肝细胞生长因子对大鼠局灶性脑缺血／再灌注损伤的保护作用
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傲髓琢字杂志，２０１０，２０（３）：１１—１３ ◎２０１０ ＣＨＩＮＥＳＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＭＩＣＲＯＣＩＲＣＵＬＡＴ１ＯＮ
肝细胞生长因子对大鼠局灶性脑缺血／再灌注 损伤的保护作用＊ 贺 芳 董关蓉 孙小娅 林乃祥 童永清 ［中图分类号］Ｒ７４３ ［文献标识码］ Ａ ［文章编号］ １００５—１７４０（２０１０）０３—００１１一ｏ３ 固
１材料与方法 １．１ 实验动物及分组 雄性Ｓｐｒａｇｕｅ—Ｄａｗｌｅｙ大鼠５４只，体重２８０ｇ￣ ３２０ｇ。随机分为３组，即假手术组（Ｓｈａｍ组），脑缺 血／再灌注组（Ｉ／Ｒ组），ＨＧＦ处理组（ＨＧＦ ４－Ｉ／Ｒ 组），每组１８只。再灌注２４ｈ后，各组中任取９只大 鼠进行神经功能评分和脑梗死灶体积测定；余９只 大鼠检测脑组织超氧化物歧化酶（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｄｉｓ— ｍｕｔａｓｅ，ＳＯＤ）活性、丙二醛（Ｍａｌｅｉｃ Ｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ， ＭＤＡ）含量。 １．２局灶性脑Ｉ／Ｒ损伤模型 参照Ｌｏｎｇａ等 改良线栓法制备大鼠右侧大 脑中动脉闭塞（Ｍｉｄｄｌｅ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ａｒｔｅｒｙ Ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ， ＭＣＡＯ）模型：大鼠称重，腹腔注射１Ｏ 水合氯醛 （３００ ｍｇ／ｋｇ）麻醉，仰卧固定。行颈部正中切口， ＊［基金项目］ 江苏省卫生厅医学科研项目（ＮＯ：Ｈ２００９６６） ［作者单位］１江苏省苏州卫生职业技术学院，邮政编码 苏州 ２１５００９；。武汉大学人民医院 本文２０１０—０４～２５收到，２０１０—０６—０１修回，２Ｏ１Ｏ—Ｏ６—０８接受 微循环学杂志 ２０１ ｏ年第２Ｏ卷第３期 暴露右颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。将３－０尼 龙线从颈外动脉切口处插入，缓慢向颈内动脉入颅 方向推进，栓塞大脑中动脉，造成局灶性脑缺血。缺 血后１＿５ｈ，拔出尼龙线再灌注２４ｈ，成功建立Ｉ／Ｒ 损伤模型。Ｓｈａｍ组大鼠除不阻塞大脑中动脉外， 其余同Ｉ／Ｒ组。 １．３药物处理 取Ｉ／Ｒ模型大鼠，将人重组ＨＧＦ’（Ｒｇ．Ｄ ｓｙｓ— ｔｅｒｎｓ，美国）溶于人工脑 液（ｉｉ＇ｌｆ１．Ｏ。 ／Ｉ ：Ｎｉ Ｃ１ ０， ＫＣｌ ２．９９，ＣａＣｌ２ ０．９８，ＭｇＣ１ ・６Ｈ Ｏ ０．８Ｏ，Ｎａｔｔ— ＣＯ３ ２５、Ｎａ２ ＨＰｏ４・１２Ｈ２ Ｏ ０．０３９，ＮａＨ？ＰＯ４・ ２Ｈ。Ｏ ０．４６）［６］中，行侧脑室注射（３Ｏ ｇ／ｋｇ），即为 ＨＧＦ十Ｉ／Ｒ组。Ｓｈａｍ组和Ｉ／Ｒ组侧脑室注射等量 人工脑脊液。 １．４神经功能评分标准 ＭＣＡＯ １．５ｈ／再灌注２４ｈ后，参照Ｉ ｏｎｇａ评分 法 对各组大鼠进行神经功能分级评分。０分：无 神经功能缺陷；１分：缺血脑区列‘侧 肢不能完全伸 展，轻度神经功能缺陷；２分：向缺 脑区对侧转圈， 中度神经功能缺陷；３分：向缺血脑区对侧倾倒，重 度神经功能缺陷；４分：不能自行行走，并伴有意识 障碍。 １．５脑梗死灶体积测定 ＭＣＡＯ １．５ｈ／再灌注２４ｈ后处 大鼠．迅速取 脑，做冠状切片５张（厚约３ ｒａｍ／张），于２ ＴＴＣ溶 液中３７℃避光孵育３０ ｍｉｎ。梗死脑组织呈苍白色， 正常脑组织呈红色。１０％福尔马林溶液固定，图像分 析软件计算每张脑组织切片梗死面积。总的脑梗死 灶体积一５张脑组织切片面积之和×总切片厚度。 １．６脑组织匀浆ＳＯＤ活性和ＭＤＡ含量测定 分组和处理方法同前。ＭＣＡＯ １．５ｈ／再灌注 ２４ｈ后处死大鼠，迅速取脑，加入４℃生理盐水，用 玻璃匀浆器制成１Ｏ 脑组织匀浆，４＾Ｃ离心ｌＯ ｒａｉｎ
