简述基因工程中常用的表达系统及其优缺点

1.生物技术概念与特征定义：利用活体生物或它们的产物来生产或修饰一种产品以改良植物和动物、或发展具有特殊用途的微生物的技术。

2.基因工程的概念利用DNA体外重组或PCR扩增技术从某种生物基因组中分离感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然后经过一系列切割，加工修饰，连接反应形成重组DNA分子，再将其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的过程3.PCR反应体系基本原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成4.PCR反应参数：高温变性(94)，低温退火（60），适温延伸（72）5.PCR反应体系：（1）模板DNA（2）特异性引物dNTP（3）耐热的DNA聚合酶（Taq酶）（4）缓冲溶液6.PCR反应原则：引物原则：（1）引物扩增跨度（2）引物解链温度（3）避免引物内部或引物之间存在互补序列（4）G+C含量：尽量控制在40%至60%之间（5）引物的3‘末端特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对（6）引物中有或能加上合适的酶切位点7.分子杂交：指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理，形成异质双链的过程。

用途：（1）研究DNA之间的亲缘关系（2）发现基因的缺失或突变；（3）测定某种遗传信息的量（4）鉴定某种基因（5）基因治疗8.常用分子杂交类型：（1）DNA印迹技术Southern blotting（2）RNA印渍技术Northern blotting（3）蛋白质印渍技术Western blotting（4）斑点印迹Dot blotting（5）原位杂交in situ hybridization9.DEPC(二乙基焦碳酸盐)(C2H5OCOOCOOC2H5)10.Sanger双脱氧链终止法原理：（1）Sanger双脱氧链终止法的最大特点是引入了双脱氧核苷三磷酸（2ˊ,3ˊ-ddNTP）作为链终止剂，2ˊ,3ˊ-ddNTP与普通的dNTP不同之处在于前者的脱氧核糖的3ˊ位又少了个羟基。

2．质粒DNA和病毒（噬菌体）DNA作为载体的主要特征是什么为外源基因提供进入受体细胞的转移能力；为外源基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力；为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力；具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点，具有合适的选择标记3．如何理解质粒的不相容性及其在DNA重组克隆过程中的运用意义质粒的不相容性：具有相同或相似复制子结构及调控模式的两种不同的质粒不能稳定存在于同一受体细胞内.4．列举表达质粒、穿梭质粒、探针质粒和cos质粒的不同用途表达质粒:在多克隆位点的上下游分别装有两套转录效率较高的启动子、合适的核糖体结合位点序列（SD）序列以及强有力的终止子结构，使得克隆在合适位点上的任何外源基因均能在受体细胞中高效表达。

穿梭质粒：质粒分子上含有两个亲缘关系不同的复制子以及相应的选择性标记，能在两种不同的受体细胞中复制并检测。

探针质粒：用来筛选克隆基因的表达调控元件。

通常含有报告基因，但缺少相应的调控序列（如启动子或终止子），只有含有启动子或终止子的调控序列被克隆进入载体后，报告基因才能别表达，表达量的大小直接反应了克隆进入的调控元件的强弱。

cos质粒：人工构建的含有λDNA的cos位点序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。

具有大的装载量，可以用于构建基因组文库。

5． II类限制性核酸内切酶的主要酶学特征是什么分子量较小的单体蛋白，双链识别和切割活性仅需Mg2+，识别位点为4-6个bp的回文序列，切割位点在识别序列中或靠近识别序列7． KLenow酶与大肠杆菌DNA聚合酶I在结构和功能上的主要区别DNA聚合酶I包括大片段(klenow片段)和小片段功能上：DNA聚合酶I比klenow酶多了5’→3’核酸外切酶活性，两者都具有5’→3’DNA聚合酶活性和3’→5’核酸外切酶活性。

8．影响限制性核酸内切酶活性的主要因素有哪些？温度、盐度等物理因素，DNA样品纯度，DNA甲基化程度，限制性核酸内切酶的缓冲液性质，甘油和微量的金属离子会抑制限制性内切酶的活性9.如何理解粘性末端比平头末端更容易连接在退火条件下，粘性末端的连接为分子内反应，平头末端是分子间反应，平头末端的连接反应更加复杂，速度也慢。

