黑色素细胞培养方法

黑色素培植过程黑色素培植是一种自然界常见且被多余物种利用的分子进化策略。

它可以用来培养多种细菌、酵母和真菌，有助于揭示系统中未知的分子机制。

因此，了解黑色素培植的工艺是必要的。

一、黑色素培植的基础1. 背景：黑色素培植，也称为“色素细胞培养”，意味着将高度色素密度的细胞从源培养基中分离，再重新培养在新培养基上。

2. 优点：黑色素培植不仅具有高度可重复性，而且可以用于大规模培养细胞。

此外，由于不需要任何添加剂，它可以简化分离工序。

二、黑色素培植的步骤：1. 准备培养环境：首先将酿酒酵母的源培养基及培养皿中的细胞，加入检测培养基中。

2. 活化：将细胞加入培养基中并搅拌，使其活化，然后2回合循环，每回合搅拌1min后，培养基搅拌旋转速度减半。

3. 加入诱导剂：黑色素培植中使用的诱导剂通常为10％乙醇。

4. 保温培养：将培养皿转移到水浴中，并用恒温器加热并保温30min，保温结束后，将培养皿取出，摇晃，使细胞及全培养液均匀浸温。

5. 加入抑制剂：将常用的抑制剂（如吡哆醛）加入冷却的培养液中，使其以室温常温培养1-2小时以得到更好的结果。

6. 过滤：将培养液过滤到新的培养基。

三、黑色素培植的注意事项：1. 在培养液中加入足够的乙醇，以使细胞可以重复激活。

2. 避免细胞在水浴中受过热，以防止过热反应。

3. 使用均质搅拌器加热和搏动细胞，使其有效地从源培养基中分离出来。

4. 加入抑制剂以抑制黑色素增生，以获得最佳效果。

5. 将培养液存放在干燥和温暖的条件，以保持黑色素培养质量。

四、总结以上所述就是黑色素培植的过程，它有助于揭示系统中未知的分子机制，也是一种被多种物种利用的分子进化策略。

但是在进行这项工作时，应该小心地来操作，以免出现意外情况。

黑色素细胞体外培养技术的研究及应用维普资讯 ////0>.堑堡匿堂生箜墨鲞黑色素细胞体外培养技术的研究及应用新疆维吾尔自治区人民医院刘熔李红健综述一、体外培养技术的建立表皮培养而设计的培养液,钙离子浓度为.。

.概述:黑素细胞起源于外胚层的神经嵴,其数量与部但对一些要求较高的基础性研究来说,由于血清位、年龄有关与肤色、人种、性别等无关。

几乎所成分非常复杂,常使研究结果影响较大,同时血清中有组织内均有黑素细胞,但以表皮、毛囊、黏膜、视网也含有一定的细胞:莓性物质和抑制剂,对细胞有去分膜色素上皮等处为多。

位于表皮的基底层,与化作用,影响某些细胞功能的表达。

因此现在的研究者都在寻找不含血清或其他天然培养基成分的培养表皮细胞共同组成表皮黑素单位,其主要功能是产生液。

黑素小体保护皮肤免受损害。

最近研究表明,在某些不良条件刺激下,黑色素细胞可发生分裂、增殖、黑素无血清培养基一般包括基础培养液及辅加成分形成、移行等一系列行为参与机体代谢。

两部分。

无血清培养基的基础培养液一般采用人工应用细胞培养技术建立的体外纯培养,是研合成培养基,常用 /、培养液等。

究皮肤色素障碍性疾病的重要手段。

因此体外培养 .影响黑色素细胞生长的因子:人是人们十分关注的一项研究课题。

黑色素细年等在培养基中加入和胞的培养可以追溯到年代,但是直到年代才真首次成功地培养出了黑素细胞。

其机理是除正建立了可靠的黑色素细胞培养方法。

年了可以刺激黑素细胞自分泌特定的生长因子外,在化学结构上与二酯酰甘油类似,可以取代首先报告体外培养人黑色素细胞以来,由于培养技术没有突破,而未能培养出大量纯化的人活化蛋白激酶,是以为代表黑素细胞。