基础与实验 １２ 贺芳，董美蓉，孙小娅，等 （４０００ｒ／ｍｉｎ），取上清，分别用ＳＯＤ试剂盒、ＭＤＡ 试剂盒（南京建成生物工程研究所提供）测定大脑组 织中ＳＯＤ活性和ＭＤＡ含量。 １．７统计学处理 采用ＳＰＳＳ统计软件。实验数据以均数±标准 差（ ±ｓ）表示，组间比较采用方差分析，以Ｐ＜Ｏ．０５ 为有显著性统计学意义。 ２ 结 果 ２．１ ＨＧＦ对脑Ｉ／Ｒ大鼠神经功能评分的影响 ＭＣＡ０ １．５ｈ／再灌注２４ｈ后，Ｉ／Ｒ组大鼠出现 不同程度的神经功能障碍，如提尾时缺血脑区对侧 前肢屈曲，不能完全伸展，行走时向缺血脑区对侧转 圈或倾倒等。ＨＧＦ＋Ｉ／Ｒ组神经功能障碍明显改 善。见表１。 ２．２ ＨＧＦ对脑Ｉ／Ｒ大鼠脑梗死灶体积的影响 Ｓｈａｍ组未见明显梗死灶，脑组织呈红色；Ｉ／Ｒ 组大鼠缺血侧脑组织出现较大区域的苍白梗死灶； ＨＧＦ＋Ｉ／Ｒ组缺血侧脑组织也可见苍白梗死灶，但 体积明显小于Ｉ／Ｒ组（Ｐ＜Ｏ．０５）。见表１。 袭１各组神经功能评分及脑梗死灶体积（ ±５，ｎ＝９）
注：与Ｉ／Ｒ组比较，”Ｐ＜０．０５ ２．３ ＨＧＦ对脑Ｉ／Ｒ大鼠脑组织ＳＯＤ活性、ＭＤＡ 含量的影响 脑缺血１．５ｈ／再灌注２４ｈ后，Ｉ／Ｒ组大鼠脑组 织ＳＯＤ活性明显降低、ＭＤＡ含量显著增加（与 Ｓｈａｍ组比较，Ｐ（Ｏ．Ｏ１）。ＨＧＦ处理能明显升高脑 Ｉ／Ｒ大鼠脑组织ＳＯＤ活性（与Ｉ／Ｒ组比较，Ｐ＜ｏ． ０５），减少ＭＤＡ含量（与Ｉ／Ｒ组比较，Ｐ＜０．０１）。 见表２。 表２ 各组ＳｏＤ活性及ＭＤＡ含量（ 士 ，”＝９）
注：与Ｓｈａｍ组比较，”Ｐ（Ｏ．Ｏ１；与Ｉ／Ｒ组比较， Ｐ＜Ｏ．０５， Ｐ％Ｏ．Ｏ１
蠢曩讲学杂志 ２０１０年第肋卷第３期 ３讨论 ＨＧＦ在脑的发育和成熟过程中起着重要作用， 发挥着神经营养因子的生物学活性［７］。ＨＧＦ受体 ｃ—Ｍｅｔ为原癌基因的编码产物，是一种酪氨酸激酶 型受体。ＨＧＦ和ｃ—Ｍｅｔ受体在脑的不同区域均有 表达，如海马、大脑皮层和小脑等。离体实验的研究 表明，ＨＧＦ对神经元缺氧／复氧损伤具有直接的保 护作用 。州。 本实验通过制备大鼠ＭＣＡＯ模型，观察了外 源性ＨＧＦ对局灶性脑Ｉ／Ｒ损伤大鼠神经功能评 分、脑梗死灶体积、ＳＯＤ活性以及ＭＤＡ含量的影 响。结果显示，大鼠ＭＣＡＯ １．５ｈ，再灌注２４ｈ后 出现不同程度的神经功能障碍，缺血侧脑组织可见 较大区域的梗死灶。用ＨＧＦ处理能明显改善大鼠 脑Ｉ／Ｒ后的神经功能障碍，减小梗死灶体积。提示 ＨＧＦ对大鼠局灶性脑Ｉ／Ｒ损伤具有保护作用。 氧自由基是脑Ｉ／Ｒ损伤的重要原因之一。在 正常生理情况下，体内自由基的产生与内源性自由 基清除系统之间维持着动态平衡。ＳＯＤ是脑组织 内源性自由基清除系统中的关键酶之一，在机体的 氧化与抗氧化平衡中起重要作用。测定ＳＯＤ活性 可反映脑组织清除氧自由基的能力。脑Ｉ／Ｒ时，大 量氧自由基的产生，远超出脑组织的清除能力，致使 ＳＯＤ等抗氧化酶大量消耗、活性减低。由于氧自由 基不能及时清除，导致其大量积聚，引起蛋白质、脂 质、核酸等的过氧化，从而造成细胞络构的严重损 伤 ］。ＭＤＡ是氧自由基与生物膜中不饱和脂肪 酸发生脂质过氧化反应形成的脂质过氧化物，它的 产生与脂质过氧化相平行，测定ＭＤＡ含量可反映 脑组织中脂质过氧化程度和氧自由基含量的变化。 本实验结果表明，大鼠ＭＣＡＯ １．５ｈ，再灌注２４ｈ 后，ｓ０Ｄ活性明显降低，ＭＤＡ含量显著增高，而 ＨＧＦ处理能明显升高脑Ｉ／Ｒ大鼠脑组织ＳＯＤ活 性，降低ＭＤＡ含量。提示ＨＧＦ减轻局灶性脑Ｉ／Ｒ 损伤可能与增强自由基清除能力，抑制脂质过氧化 反应有关。 ● 本文第一作者简介： 贺芳（１９８０～），女，汉族，医学博士．主要从事神经保护的研究
