实验植物根系活力的测定
植物根系是活跃的吸收器官和合成器官，根的生长情况和活力水平直接影响地上部的生长和营养状况及产量水平。本实验学习测定根系吸收面积和活力的方法。
一、根系总吸收面积和活跃吸收面积的测定
【原理】
根据植物矿质吸收的理论，植物对溶质的最初吸收具有吸附的特性，并假定这时在根系表面均匀地覆盖了一层被吸附物质的单分子层，因此可以根据根系对某种物质的吸附量来测定根的吸收面积。常用甲烯蓝作为被吸附物质，它的被吸附量可以根据供试液浓度的变化用比色法准确地测出。已知1mg甲烯蓝成单分子层时所占面积为，据此即可求出根系的总吸收面积。当根系在甲烯蓝溶液中已达到吸附饱和而仍留在溶液中时，根系的活跃部分能把原来吸附的物质吸收到细胞中去，因而继续吸附甲烯蓝。从后一吸附量求出活跃吸收面积，可作为根系活力指标。
【仪器与用具】
分光光度计1台；100ml烧杯3只；50或100ml量筒1个（依根系大小而定）；吸量管1ml 1支，10ml 1支；试管（15×150mm）10支；容量瓶1000ml 1个，100ml 1个；吸水纸适量；试管架1个。
【试剂】
L甲烯蓝溶液：精确称取甲烯蓝（C16H18N3SCl·3H2O），加水溶解，定容至1000ml。此溶液每ml含甲烯蓝。
ml的甲烯蓝溶液：用刻度吸管吸取L甲烯蓝定容至100ml，摇匀即成。
【方法】
1．植物材料的准备本实验最好采用水培或砂培植物，以获得完整而无损伤的根系。玉米根系发达，是较好的材料。如无水培、砂培试材，也可用盆栽植物，用水将盆土仔细冲净后使用。田间栽培的材料因不可能无损地挖出全部根系，最好避免在正式试验中使用。
2．甲烯蓝溶液标准曲线的制作取试管7支编号，按表14-1次序加入各溶液，即成甲烯蓝系列标准液。
表14-1 各试剂加入顺序
试管号 1 2 3 4 5 6 7
ml甲烯蓝溶液(ml) 蒸馏水(ml)
甲烯蓝浓度mg/ml 0
10
1
9
2
8
4
6
6
4
8
2
10
以第1管（水）为参比在分光光度计下比色，取波长660nm，读出光密度，以甲烯蓝浓度为横坐标，光密度为纵坐标绘成标准曲线。
3．取待测植物根系用滤纸将水吸干再用排水法在量杯或量筒中测定其根系体积。把L 甲烯蓝溶液分别倒在三个编号的小烧杯里，每杯中溶液量约10倍于根的体积，准确记下每
杯的溶液用量。
4．取根系，用吸水纸小心吸干数次，慎勿伤根，然后顺次浸入盛有甲烯蓝溶液的烧杯中，每杯中浸。注意每次取出时都要使甲烯蓝溶液能从根上流回到原烧杯中。
植物名称
杯中甲烯蓝溶液量(ml)
开始时甲烯蓝浓度(mg/ml)
浸根后 溶液浓度 (mg/ml) 烧杯1 烧杯2 烧杯3 被吸收的 甲烯蓝量 (mg)
烧杯1 烧杯2 烧杯1＋2 烧杯3
根体积(ml)
根吸收 面积m 2
总的
活跃的 活跃/总的(%)
比表面
总的
活跃的
5．从三个烧杯中各取1ml 溶液加入试管，均稀释10倍，测得其光密度，查标准曲线，求出每杯浸入根系后溶液中剩下的甲烯蓝毫克数。
6．把结果记入表14-2，并以下式求出根的吸收面积： 总吸收面积（m 2）= [(C 1－C 1ˊ)×V 1] ＋ [(C 2－C 2ˊ)×V 2]× 活跃吸收面积（m 2）= [(C 3－C 3ˊ)×V 3]×
活跃吸收面积（%）=活跃吸收面积/总吸收面积×100 比表面＝根的总吸收面积/根的体积 式中 C —溶液原来的浓度mg/ml ； C ˊ—浸提后的浓度mg/ml ； 1,2,3—烧杯编号。
二、氯化三苯基四氮唑(TTC)法测定根系活力
【原理】
氯化三苯基四氮唑（TTC ）是标准氧化还原电位为80mV 的氧化还原物质，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯基甲 （TTF ），如下式：
(TTC)
(TTF)
+
Cl
+C
N N N
N +2H
C
N N N
N
H
HCl
生成的TTF比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以TTC被广泛地用作酶试验的氢受体，植物根所引起的TTC还原，可因加入琥珀酸、延胡索酸、苹果酸得到增强，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC还原量能表示脱氢酶活性，并作为根系活力的指标。
【仪器与用具】
分光光度计；分析天平（感量）；恒温箱1台；研钵1套；100ml三角瓶；漏斗；移液管10ml 1支、2ml 1支、1支；20ml刻度试管；10ml容量瓶；小培养皿；试管架，药匙；石英砂适量。
【试剂】
乙酸乙酯；
连二亚硫酸钠（Na2S2O4，为强还原剂，俗称保险粉）；
1%TTC溶液：准确称取TTC ，溶于少量蒸馏水中，定容至100ml；
%TTC溶液：准确称取TTC ，溶于少量蒸馏水中，定容至100ml；
磷酸缓冲液（1/15mol/L，）；
1mol/L硫酸：用量筒量取比重的浓硫酸55ml，边搅拌边加入盛有500ml蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至1000ml；
L琥珀酸钠：称取琥珀酸钠（含6个结晶水），溶于蒸馏水中，定容至100ml。
【方法】
1．定性测定
（1）配置反应液把1%TTC溶液，L琥珀酸钠和磷酸缓冲液按1︰5︰4比例混合。
（2）把根仔细洗净，把地上部分从茎基切除，将根放入三角瓶中，倒入反应液，以浸没根为度，置37℃左右暗处放1h，以观察着色情况，新根尖端几毫米以及细侧根都明显地变成红色，表明该处有脱氢酶存在。
2．定量测定
（1）TTC标准曲线的制作吸取%TTC溶液放入10ml容量瓶，加少许Na2S2O4粉末，摇匀后立即产生红色的TTF。再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。然后分别取此液、、、、置10ml 容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含TTF25μg、50μg、100μg、150μg、200μg 的标准比色系列，以空白作参比，在485nm波长下测定光密度，绘制标准曲线。
（2）称取根样品，放入小培养皿（空白试验先加硫酸再加入根样品，其他操作相同），加入%TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10ml，把根充分浸没在溶液内，在37℃下暗处保温1h，此后加入1mol/L硫酸2ml，以停止反应。
（3）把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯3～4ml和少量石英砂一起磨碎，以提出TTF。把红色提出液移入试管，用少量乙酸乙酯把残渣洗涤二至三次，皆移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为10ml，用分光光度计在485nm下比色，以空白作参比读出光密度，查标准曲线，求出四氮唑还原量。
（4）计算将所得数据带入下式，求出四氮唑还强度。
四氮唑还原强度=
)h(
)g(
)g
(
时间根重
四氮唑还原量
⨯
μ
【思考题】