随着细胞生物技术的迅速发展,年的佛波酯类化合物的主要受体和靶点,通过信号转导美国和在含有辅助致癌因子途径/刺激黑素细胞增殖。

也有人认为培一一一一,或 ? 养成功的关键是对角质形成细胞有毒性作用,一一一 , 、霍舌毒可以抑制成纤维细胞生长,从而避免角质形成细素 ,和 %胎牛血清的培养液中, 胞和成纤维细胞污染,使黑素细胞快速生长。

熊果苷对体外培养的人黑素细胞的作用丁国斌，陈璧，汤朝武【关键词】熊果苷关键词: 熊果苷;黑素细胞;一元酚单氧酶;黑素类/生物合成摘要:目的研究熊果苷对体外培养的正常人表皮黑素细胞的作用效应. 方法利用碱性成纤维细胞生长因子为主要有丝分裂原建立正常人表皮黑素细胞培养系，MTT法测定熊果苷对黑素细胞活力的影响，以左旋多巴为底物测定酪氨酸酶活性，比色法测定黑素含量，并与曲酸及维生素C磷酸酯的结果比较. 结果熊果苷对体外培养的正常人黑素细胞酪氨酸酶活性呈浓度依赖性抑制，可显著减少黑素生成量，对黑素细胞活力影响很小. 结论熊果苷对体外培养的人黑素细胞的酪氨酸酶活性及黑素生成有显著抑制作用，且细胞毒性很低. Effects of arbutin on cultured human melanocytesDING Guo-Bin，CHEN Bi，TANG Chao-WuDepartment of Burn Surgery，Xijing Hospital，Fourth Military Medical University，Xi'an710033，ChinaKeywords:arbutin;melanocytes;monophenolmonooxyge-nase;melanins/biosynthesisAbstract:AIM To study the effects of arbutin on cultured human melanocytes.METHODS Basic fibroblast growth factor（bFGF）was employed to establish the culture of nor-mal human melanocytes.After arbutin was added into cul-tured human melanocytes，the cell viability，tyrosinase activi-ty and melanin content were measured by MTT assay，uti-lization of L-Dopa as the substrate，and colorimetric analy-sis，respectively.Furthermore，the effects of arbutin on the melanocytes were compared with that of kojic acid and Ascor-bic acid2-phosphate.RESULTS Arbutin showed a concen-tration-dependent reduction in tyrosinase activity of human melanocyte.Melanin content was reduced significantly by ar-butin，which has little influence on melanocytesviability.CONCLUSION Arbutin can significantly inhibit the tyrosi-nase activity and melanogenesis of cultured human melanocytes with low cytotoxicity.0 引言皮肤色素沉着常见于黄褐斑、老年斑及Ⅱ度烧伤创面愈合后，对外观影响较大.黑素细胞合成黑素是在其特征性细胞器―黑素小体内进行的，酪氨酸酶是黑素生成的主要限速酶，催化酪氨酸羟化为多巴并进而形成多巴醌的反应［1］ .酪氨酸酶抑制剂熊果苷是近来研究较多的一种脱色素药物，由于实验使用的细胞系及培养方法不同，各家报道的结果出入很大［1-5］ .我们利用体外培养的正常人表皮黑素细胞，研究了熊果苷对黑素细胞的增殖、酪氨酸酶活性及黑素生成量的影响，并与曲酸及维生素C磷酸酯比较，为进一步的临床应用提供参考.1 材料和方法1.1 材料熊果苷（arbutin），曲酸（kojic acid），维生素C磷酸酯（AP，L-ascorbic acid2-phosphate）及左旋多巴（L-Dopa）购自美国Sigma公司;RPMI1640培养基及霍乱毒素（cholera toxin）购自美国Gibco公司;Dispase酶购自日本三光纯药株式会社;（methyl thiazdyl tetrazolium，MTT），Triton X-100，转铁蛋白及胰蛋白酶（1∶250）购自华美公司;碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）购自珠海亿胜生物制药公司;小牛血清购自杭州四季青公司.