置础与实验 肝细胞生长因子对大鼠局灶性脑缺血／再灌注损伤的保护作用 参考文 献 １ Ｌｉ Ｚ．Ｍｉｚｕｎｏ Ｓ，Ｎａｋａｍｕｒａ Ｔ．Ａｎｔｉｎｅｃｒｏｔｉｃ ａｎｄ ａｎｔｉａｐｏｐｔｏｔｌｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｏｎ ｃｈｏｌｅｓｔａｔｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｂｉｌｅ—ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇａｓｔｒｏｉ— ｎｔｅｓｔ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００７，２９２（２）：Ｇ６３９～６４６． ２ Ｇｏｎｇ Ｒ，Ｒｉｆａｉ Ａ，Ｄｗｏｒｋｉｎ ＬＤ．Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｓｕｐ— ｐｒｅｓｓｅｓ ａｃｕｔｅ ｒｅｎａｌ ｉｎｆｌａｍｍｏｌ／Ｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｅ—ｓｅｌｅｃｔｉｎ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ，２００６，６９（７）：１ ｌ６６～１ １７４． ３ Ａｚｕｍａ Ｊ，Ｔａｎｉｙａｍａ Ｙ，Ｔａｋｅｙａ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ａｎｄ ａｎｔｉｆｉ ｂｒｏｔｉｃ ａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅ ｃａｒｄｉａｃ ｄｙｓ— ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｐｏｒｃｉｎｅ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２００６， １３（１６）：１ ２Ｏ６～１ ２１３． ４ Ｇａｚｄｈａｒ Ａ．Ｆａｃｈｉｎｇｅｒ Ｐ．ｖａｎ Ｉ ｅｅｒ Ｃ．ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｒｅｄｕｃｅｓ ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ— ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｕｎｇ ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ， ２００７，２９２（２）：Ｌ５２９～５３６． ５ Ｌｏｎｇａ ＥＺ，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ ＰＲ，Ｃａｒｌｓｏｎ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｍｉｄｄｌｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ｗｉｔｈｏｕｔ ｃｒａｎｉｅｃｔｏｍｙ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｓｔｒｏｋｅ， １９８９，２Ｏ（１）：８４～９１． ６ Ｉ ｕ Ｊ，Ｚｈａｎｇ Ｙ，Ｓｈｉ Ｊ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ一（１－７）ｏｎ ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｋｉｎｉｎ ｒｅ— ｃｅｐｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｆｏｃａｌ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｅｈｅｍｉａ—ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎ １３
