实验三 乙型肝炎病毒表面抗原检测

用两种方法检测乙肝表面抗原结果分析

目的 了解用ELISA法检测乙肝表面抗原和用化学发光法检测表面抗原两者之间的结果情况。方法 采集320例就诊人员的血液标本，分别用化学发光法与ELISA法检测。结果 320份标本中，发光法检测出40份阳性，280份阴性。ELISA法检测出42份阳性，278份阴性。经χ2检验两者无显著性差异（P>0.05）。结论

ELISA法成本比较低，耗时长，实验的影响因素比较多，易出现假阳性。化学发光法成本高，所需时间短，干扰因素少，不易出现假阳性。

标签：乙肝表面抗原；ELISA；化学发光

流行病学调查结果显示，我国的乙型病毒肝炎感染性约达10%，乙肝的实验检测对其防治具有非常重大的意义[1]。乙型肝炎病毒乙肝表面抗原（HBsAg）是乙肝病毒的外壳蛋白，它可存在于患者的血液、唾液、乳汁、汗液、泪水、鼻咽分泌物、精液及阴道分泌物中。随着科学越来越进步，检测的手段也越来越多。自20世纪70年代至今，诸多高敏感性的检测方法被广泛应用于临床免疫学的检测中，当中应用最为广泛的就属酶联免疫法（enzyme linked Immunosor bent assay，ELISA）[2]。近几年，化学发光微粒子免疫分析法（chemiluminescent microparticle

immunoassay，CMIA）正逐渐发展，是一种敏感性较强的临床免疫学检测方法，有效解决了低浓度乙型肝炎病毒乙肝表面抗原的检测难题[3]。现用ELISA法，化学发光法，这两种方法检测的相关性进行探讨。

1 资料与方法

1.1一般资料 标本来自于我院2016年3月1日～3月5日体检人员，共320例，男198例，女122例，年龄18～72岁，平均年龄为（39.5±8.4）岁。

1.2标本采集 用红头采血管，真空抽取静脉血3 ml，标本静置后离心提取血清。

1.3检测试剂与仪器 一种采用雅培化学发光HBsAg定量检测试剂盒，标本离心后，按照雅培I2000化学发光仪的操作规程检测。试剂源自美国雅培公司，批准文号为70318HN00，仪器为美国雅培公司生产的i2000r化学光分析仪。另一种采用英科新创HBsAg酶联免疫吸附试剂盒，安图酶标仪，按照说明书的操作步骤进行。试剂由英科新创（厦门）科技有限公司提供，批准文号为2008095514，主要仪器为酶标仪（型号：伯乐680）、恒温水浴箱（生产企业：上海博讯公司医疗器械厂）。

1.1乙肝表面抗原检测操作规程

-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN 乙型肝炎病毒表面抗原检测（ELISA）

1原理：

在微孔板上预包被被纯化的乙肝表面抗体（HBsAb），配以酶标记抗体（HbsAb-HRP）及TMB等其它试剂，采用夹心法原理检测人血清（或血浆）中乙肝表面抗原（HBsAg）。

2试剂：

试剂名称：乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒（酶联免疫法）

试剂生产厂家：英科新创（厦门）科技有限公司

包装规格：96Test/Kit

试剂盒组成：HbsAb预包被微孔板（包被HbsAb），HbsAg酶标抗体（含HRP标记HbsAb）, HbsAg阳性对照（含基因工程HbsAg），HbsAg阴性对照（正常人血清），HbsAg样品稀释液（含BSA缓冲液），浓缩洗涤液（PBS-T缓冲液），底物A（含H2O2），底物B（含TMB），终止液（含H2SO4），封板膜，自封袋，说明书。

试剂储存条件及有效期：2~8℃避光保存，有效12个月。

3样本采集：

取静脉血3-4ml于干净容器中分离出血清或血浆标本，如不及时测定可置于4℃冰箱保存，如长期保存需置于-15至-20℃冻存，并避免样本反复冻融。高脂血、高胆红素及溶血样本可能会影响试验结果的准确性，建议不使用。