倒置显微镜，酶联免疫检测仪等.药物溶液根据Curto等［3］的方法配制:先配制含无水乙醇300mL・L-1 ，2-丙二醇500mL・L-1 ，双蒸水200mL・L-1 的溶液（PEH），再用0.01mol・L-1 的PBS稀释成100mL・L-1 的PEH作为溶媒.实验前用100mL・L-1 的PEH将待测药物配成10g・L-1 的浓度，并依次倍比稀释成1，0.1，0.01，0.001g・L -1 的浓度备用.1.2 方法表皮细胞悬液的制备参照文献［6］的方法，将正常人包皮修剪成全厚皮，用2.5g・L-1 的Dispase酶消化后，分离表皮与真皮，表皮用2.5g・L-1 的胰酶消化成单细胞悬液，置黑素细胞培养液（MGM）中培养，MGM为含100mL・L-1 小牛血清的RPMI1640培养基，加入bFGF2×104 u・L-1 ，CT0.25mg・L-1 ，转铁蛋白10mg・L-1 ，氢化考的松3mg・L-1 ，胰岛素150u・L-1 ，庆大霉素1×10 5 u・L-1 .培养8～10d后传代，可得到纯度99%以上的黑素细胞.取第3～4代黑素细胞以6×103 个/孔的密度接种于2个96孔板中，分别用于测定细胞活力和酪氨酸酶活性.37℃，50mL・L-1 CO2 孵箱中培养1d后，吸弃上清液，每孔加入MGM180μL及药物溶液20μL，每组药物最终浓度分别为1，0.1，0.01，0.001和 0.0001g・L-1 ，每一浓度4个孔.对照组每孔加180μL MGM和20μL100mL ・L-1 PEH共4个孔.空白孔不接种细胞，加入180μL MGM和20μL100mL・L-1 PEH.37℃，50mL・L-1 CO2 孵箱中孵育3d.MTT法测定黑素细胞活力［7，8］ .药物作用3d后，每孔加入5g・L-1 的MTT溶液20μL，37℃，50mL・L-1 CO2 孵育4h，弃去上清液，每孔加二甲基亚砜150μL，选择490nm波长在酶联免疫检测仪上测各孔吸光度值，以空白孔调零.细胞活力抑制率=（1-各浓度平均吸光度值÷对照组平均吸光度值）×100%.以L-Dopa为底物，参考Maeda等［1］的方法测定细胞酪氨酸酶活性.药物作用3d后，弃去上清液，0.01mol・L-1 的PBS洗2次，每孔加90μL10ml・L-1 的Triton X-100，震荡5min以溶解细胞，每孔加10μL10g・L-1 的L-Dopa，37℃孵育30min，于490nm波长处比色，以空白孔调零，测各孔吸光度值.酪氨酸酶活性抑制率=（1-各浓度平均吸光度值÷对照组平均吸光度值）×100%.黑素含量采用Victoria的方法测定［4］ .将培养的第3～4代黑素细胞以1×104 个・cm-2 密度接种于2个6孔板，24h后换液，每孔加入4.5mL MGM及0.5mL0.1g・L-1 的药物溶液，每种药物3个孔，最终药物浓度为0.01g・L-1 .对照组以100mL・L-1 PEH代替药物溶液.50mL・L-1 CO2 ，37℃孵育3d后，弃去上清液，每孔加入2.5g・L-1 胰酶1mL于室温下消化5min，加入4mL MGM中止消化，吹打成单细胞悬液.取0.5mL作细胞计数，其余细胞悬液1500r・min-1 离心10min，弃上清，加入1mL1mol・L-1 的NaOH，震荡5min，选择490nm波长在酶联免疫检测仪上测吸光度值.黑素合成抑制率=［1-（药物孔吸光度值÷药物孔细胞密度）÷（对照孔吸光度值÷对照孔细胞密度）］×100%.统计学处理:全部数据均采用本校统计学教研室开发SPLM医用统计软件包进行单因素方差分析.2 结果2.1 药物对黑素细胞活力的影响熊果苷在1g・L-1 时抑制细胞活力约7%（P<0.01），在0.0001～0.1g・L-1 时对细胞活力无影响;曲酸在1g・L-1 和0.1g・L-1 时的细胞活力抑制率分别为37%和23%（P<0.01），在0.0001～0.01g・L-1 时对细胞活力无影响;AP各浓度对细胞活力均无影响（Fig1）.2.2 药物对黑素细胞酪氨酸酶活性的影响熊果苷对酪氨酸酶活性呈浓度依赖性抑制，抑制率为50%时的浓度（IC50值）约为1g・L-1 ，低于0.001g・L-1 时无抑制作用;曲酸在1g・L-1 和0.1g ・L-1 时酪氨酸酶活性抑制率分别为49%和16%（P<0.01），在0.0001～0.01g ・L-1 时无抑制作用;AP仅在1g・L-1 时对酪氨酸酶活性有抑制作用（P<0.01），但其抑制作用较熊果苷弱（P<0.01，Fig2）.2.3 药物对黑素合成的影响在0.01g・L-1 时，三种药物均对黑素细胞活力无影响，熊果苷和AP分别使黑素生成量减少了14%和6%（P<0.01），而曲酸对黑素生成无抑制作用（Fig3）.3 讨论酪氨酸酶兼具酪氨酸羟化酶活性（催化酪氨酸→多巴）和多巴氧化酶活性（催化多巴→多巴醌），是黑素细胞合成黑素的关键因素［9］ .