ｒａｔｓ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ，２００８，１２１９：１２７～１３５． ７ Ｈｏｎｄａ Ｓ，Ｋａｇｏｓｈｉｍａ Ｍ，Ｗａｎａｋａ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ＨＧＦ ａｎｄ ｃ—Ｍｅｔ／ＨＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ｒａｔ ｂｒａｉｎ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｓ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｍｏｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ，１９９５，３２（２）：１９７～２１０． ８ Ｈｅ Ｆ，Ｗｕ ＬＸ．Ｓｈｕ ＫＸ，ｅｔ ａ１．ＨＧＦ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｇａｉｎｓｔ ｈｙｐｏｘｉａ／ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉ０ｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｉｎｊｕｒｙ ｖｉａ ＥＲＫ１／２ ａｎｄ ＰＩ一３Ｋ／Ａｋｔ ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｃｏｌｌｏｉｄｓ ａｎｄ Ｓｕｒｆａｃｅｓ Ｂ： Ｂｉ０ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，２００８，６１（２）：２９０～２９７． ９贺芳，邬力祥，刘发益，等．肝细胞生长因子对氧糖剥夺／再灌 注神经元的保护作用．生理学报，２００８，６０（２）：２３５～２４２． １０ Ｂａｋｅｒ ＣＪ，Ｌｏｎｇｏｒｉａ Ｊ，Ｇａｄｅ ＰＶ，ｅｔ ａ１．Ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｗａｔｅｒ—ｓｏｌｕ— ｂｌｅ ａｌｐｈａ—ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ ａｎａｌｏｇｕｅ ｔｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ｓｏｌｕ—。 ｔｉｏｎ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｌｕｎｇ ｒｅｐｅｒｆｕ— ｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ．Ｓｕｒｇ Ｒｅｓ，１９９９，８６（１）：１４５～１４９． １ ｌ Ｓｔｒｕｂｅｒ Ｍ．Ｗｉｌｈｅｌｍｉ Ｍ，Ｈａｒｒｉｎｇｅｒ Ｗ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｈａｌｅｄ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ａｓ ａ ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｇａｉｎｓｔ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｌｕｎｇ．Ｔｈｏｒａｃ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｓｕｒｇ，１９９９，４７（３）：１７９～１８２． １ ２ Ｉｓｓｅｌｈａｒｄ Ｗ，Ｍｉｎｏｒ Ｔ．Ｇａｓｅｏｕｓ ｏｘｙｇｅｎ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎ— ｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ｏｆ ｏｒｇａｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｉｓｃｈｅｍｉａ．Ｚｅｎｔｒａｌｂｌ Ｃｈｉｒ・１９９９，１２４ （４）：２５２～２５９．