原核表达系统的工作原理原核表达系统是指利用原核生物（如大肠杆菌等）来表达外源蛋白质的工具，在生物技术和基因工程领域应用十分广泛。

原核表达系统通过重组DNA技术将目标基因插入原核细胞的表达载体中，并利用细胞自身的代谢机制，将目标蛋白质大量表达出来。

本文将详细介绍原核表达系统的工作原理。

1. 原核表达系统的基本构成原核表达系统的基本构成包括表达载体和宿主细胞两部分。

表达载体是一种重组DNA分子，通常包括以下基本组成成分：（1）起始位点（起始密码子）：在大肠杆菌中通常为AUG。

（2）表达基因：包括编码目标蛋白质的DNA序列和转录启动子、转录终止子等序列。

（3）选择标记：旨在筛选出带有目标基因的细胞，并提高表达效率。

常用的选择标记有抗生素抵抗基因和荧光标记基因等。

（4）复制起点：能够使表达载体在宿主细胞内进行自我复制，提高表达效率。

宿主细胞则是一种能够实现表达载体遗传信号转录、翻译和合成目标蛋白质的生命体。

2. 原核表达系统的工作流程原核表达系统通过以下几个步骤来实现目标蛋白质的表达：（1）制备表达载体将目标基因插入表达载体中，构建成重组DNA分子。

（2）转化宿主细胞将制备好的表达载体转化（transform）到宿主细胞内。

转化过程中，表达载体通过电击、热激或溶菌酶处理等方法，被宿主细胞吞噬并与其细胞质融合。

（3）表达基因转录和翻译转录因子识别插入表达载体的启动子序列，调节基因在宿主细胞内能够合成被表达的mRNA。

转录后的mRNA与核糖体结合，开始翻译，合成蛋白质。

（4）目标蛋白质的后处理和纯化将宿主细胞内表达的蛋白质从培养基或细胞酶中提取出来。

通常采用离心、过滤或柱层析等方法，对蛋白质进行分离和纯化。

3. 原核表达系统的优缺点原核表达系统在生物技术和基因工程领域应用广泛，主要因为其有以下的优缺点。

（1）优点①高效：能够表达大量的目标蛋白质，通常能够达到10%以上的蛋白质总产量。

②简便：操作简便，不需要昂贵的设备，很容易进行规模化操作。

质粒DNA的形态:超螺旋，开环，线状质粒的不亲和性:（1）质粒具有不相容性,即在没有选择压力的条件下,两种不同的质粒不能稳定地共存于同一细胞.（2）宿主细胞内.相互不相容的质粒属于同一个不相容群;而属于不同的不相容群的质粒可稳定地共存于同一宿主细胞中。

原因:竞争相同的转录,复制因子.质粒载体（改造）的基本要求1.复制原点－－能自主复制,宿主专一性；2.选择标记－－便于筛选，；3.多克隆位点－－插入外源基因，不影响本身的复制；质粒功能分类1、克隆载体（PUC)2、表达载体（pET, pGEX, pTXB1等）区别：克隆载体有较强复制能力，有利于基因保存和扩增，提供丰富酶切位点。