本实验证实在以L-Dopa为底物时，在无细胞毒性的浓度范围内，熊果苷对体外培养的正常人表皮黑素细胞多巴氧化酶活性呈浓度依赖性抑制作用.Maeda等［1］报道熊果苷对酪氨酸羟化酶活性亦有竞争性抑制作用，但不减少体外培养的黑素细胞中酪氨酸酶的蛋白含量及其mR-NA水平.Chakraborty等［5］研究发现熊果苷对黑素细胞酪氨酸酶家族的三种酶―酪氨酸酶，酪氨酸酶相关蛋白-1和酪氨酸酶相关蛋白-2的含量及分子大小均无影响，认为熊果苷是在转录后阶段抑制酪氨酸酶的活性.Curto等［3］提出理想的脱色素药物应具备的标准，即在抑制酪氨酸酶活性和黑素生成的浓度下，对细胞活力和增殖力影响很小.我们的研究表明，熊果苷对体外培养的正常人表皮黑素细胞的毒性很低，对酪氨酸酶有较强抑制作用，IC50值约为1g・L-1 ，可明显抑制黑素生成，是一种理想的退色素药物.AP是维生素C的衍生物，具有普通维生素C相同的生物学效价，而理化性质稳定，本实验表明其对酪氨酸酶的抑制作用弱于熊果苷.在浓度为0.01g・L- 1 时，尽管对酪氨酸酶无明显的抑制作用，但对黑素生成的抑制率却达6%，这可能是由于其对黑素生成的多个氧化步骤都有抑制作用［10］ .曲酸是酪氨酸酶的慢结合竞争性抑制剂［11］ .本研究表明其细胞毒性较强.在1g・L-1 和0.1g・L-1 时表现出较强的酪氨酸酶抑制作用，与其高浓度时的细胞毒性作用有关，在无细胞毒性的浓度范围内对酪氨酸酶活性及黑素生成无抑制作用.当前对熊果苷等退色素药物的研究所使用的细胞系多是体外培养的哺乳动物或人的黑色素瘤细胞［3，4］，其增殖潜能及细胞内信号转导机制均与正常黑素细胞不同.传统培养方法均在培养基中添加有十四烷酰佛波醇乙酯（TPA）以刺激黑素细胞增殖［1，12，13］，而TPA可消耗蛋白激酶C从而影响细胞内信号转导及黑素细胞对药物的反应性［4］ .我们使用的是体外培养的正常人表皮黑素细胞，培养基中不含TPA，刺激黑素细胞增殖的是bFGF，而bFGF是黑素细胞的天然有丝分裂原［14］，因而我们的实验条件更为接近在体环境，实验结果对临床应用具有较高的参考价值.参考文献:［1］Maeda K，Fukuda M.Arbutin:Mechanism of its depigmenting action in melanocyte culture ［J］.J Pharmacol Exp Ther，1996;276（2）:765-769.［2］Nakajima M，Shinoda I，Fukuwatari Y，Hayasawa H.Arbutin increases the pigmentation of cultured melanocytes through mechanisms other than the induction of tyrosinase activity ［J］.Pigment Cell Res，1998;11（1）:12-17.［3］Curto EV，Kwong C，Hermersdorfer H，Glatt H，Santis C，Vi-rador V，Hearing VJ，Dooley TP.Inhibitors of mammalian melanocyte tyrosinase:invitro comparisons of alkyl esters of gentisic acid with other putative inhibitors ［J］.Biochem Phar-macol，1999;57（6）:663-672.［4］Virador VM，Kobayashi N，Matsunage J，Hearing VJ.A stan-dardized protocol for assessing regulators of pigmentation ［J］.Anal Biochem，1999;270（2）:207-219.