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水貂阿留申病毒检测方法研究进展刘艺;刘亚东;杜锐;冷雪;时坤;李健明;曾范利;宗颖;宫庆龙;张姗姗;孙志博【摘要】水貂阿留申病是由水貂阿留申病毒引起的以浆细胞增多为主要特征的慢性、消耗性、病毒性传染病.主要侵害水貂的免疫系统,导致机体免疫系统紊乱引起的器官衰竭,病死率极高,严重损害了水貂养殖产业的经济利益,该病存在于绝大多数养殖水貂的国家和地区.目前,能有效预防该病的疫苗尚未研制成型,该病的防控已成为水貂养殖领域的世界性难题,在防控方面主要采取淘汰检疫阳性水貂的办法.论文主要针对目前该病在国内外检测方法的特点和流行情况进行阐述,以期为水貂阿留申病快速检测方法的建立及水貂阿留申病的有效防控提供参考.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2018(039)010【总页数】4页(P74-77)【关键词】阿留申病毒;检测方法;防控【作者】刘艺;刘亚东;杜锐;冷雪;时坤;李健明;曾范利;宗颖;宫庆龙;张姗姗;孙志博【作者单位】吉林农业大学,吉林长春 130118;吉林农业大学,吉林长春 130118;吉林农业大学,吉林长春 130118;吉林农业大学,吉林长春 130118;吉林农业大学,吉林长春 130118;吉林农业大学,吉林长春 130118;吉林农业大学,吉林长春 130118;吉林农业大学,吉林长春 130118;吉林农业大学,吉林长春 130118;吉林农业大学,吉林长春 130118;吉林农业大学,吉林长春 130118【正文语种】中文【中图分类】S852.659.2水貂阿留申病(Aleutian disease of mink,ADM)是一种能够令宿主终生携带并引起机体免疫系统紊乱的毒血症。
水貂阿留申病毒(Aleutian disease virus，ADV)感染幼貂，可在其肺泡Ⅱ型细胞高效复制，引起急性致死性间质性肺炎，而感染成年貂，则主要感染淋巴结巨噬细胞，呈低水平病毒复制，引起以脾肿大、高丙种球蛋白血症、浆细胞增多、动脉炎、免疫复合物型肾小球肾炎为特征的慢性疾病，可致使水貂消瘦，繁殖力低下[1-2]。
·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘 要：为快速检测水貂圆环病毒（MiCV ），本试验根据MiCV Cap 基因序列设计合成特异性引物，建立了水貂圆环病毒SYBR Green II 实时荧光定量PCR 检测方法。
结果显示，该方法在模板浓度为1.0×106 ~1.0×101 copies/μL 范围内呈良好线性关系，相关系数为0.9983。
本试验建立的检测方法对水貂阿留申病毒、猪圆环病毒2型、水貂肠炎病毒、犬瘟热病毒和猪伪狂犬病毒进行检测均无特异性扩增，批内和批间CV 均小于2%，对重组阳性质粒的检测下限为1.0×101 copies/μL ，比普通PCR 的敏感度高100倍，对阳性样品DNA 的检测下限为2.38×10-2 pg/µL ，比普通PCR 的敏感度高1000倍。
应用该方法对吉林省部分毛皮动物养殖场的水貂、狐狸、貉和环境样品进行检测，结果其阳性率分别为57.23%、48.42%、39.71%和68.48%。
上述结果表明，本研究建立的实时荧光定量PCR 检测方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性，为MiCV 的诊断及流行病学调查提供技术支持。
关键词：水貂圆环病毒；Cap 基因；SYBR Green II 实时荧光定量PCR 方法中图分类号：S852.65文献标志码：A文章编号：1674-6422（2024）02-0131-08Development and Application of a Real-time Fluorescence Quantitative PCR DetectionMethod for Mink Circovirus收稿日期：2022-03-03基金项目：吉林省科技发展计划项目（20190304004YY）作者简介：盛陈艳，女，硕士，主要从事经济动物疫病研究通信作者：冷雪，E-mail：******************水貂圆环病毒实时荧光定量PCR 检测方法的建立与应用盛陈艳1，麻宝艺1，李健明2，宫庆龙1，刘 菲1，时 坤2，孙志博5，刘 艺1，冷 雪2，杜 锐2,3,4（1.吉林农业大学动物科学技术学院，长春130118；2.吉林农业大学中药材学院，长春130118；3.动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，长春130118；4.吉林省梅花鹿高效养殖和产品开发技术工程研究中心，长春130118；5.吉林农业科技学院，吉林132101）2024,32(2):131-138Abstract: Specifi c primers were designed according to the Mink circovirus (MiCV) cap gene sequence and synthesized for development of a SYBR Green II real-time fl uorescence quantitative PCR. The results showed that the method had a good linear relationship in the template concentration range of 1.0×106 copies/μL to 1.0×101 copies/μL and the correlation coefficient was 0.9983. This detection method also had no amplifi cations for AMDV , PCV2, MEV , CDV and PRV . The intra-assay and inter-assay CV were less than 2%. The lower limit of recombinant