4所需仪器 全自动酶免分析仪

新鲜蒸馏水或去离子水

酶标仪（单波长450nm或双波长450nm/630nm）

微量移液器

37℃恒温箱或水浴箱

洗板机或洗瓶

5检验方法

平衡：将试剂盒各组分从盒中取出，平衡至室温（18~25℃），微孔板板开封后，余者即时以自封袋封存。

配液：浓缩洗涤液配置前充分摇匀（如有晶体应充分溶解），浓缩洗涤液和蒸馏水去离子水按1：19稀释后使用。

编号：取所需数量微孔条固定于支架，按序编号。

稀释：每孔加入20ul样品稀释液。

加样：分别在相应孔中加入100ul阴、阳性对照血清或待测样本。

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乙型肝炎病毒表面抗体检测

一、标本收集及处理： 人血清或血桨类标本。

二、测定原理：采用纯化HBsAg包被反应板，加入待测标本，同时加入HBsAg-HRP，当标本中存在抗-HBs时，该抗-HBs与包被HBsAg结合并与酶结合物形成HBsAg-抗-HBs-HBsAg-HRP复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之则无显色反应。

三、试剂来源： 上海荣盛生物药业有限公司

四、试验器材：

（一）、试验试剂：

1． 预包被反应条 1袋

2． 酶结合物 1瓶

3． HBsAb阳性对照 1瓶

4． HBsAb阴性对照 1瓶

5． 浓缩洗涤液 1瓶

6． 显色剂A（TMB） 1瓶 7． 显色剂B（TMB） 1瓶

8． 终止液 1瓶

9． 封口胶纸 1片

10．说明书 1份

11．自封袋 1只

（二）、试验仪器：

1．洗板仪：

2．酶标仪：

五、试剂制备：

1、洗涤液使用前按要求用蒸馏水作1：20稀释。

2、其他试剂按说明可直接使用。

六、操作程序：

1.加待测标本：加入待测标本每孔50微升，并设HBsAb阳性对照2孔，HBsAb阴性对照2孔，空白对照1孔。

2.加酶结合物：每孔50微升，空白对照孔不加，充分混匀，封板，置37℃孵育30分钟。

3.洗 板：1）手工洗板：弃去反应板条孔内液体，拍干；用洗涤液注满每孔，静置5-10秒，弃去孔内洗涤液拍干，如此反复5次，拍干。

2）洗板机洗板：选择洗涤5次的程序洗板，最后拍干。

4.加显色剂：先加显色剂A，每孔50微升； 再加显色剂B，每孔50微升；充分混匀，封板，放置37℃避光孵育15分钟。

乙型肝炎病毒表面抗原定量测定作业指导书

一、目的：规范乙型肝炎病毒表面抗原测定的标准操作程序，确保乙型肝炎病毒表面

抗原测定的结果准确有效。

二、适用范围：在AutoLumo A2000化学发光检测仪上定量测定人血清中的乙型肝炎病毒

表面抗原。

三、临床意义

乙型病毒性肝炎是一种重要的公众危害性疾病，据估计全球范围内目前

大约有3 亿乙肝病毒携带者。感染乙型病毒性肝炎可引起广泛的急、慢性肝

脏疾病，流行病学研究已经清楚地表明乙肝病毒与肝细胞癌的发生有联系。

HBsAg是乙肝病毒颗粒（HBV）的外壳成分，为大小不一的多肽。感染乙

型肝炎病毒后，机体会产生各种不同模式的抗原、抗体血清学免疫应答反应。

通过检测这些标志物，不仅可以诊断感染，而且还可以判断疾病的进程和预

后。HBsAg是HBV感染后第一个标志物，是提示样本是否有潜在传染性的最 好的间接指标。

四、方法原理

本产品采用双抗体夹心法原理进行检测。用抗-HBs抗体包被磁微粒，用

辣根过氧化物酶标记的抗-HBs抗体制备酶结合物。通过免疫反应形成抗体-

抗原-抗体-酶复合物，该复合物催化发光底物发出光子，发光强度与HBsAg

含量成正比。

五、标本的采集与处理

5.1. 采用正确医用技术收集血清/血浆样本，推荐对于使用普通管采血的样

本，离心前样本应37℃孵育至少1h；对于使用促凝管采血的样本，离

心前样本应37℃孵育至少0.5h，离心条件10000g/min，10min；对于使

用抗凝管采血的样本，离心条件10000g/min，10min。抗凝管推荐使用

肝素作为抗凝剂，避免使用枸橼酸钠和EDTA抗凝剂。

5.2. 样本中的沉淀物和悬浮物可能会影响试验结果，应离心除去，并确定样 本未变质方可使用。