［5］Chakraborty AK，Funasaka Y，Komoto M，Ichihashi M.Effect of arbutin on melanogenic proteins in human melanocytes ［J］.Pigment Cell Res，1998;11（4）:206-212.［6］Hu DH，Chen B，Tang CW，Su YJ，Wang JB，Jin M，Jia CY，Xu MD.Expression and secretion of hbFGF by human ker-atinocytes transfected with exogenetic hbFGF cDNA in vitro ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（5）:404-408.［7］Lan H，Wang Z，Zhang LX，Guo SZ.Inhibition of tetram-ethylpyrazine （TMP）on hypertrophic scar-derived fibroblasts ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（11）:964-965.［8］Hu DH，Hughes MA，Chen B，Xu MD，Jia CY，Cherry GW.The investigation on the way to obtain the histological informa-tion of the cells during performing the MTT-method ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（11）:1009-1012.［9］Iozumi K，Hoganson GE，Pennella R.Role of tyrosinase as the determinant of pigmentation in cultured human melanocytes ［J］.J Invest Dermatol，1993;100（6）:806-811.［10］Kameyama K，Sakai C，Kondoh S，Yonemoto K，Nishiyama S，Tagawa M，Murata T，Ohnuma T，Quigley J，Dorshy A，Buchs D，Blanock K.Inhibitory effect of magnesium L-ascor-byl-2-phosphate（VC-PMG）on melanogenesis in vitro and in vi-vo ［J］.J Am Acad Dermatol，1996;34（1）:29-33.［11］Cabanes J，Chazarra S，Garcia CF.Kojic acid，a cosmetic skin whitening agent，is a slow-binding inhibitor of catecholase activ-ity of tyrosinase ［J］.J Pharm Pharmacol，1994;46（7）:982-985.［12］Eisinger M，Marko O.Selective proliferation of normal human melanocytes in vitro in the presence of phorbol ester and cholera toxin ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1982;79（3）:2018-2022.［13］Tobin DJ，Colen SR，Bystryn JC.Isolation and long-term cul-ture of human hair-follicle melanocytes ［J］.J Invest Dermatol，104（1）:86-89.［14］Halaban R，Langdon R，Berchall N，Cuono C，Baird A，Scott G，Moellmann G，McGuire J.Basic fibroblast growth factor from human keratinocytes is a natural mitogen for melanocytes ［J］.J Cell Biol，1988;107（4）:1611-1619.作者简介: 丁国斌（1970-），男（汉族），河南省信阳市人.硕士.Tel.（029）3375298（第四军医大学西京医院烧伤科，陕西西安710033）。