positive plasmid was 1.0×101 copies/μL, which was 100 times more sensitive than the conventional PCR. In addition, the lower limit of detection for DNA of positive samples was 2.38×10-2 pg/µL, which was 1000 times more sensitive than the conventional PCR. Samples were collected from minks, foxes, raccoon dogs and environmental resources on some fur animal farms in Jilin provinceSHENG Chenyan 1, MA Baoyi 1, LI Jianming 2, GONG Qinglong 1, LIU Fei 1, SHI Kun 2, SUN Zhibo 5,LIU Yi1, LENG Xue 2, DU Rui 2,3,4(1. College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2. College of Chinese Medicine Materials, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 3. Key Laboratory of Animal Production and Product Quality Safety of Ministry of Education, Changchun 130118, China; 4. Jilin Provincial Engineering Research Center for Efficient Breeding and Product Development of Sika Deer, Changchun 130118, China; 5. Jilin Agricultural Science and Technology University, Jilin 132101, China)· 132 ·中国动物传染病学报2024年4月水貂圆环病毒（Mink circovirus, MiCV）是2014年新发现的一种圆环病毒[1]，水貂感染该病毒后，表现为食欲不佳、精神倦怠、被毛粗乱、腹泻等[2]，且容易引起其他疾病的混合感染[3]。
附录A水貂阿留申病毒荧光PCR检测方法的实验室规范
A.1 实验室设置要求
实验室设置要求如下：
——实验室分为三个相对独立的区域：样本制备区、反应混合物配置区和检测区；
——工作区域须有明确标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用；
——每一区域须有专用的仪器设备
——整个实验过程中均须使用无RNA酶的一次性耗材，用到的玻璃器皿使用前须250 ℃干烤4 h以上，以彻底去除RNA酶；
——各区域的一起设备须有明确标记，以避免设备物品从各自的区域移出，造成不同的工作区域间设备物品发生混淆；
——进入各个工作区域严格遵循单一方向顺序，即只能从样本制备区、扩增反应混合物配置区至检测区；
——在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服，以便于鉴别；离开工作区时，不得将各区特定的工作服带出；
——实验室清洁时应该样本制备区、扩增反应混合物配置区至检测区的顺序进行；
——不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染。
A.2 工作区域仪器设备配置
A.2.1 样本制备区
样本制备区需配置如下仪器设备：
——2℃～8℃冰箱；
——-20℃冰箱；
——高速台式冷冻离心机（4℃，12000r/min）；
——混匀器；
——微量加样器（0.1μL～10μL，5μL～20μL，20μL～200μL，200μL～1000μL）；
——可移动紫外灯（近工作台面）。
A.2.2 检测区
检测区需配置如下仪器设备：
——荧光PCR仪（配计算机）；
——移动紫外灯；
——打印机。
A.3 各工作区域功能及注意事项
A.3.1 样本制备区
样本制备区的功能及注意事项如下：
——样本的保存，核酸提取、贮存及其加入至扩增反应管在样本制备区进行；
——避免在本区域内不必要的走动。
可在本区域内设立正压条件以避免邻近区的气溶胶进入本区造成污染。
为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须立即盖严含
反应混合物的反应管；
——用过的加样器吸头必须放入专门的消毒（例如含次氯酸钠溶液）容器内。
实验室桌椅表面每次工作后都要清洁，实验材料（原始样本、提取过程中样本与试剂的混合
液等）如出现外溅，必须作清洁处理并作出记录；
——对实验台适当的紫外照射（254 nm波长，与工作台面近距离）适合于灭活去污染。
工作后通过移动紫外线灯管来确保实验台面的充分照射。
A.3.2 反应混合物配置区
反应混合物配置区功能及注意事项如下：
——试剂的分装和反应混合液的制备在本区进行；
——用于标本制备的试剂应直接运送至反应混合物配置区，不能经过检测区，在打开含有反应混合液的离心管或试管前，应将其快速离心数秒；
——在整个本区的实验操作过程中，操作者必须戴手套，并经常更换。
工作结束后必须立即对工作区进行清洁。
本工作区的实验台表面应可耐受诸如次氯酸钠等的化学物
质的消毒清洁作用。
实验台表面用可移动紫外灯（254nm波长）进行照射。
A.3.3 检测区
检测区的功能及注意事项如下：
——PCR扩增及扩增片段的分析在本区内进行；
——本区注意避免通过本区的物品及工作服将扩增产物带出。
为避免气溶胶所致的污染，应尽量减少在本区内的走动；
——完成操作及每天工作后都必须对实验台面进行清洁和消毒，紫外照射方法与前面区域相同。
如有溶液溅出，必须处理并作出记录。
本区的清洁消毒和紫外照射方法同
前面区域。