有较强复制元件，不具备表达元件，被克隆的基因不一定会表达但一定会大量复制。

表达载体是克隆结束后，为特定细胞内表达而构建。

有各种各样的启动子以适应不同种类的细胞，而且有各种各样的表达调控。

是否含有表达系统元件是区别克隆载体和表达载体的标志。

Ⅱ型核酸内切酶基本特征1、每一种酶都有各自特异的识别序列。

(1) 序列不同(2) 长度不同：4－7 bp(3) 但与DNA来源无关2、识别序列一般具有回文结构。

5’G↓AATTC3’3’CTTAA↑G5’3. 切割后, 产物的特点（1） 5’－pi, 3’—OH（2）平端粘端－－都是 5’突出或都是 3’突出(3）粘端可重新通过氢键配对4. 特殊性质Ⅱ型核酸内切酶的特殊性质1、同位酶：识别相同序列，但切割位点不一样的酶 ( 如SmaI和XmaI )2、同尾酶:识别位点不同，但切割出相同的末端序列（BamHI和BclI)；3、同裂酶：识别位点和切割位点都相同的酶（HpaI 和HincⅡ )；4、甲基化的调节：MspI (所有）和HpaⅡ (非甲基化）5、Star 活性（星号活性）：在非标准反应条件下,也能切割一些与其特异识别序列类似的序列。

在酶的名称右上角加一个星号(*)表示,•如EcoRⅠ*。

基因工程复习归纳第一章绪论1.基因工程的定义：是指按照人们的愿望，经过严密的设计，将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体/宿主）内，使之按照人们的意愿稳定遗传、并表达出新的性状的技术。

2.基因工程概念的发展：遗传工程→DNA重组技术→分子/基因克隆（Molecular/Gene→基因工程→基因操作。

应用领域以“基因工程”、“DNA重组”为主基因工程基因工程的历史性事件1973：Boyer和Cohen建立DNA重组技术1978：Genetech公司在大肠杆菌中表达出胰岛素1982：世界上第一个基因工程药物重组人胰岛素上市1988：PCR技术诞生1989：我国第一个基因工程药物rhIFNα1b上市2003: 世界上第一个基因治疗药物重组腺病毒-p53上市3.基因工程的三大关键元件基因（供体）：外源基因、目的基因载体：能将外源基因带入受体细胞，并能稳定遗传的DNA分子（克隆载体、表达载体）。

宿主（受体）：，能摄取外源DNA、并能使其稳定维持的细胞（组织、器官或个体）。

4.基因工程的基本步骤（切、接、转、增、检（大肠杆菌是中心角色）（1）目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。

（2）重组体的制备：将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。

（3）重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。

（4）克隆鉴定：挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。

（5）目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。

第二章 DNA重组克隆的单元操作一、用于核酸操作的工具酶1.限制性核酸内切酶(主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵)。

限制性核酸内切酶的功能与类型其中II型限制性核酸内切酶：切割位点专一，适于DNA重组，是DNA重组中最常用工具酶。

真核细胞表达系统自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。

并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。

随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现,其中多数基因功能不明。

利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段.在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统,这也是目前掌握最为成熟的表达系统。

该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA片段的载体（一般为质粒)转化细菌（通常选用的是大肠杆菌）,通过IPTG诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白.其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物,而且所需的成本相对比较低廉.但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点:如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难；而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。

为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域,其优点是:①根据原核生物蛋白与靶DＮＡ间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性,故不存在基因的非特异性激活或抑制；...文档交流仅供参考...②能诱导基因高效表达,可达105倍，为其他系统所不及；③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关"，还可人为地调控基因表达量。

因此，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。

目前,基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统....文档交流仅供参考...1、酵母表达系统最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母,后来人们又相继开发了裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。