树突状细胞与黑色素瘤细胞体外共培养体系对小鼠黑色素瘤形成的影响郑云梅;和晨辰;王世忠;沈万秋;李海东【摘要】目的探讨树突状细胞(DC)与黑色素瘤细胞(B16)体外共培养后对小鼠黑色素瘤生长的影响.方法提取小鼠骨髓细胞,分化DC,培养至第6天,将细胞分为4组,脂多糖(LPS)组、聚肌胞[Poly(IC)]组、Melan-A抗原肽(Melan-A)组分别加入DC佐剂LPS(终浓度100 ng/mL)、Poly(IC)(终浓度20 ng/mL)、Melan-A抗原肽(终浓度5μmol/L)进行处理,未处理组未进行干预.采用流式细胞术检测DC成熟状态.B16细胞与培养第6天的DC共培养2 d.取C57BL/6J小鼠皮下注射B16细胞(8只),DC+B16细胞(8只),LPS(8只)、poly(IC)(8只)、Melan-A抗原肽激活(8只)的DC+B16细胞,接种B16细胞1周再接种DC+B16细胞(5只),对照组(3只)不接种细胞.于接种第14天取部分小鼠处死,取脾脏,镜下观察其组织形态,接种第28天测算肿瘤体积.结果LPS组、Poly(IC)组、Melan-A组成熟DC多于未处理组.接种DC+B16细胞的小鼠未见肿瘤生长;接种第28天,与接种B16细胞的小鼠比较,接种LPS、poly(IC)、Melan-A抗原肽激活的DC+B16细胞及接种B16细胞1周再接种DC+B16细胞的小鼠肿瘤体积减小(P均<0.05).与对照组比较,第14天接种DC+B16细胞小鼠脾脏滤泡结构无明显变化,而接种B16细胞及LPS、poly(IC)、Melan-A抗原肽激活的DC+B16细胞小鼠,脾脏滤泡结构增加.结论 DC与B16共培养的可抑制小鼠黑色素瘤的形成.%Objective To investigate the effect of co-culturing dendritic cells (DC)with melanoma cells (B16)on growth of melanoma in mice.Methods We extracted the bone marrow cells.Mouse DC were cultured for 6 days and then were divided into 4groups:lipopolysaccharide (LPS)group,Poly (IC)group,Melan-A group andthe control group. Cells in the LPS group,Poly (IC)group,Melan-A group were incubated with LPS (LPS with final concentration of 100 ng/mL),poly-inosinic-cytidylic acid [Poly(IC)with final concentration of 20 ng/mL]and Melan-A peptide (with final concentration of 5 μmol/L),respectively.The control group was not treated.Flow cytometry was used to study the matura-tion and activation state of DC.B16-F10 (B16)melanoma cells were co-cultured with DC for 2 days and then were used for inoculation of mice.For melanoma model,C57BL/6J mice were inoculated subcutaneously.Some mice were killed at 14 days after inoculation and their spleens were taken to study the structural changes by histochemistry.Tumor size was meas-ured at 28 days after inoculation.Results More mature DC were produced after LPS,Poly(IC)or Melan-A peptide treat-ment as compared with that of the control group (P <0.05).There was no tumor growth after DC +B16 cell inoculation. Compared with the mice inoculated with B16 cells only,the tumor volume was smaller in the mice inoculated with LPS,Po-ly(IC)or Melan-A peptide-activated DC +B16 cells or the mice inoculated with B16 cells one week later followed by an-other inoculation of DC +B16 cells (all P<0.05).Compared with the control group,there was no structural change of the spleen follicles in the mice inoculated with DC +B16,but the number of spleen follicles was increased in the mice inocula-ted with B16 or with LPS,Poly (IC),or Melan-A peptide-activated DC +B16 cells.Conclusion DC co-cultured with B16 can inhibit the growth of melanoma in mice.【期刊名称】《山东医药》【年(卷),期】2017(057)005【总页数】3页(P1-3)【关键词】黑色素瘤;树突状细胞;免疫治疗;小鼠【作者】郑云梅;和晨辰;王世忠;沈万秋;李海东【作者单位】天津医科大学基础医学院,天津 300070;天津医科大学药学院;天津医科大学基础医学院,天津 300070;天津医科大学药学院;天津医科大学基础医学院,天津 300070【正文语种】中文【中图分类】R739.5黑色素瘤恶性程度高，转移发生早，病死率高[1]。

