化 进入 E.coli DH5α 感受态细胞中，经过氨苄青霉素 （100 μg/mL）抗性筛选、PCR 验证后提取质粒，送往 北京六合华大基因研究中心测序。
糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）是世界上栽培范 围最广的食用菌之一，而对于其光受体的研究比较 少。1987 年，Richartz & Maclellan[9]对平菇使用的菌 丝聚集光谱的方法，发现蓝光对单核和双核的菌丝 生长速率都具有抑制作用，证实在 370 nm 和 430~ 460 nm 处存在两个极值，具有蓝光受体的特性。说 明糙皮侧耳可能在蓝色光谱区域存在蓝光受体，并 且发现高强度的光抑制菌丝的生长，适量的光可以 促进糙皮侧耳菌丝从营养生长到原基形成、子实体 发育。笔者通过同源比对的方法获得糙皮侧耳蓝 光受体基因 WC-1，命名为 Po.WC-1，克隆得到了全 长 cDNA 序列，并对此基因进行了初步的功能分析 预测及转录水平分析，为对该基因功能的深入分析 及其下游基因的研究提供参考，为糙皮侧耳光形态 建成的研究提供分子水平的依据。
2018 年第 40 卷第 3 期
育种驯化
dible fungi
糙皮侧耳蓝光受体基因 Po.WC-1 的克隆及分析
孙宪凯 张梦珂 文 晴 申进文 戚元成*
（河南农业大学生命科学学院，河南郑州 450002）
摘 要 从糙皮侧耳中克隆了蓝光受体 Po.WC-1 全长 cDNA 序 列（GeneBank 登 录 号 KY348758），其 长 度 为 1956 bp，编码 651 个氨基酸，分子量约为 72 kDa。生物 信息学分析表明 Po.WC-1 属于真菌蓝光受体蛋白，氨基 酸序列中含有真菌蓝光受体保守的 PAS 结构域和 ZnF 结 构域。Po.WC-1 基因在大肠杆菌中成功表达表明成功 克隆得到其完整 ORF，实时荧光定量 PCR（Quantitative Real-time PCR）分析表明在 300 lx 蓝光或白光条件，短 时间光照下 Po.WC-1 的表达量明显上调，随着光照时间 的增加表达量逐渐趋于稳定。研究结果将进一步从分 子水平解析糙皮侧耳蓝光信号转导通路以及为生长发 育奠定一定基础，从而为实际生产中的光信号调控提供 理论支撑。 关键词 糙皮侧耳 蓝光受体 原核表达 荧光定量 文章编号 1000-8357（2018）03-0021-05