制备生物技术药物的几种表达系统(一)细菌：优点是基因了解清楚；本身价格便宜且易于培养；培养基便宜；表达水平高；生长快及易于鉴别。

缺点是不能分泌蛋白质；含有内毒素；无转译后修饰；可能有非正规的蛋白质交迭。

产品有利用大肠杆菌表达的胰岛素，重组人生长激素，白介素-2、干扰素、淋巴生长因子、白介素及细胞活素。

(二)酵母：优点是使用安全；使用的期限较长；基因了解清楚；无内毒素；高表达水平；分泌出蛋白质且易收获；生长快；培养基便宜；蛋白质一般正规交迭；转译后修饰。

缺点是产糖量过多因而损坏蛋白质的生物活性、安全性、活性及活力等；可能含有免疫物质或抗原。

产品有重组蛋白质、疫苗如乙肝疫苗、胰岛素、较大的重组蛋白如链激酶、人血清蛋白、组织坏死因子及干扰素。

(三)昆虫细胞：优点是具有转移后修饰；正规的交迭蛋白质；能分泌出产物；较好的表达率；棒状病毒对人无损害。

缺点是使用期限较短；生长慢；培养基昂贵；含有免疫宿主蛋白；有些非正规的糖化反应；哺乳类病毒可以感染此类细胞。

产品有疫苗、治疗药物、临床检验试剂以及做病毒治疗药物释放系统。

(四)哺乳动物细胞：优点是一般交迭蛋白质正规；正规的转移后修饰；能分泌蛋白质；良好的正规使用纪录；对大的、复杂的蛋白质的生产是唯一的选择。

缺点是培养基昂贵、生长缓慢；含有过敏物质；需要深入的鉴别；精制手续复杂；产品昂贵。

或品有组织血纤维溶酶原活化剂(TPA)，因子Ⅷ及单克隆抗体的生产。

(五)转基因动物：优点是可表达复杂、巨大的蛋白质；高表达水平；蛋白质交迭正规；后转移修饰正规；易于放大；费用低廉。

缺点是正规使用的经验很少；是否易于被病毒感染尚为未知数；表达水平不稳定；周转期限长；精制方法尚需研究；生产周期不能确定；有关农场的eGMP生长尚存在问题。

产品有利用羊及兔子生产α-1抗胰蛋白酶，胆盐刺激生产的脂肪酶，超氧化物岐化酶、胶原、因子Ⅷ及Ⅸ及一些小肽。

(六)转基因植物：优点是开发周期较动物短；种子易于保存；易于放大；表达量高；基因结构清楚；无植物病毒影响人类；生产费用低。

几种表达系统的比较生物技术通报・综述与专论・BIOTECHNOLOGY BULLETIN2002年第2期几种表达系统的比较吴丹仇华吉童光志(中国农科院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,哈尔滨150001) 摘要: 随着蛋白质工程和DNA重组技术的发展,许多有应用潜力的蛋白分子有待开发。

不同蛋白在不同系统中表达水平有显著差异,所以选择一种合适的表达系统对蛋白表达水平非常关键。

对细菌、酵母、昆虫杆状病毒、哺乳动物细胞4种表达体系作一概述,并讨论各自优缺点及常见问题。

关键词: 表达系统大肠杆菌酵母昆虫细胞哺乳动物细胞ComparisonofSeveralExpressionSystemsWuDan QiuHuaji TongGuangzhi(NationalKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnologynVeteriResearchInstitute ChineseAcademyofAgricultSciencesAbstract: Withthedevelopmentofrecombinant,manytypesofproteinthathavepotential valuesneedtobeproduced.expressonlevelsamongdifferentproteinex2pressio nsystems.Soit’scriticaltosystemforproteinproduction.Thisreviewwillsum2m arizetheadvantagesand,insectandmammalianexpressionsystems,andalsodis cussthesolutionstoKeywords Ecoli Yeast Insectcells Mammaliancells 随着生物化学和分子生物学技术的发展,使人们得以更深入地了解蛋白质分子的一级和二级结构,这样就可以有目的的进行改造,创建新的有价值的蛋白质分子。

一名词解释：1基因(jīyīn)：是遗传信息的基本单位，携带着某种蛋白质或RNA的遗传信息。

从化学(huàxué)本质上看，基因是一段携带特定遗传信息的脱氧核糖核苷酸(DNA)序列，是构成巨大遗传单位染色体的组成部分。

2基因工程(jīyīn gōngchéng)：按照人们的愿望，进行严密的设计，利用体外DNA重组和转基因等生物技术，有目的地改造生物性状使之具有满足人们特定需求的能力。

最突出的优点：打破了常规(chángguī)育种难以突破的物种之间的界限，使不同的物种之间可以进行遗传信息的重组和转移。

3 Tm：熔点温度(wēndù)或者解链温度，是DNA变性进行到一半时的温度4同裂酶：有时，一些限制性内切酶虽然来源不同，但是识别序列相同，这样的酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）。