小鼠皮下及肺转移肿瘤模型制备宋天姣;曹倩文;王娜;田雨;郑全辉【摘要】①目的经皮下和尾静脉注射，制备小鼠黑色素瘤细胞增殖、转移模型。

②方法体外培养黑色素瘤细胞，分别经腋部皮下和尾静脉注射接种C57BL／6小鼠，接种剂量分别为1×106／只和3×105／只，2周后观察黑色素瘤形成及肺部转移情况。

③结果黑色素瘤细胞注射2周后，经皮下接种的小鼠腋窝出现明显肿瘤，成瘤率达100％；经尾静脉注射的小鼠肺部出现大量黑色素瘤结节，肿瘤转移率达90％。

④结论经皮下和尾静脉注射方法能够成功制备小鼠的肿瘤细胞增殖和转移模型。

%Objective To prepare tumor proliferation and metastasis mouse models through sub‐cutaneous and tail vein injection of melanoma cells .Methods Melanoma cells (1 × 106/100uL )were subcutaneously injected into C57BL/6 mice from the axillary region to prepare the tumor proliferation mouse model;melanoma cells(3 × 105/100uL)were injected by tail vein to prepare the tumor metasta‐sis mouse model .Melanoma tumor formation and lung metastasis were detected 2 weeks after melano‐ma cell injection .Results The subcutaneously injected mice showed obvious melanoma formation in the axillary region and the tumor formation rate was 100% .The lung of tail vein injected mice showed apparent melanoma nodules and the tumor metastasis rate was 98% .Conclusion Tumor proliferation and metastasis mouse models can be successfully prepared by subcutaneous and tail vein injection of melanoma cells .【期刊名称】《河北联合大学学报（医学版）》【年(卷),期】2016(000)001【总页数】2页(P1-2)【关键词】肿瘤细胞;黑色素瘤;增殖;转移【作者】宋天姣;曹倩文;王娜;田雨;郑全辉【作者单位】华北理工大学河北唐山 063000;华北理工大学河北唐山 063000;华北理工大学河北唐山 063000;华北理工大学河北唐山 063000;河北省慢性疾病重点实验室【正文语种】中文【中图分类】Q784[ABSTRACT] Objective To prepare tumor proliferation and metastasis mouse models through subcutaneous and tail vein injection of melanoma cells.Methods Melanoma cells(1×106/100uL)were subcutaneously injected into C57BL/6 mice from the axillary region to prepare the tumor proliferation mouse model;melanoma cells(3×105/100uL)were injected by tail vein to prepare the tumor metastasis mouse model.Melanoma tumor formation and lung metastasis were detected 2 weeks after melanoma cell injection.Results The subcutaneously injected mice showed obvious melanoma formation in the axillary region and the tumor formation rate was 100%.The lung of tail vein injected mice showed apparent melanoma nodules and the tumor metastasis rate was 98%.Conclusion Tumor proliferation and metastasis mouse models can be successfully preparedby subcutaneous and tail vein injection of melanoma cells.[KEY WORDS] Tumor cell metastasis.Melanoma.Proliferation.Transfer目前恶性肿瘤已成为一类严重威胁人类健康的多发病和常见病，其发病机制仍未完全阐明，对肿瘤有效的治疗措施还处在不断探索之中。

黑色素含量测定
一．实验材料
仪器：倒置显微镜、96孔板、微量移液器（枪及枪头）、恒温培养箱、喷壶、脱脂棉、封口膜、培养瓶100ml 、点滴瓶(250ml 、500ml)、烧杯（500ml 、50ml ）、量筒（500ml ，100ml ，10ml ），滤器及滤膜（0.22um ）、酒精灯、移液管、吸球、吸管架及瓶架、镊子、标签贴、双蒸器、超净台
试剂：胎牛血清、DMEM 培养基、胰蛋白酶、PBS 液、75%酒精、NaOH 、
二．实验方法
用NaOH 溶解法。

取对数期的B16黑素瘤细胞，弃去培养液，用PBS 液清洗2次，加入培养液，调节细胞浓度为0.5×104—1×104/孔相当于干细胞悬液5×104—10×104个（ml -1）,加入96孔板中，每孔加入100ul 。

过夜后(12h)，细胞贴壁,使用同MTT 法同浓度同体积的含药培养基加入，并设置对照组（细胞+培养基）和空白对照组（培养基），每个浓度组设置5个复孔，培养基中均含5%胎牛血清，于37摄氏度5%CO 2恒温培养箱中培养56h 后，吸去培养液用 0.25%胰酶消化，以1000r/min 离心5min 弃上清液，每个处理因素下的细胞加入200ul 含10%二甲基亚砜（DMSO ）的NaOH （1mol/L ）溶液，于65摄氏度水浴完全溶解黑色素颗粒，酶联免疫检测仪检侧490nm 处吸光度A 值。