此种酶切割位点可同可不同。

5 PCR技术：是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，即聚合酶链式反应技术。

（已知的短片段1kb以内）6质粒不相容性：不同质粒有的可共存于同一细胞中，但有的不行。

不能同寓于一个细胞中的不同质粒称为不相容性质粒。

7转录单元：始于启动子，止于终止子，中间是一段转录区，转录为单链RNA 的一段序列8杂种位点：hybrid site：由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。

一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。

9基因表达：基因通过DNA的转录和RNA的转译等过程，将其所携带的遗传信息转变成蛋白质(或RNA转录本)的过程。

10基因组文库：某一特定生物的很多克隆的集合，其中克隆数足够大以覆盖每一个基因。

11 ORF：开放阅读框，以起始密码子开始终止密码子结束的一串三联体核苷酸序列。

起始密码子：ATG终止密码子：TAA TAC TGA12克隆：动词：是指从一个共同祖先经无性繁殖得到的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊生命群体；名词：指从同一个祖先产生这类同一的DNA分子群体、细胞群体或个体群体的过程。

简述基因工程中常用的表达系统及其优缺点
基因工程中常用的表达系统有：
1. 小麦胚质表达系统：优点是可以表达大量的蛋白质，缺点是表达的蛋白质可能不稳定，可能会受到外界环境的影响。

2. 改造桑叶表达系统：优点是可以表达大量的蛋白质，缺点是抗性低，可能会受到外界环境的影响。

3. 改造细菌表达系统：优点是可以表达大量的蛋白质，缺点是表达的蛋白质可能不稳定，可能会受到外界环境的影响。

4. 改造果蝇表达系统：优点是可以表达大量的复杂蛋白质，缺点是表达的蛋白质可能不稳定，可能会受到外界环境的影响。

生物制品学试题库一、名词解释1、生物制品学2、生物制品3、联合疫苗4、药品生产质量管理规范（GMP）5、生物制品国家批签发6、生物制品标准物质7、冷链系统 8、生物反应器9、核酸疫苗 10、基因工程疫苗11、免疫佐剂 12、减毒活疫苗13、类毒素 14、细菌内毒素15、免疫调节剂 16、微生态制剂17、益生菌 18、和生元19、临床生化试剂 20、免疫诊断试剂21、基因诊断试剂 22、核酸药物23、基因置换 24、基因增补（基因添加）25、特异性免疫球蛋白 26、静注丙球27、白细胞介素 28、集落刺激因子29、干扰素 30、肿瘤坏死因子二、填空题1、生物制品种类繁多、用途各异，研究目的不同，其分类方法也不一样，根据其组成及用途可分为（）、（）和（）。

2、制备生物制品要选择最佳生长时期的原料，植物原料要注意生长的（）、动物要选取适当的（）、微生物原料最好选取（）。

3、自原始代工程菌种经传代扩种获得的菌种称为（），用于制备生产用的工作代工程菌种。

4、与其它商品相比，生物制品的特殊性表现在：（）、（）和（）。

5、GMP根据其适用范围可分为三类：（）的GMP、（）的GMP和（）的GMP。

6、生物制品的检定一般分为（）、（）和（）三个方面。

7、为保证制品用于人体时不致引起严重反应或意外事故，必须抓好以下三方面的安全性检查：（）检查、（）检查和（）检查。

8、（）是疫苗中最主要的有效活性成分。

9、疫苗的基本性质包括：（）、（）和（）。

10、疫苗生产用菌毒种采用种子批系统，分为三级，即：（）、（）和（）。

11、影响佐剂质量的优劣或能否适用于人用疫苗的主要因素为：（）、（）和（）。

12、（）是指在免疫应答过程中，能将抗原物质提呈给T细胞的一类辅佐细胞。

13、目前国际上正在使用的伤寒疫苗主要有三种：（）、（）和（）。

14、目前我国在结核病防治方面面临两大难题：一是（），二是（）。

15、白喉曾是对儿童威胁很大的传染病，它是由（）引起的急性呼吸道传染病。