（黑素形成率＝A 实验组/A 空白组平均值×100%）。

4 O p ie L H. A n g i o ten sin co n ve r t i n g en zym e i n h ib ito r s: Sc i en2t i f i c ba s is fo r c l in ica l u se. A u tho r’s P u b lish in g. H o u se N ew Yo rk , 1992: 1695 S ihm I, Sch ro ede r A P , A a lk j o a re e t a l .N o r m a liza t i o n o f m ed ia to lu m en ra t i o o f h u m an subcu tan eo u s a r te r ie s du r i n g an t i h y p e r t en sive t r ea t m en t w ith a p e r i n dop r i l ba s ed r eg i2 m en. E u r H ea r t J , 1993; 14 (Sup p l) : 63 7 A s m a r R G, Jo u rno H J , L a i o lley P J e t a l . T rea t m en t fo r o n e yea r w ith p e r in dop r il effec t o n ca rd ia l m a ss an d a r te r i a l com p lian ce in e ssen t ia l h yp e r ten si o n. J H yp e r ten s, 1988;6 (Sup p l 3) : S338 M ich e l J B , C a t t i o n A L , Su lz m an n J L e t a l . H o r m o n a l an d ca rd ia l effec t s o f co n ve r t in g en zym e inh ib it i o n in ra t m y2 o c a r d i a l in fa r c t i o n. C ire R e s, 1988; 62 (4) : 641(收稿: 1996205207; 修回: 1997201206)(编辑王红、沈锡庚)6 L evy B I, M ich e l J B , Sa l z m an n J L e t a l . A r t e r i a l effec t so f A C E inh ib ito r in reno v a s cu la r an d sp o n t an eo u sly h y p e r2ten sive ra t s. J H yp e r t en s , 1988; 6 (Sup p l 3) : S23Therapeut i c ef f e c t s of per i n dopr il on con g e s t i ve hear t fa ilureC h e n Gu a n g h u i, Zh u Sh a n j u n,Y u a n Y u q u a n (D ep a r t m en t o f C a r d i o lo gy, X in q i ao H o sp t i a l, T h ird M ilita r y M ed i ca l U n i2 ve r s ity, C h o n gq i n g, 630037)A b stra c t O b je c t i v e :T o in ve s t i ga t e th e th e r ap e u t i c effec t s o f p e r i n dop r i l o n co n ge s t i ve h e a r t fa i lu re(CH F )an d it s p o ssib le m ech a n is m. M e tho d s: 40 p a t i en t s(20 m a l e s, 20 fem a l e s) w ith th e age ran g in g f r om21 to 77 yea r s o ld (m ean = 51. 47) w e re r an dom ized in to th e co n t ro l g ro up ( n = 17) t rea ted w ith d ig ita l is andd iu re t ic s an d th e t rea t m en t g ro up ( n = 23) t rea ted w ith p e r in dop r il, d ig ita lis an d d iu re t ic s.T h en th e ch a ng e so f th e fo llow in g in d ice s w e re o b se rved: 1) N YHA c la ss; 2) h em o dyn am ic s an d ca rd iac p e rfo rm an ce such a sF S, E F , C I, C O an d SV ; 3)V ST , L V I D, L V PW T an d L V m a s s; 4) p la s m a A N F , A NG II, A ld, E T, A C Ean d PRA. R e s u lts : In th e t rea t m en t g ro up , it w a s fo un d th a t: 1)N YHA c la ss w a s am e li o ra ted; 2) th e ca r d i a cp e rfo rm an ce an d h em o dyn am ic s w e re i m p ro ved; 3) th e b loo d RA A S w a s in h ib ited; 4) th e syn th e sis o f A N Fan d d isch a r ge o f E T w e re sign if ican t l y dec rea sed. C o nc lus io n: P e r in dop r il is an effec t ive agen t i n th e t r ea t2m en t o f CH F. It s m ech an is m m igh t be to dec rea se th e syn th e sis o f A N F an d d isch a rge o f E T be side s i n h i b it2in g RA A SKey words p e r i n dop r i l; co n ge s t i ve h e a r t fa i lu re (CH F ) ; ren in 2an g i o ten sin2a s d s te r o n e sy s tem (RA A S)培养黑素细胞生物学鉴定方法及选择The m e t hodm e l an o cy t e san d cho ice of iden t i f i ca t i on on b i o l og i ca l cult i va ted 钟白玉邓军叶庆佾(第三军医大学附属西南医院皮肤科) 重庆, 630038皮肤色素障碍性疾病主要与皮肤黑素系统中的黑素细胞(M C ) 有关。

紫外线照射对体外培养人表皮黑素细胞MC1R受体的影响【摘要】目的:为了了解紫外线照射对体外培养人正常黑素细胞黑皮质素受体-1（mc1r）的影响。

方法:采用mtt法测定uvr照射后黑素细胞增殖情况，以naoh溶解法测定黑素含量和检测uvr照射后黑素细胞mc1r基因mrna表达。

结果:uva照射后黑素细胞数量在低照射剂量时升高,高剂量时无明显变化，黑素含量在低剂量时升高,达到一定剂量后将保持稳定；uvb照射后黑素细胞数量在低照射剂量时升高,在照射剂量到达某个临界点后随着照射剂量的增加而迅速降低，黑素含量在低剂量时增加,在高剂量时保持稳定；uva 和urb照射后黑素细胞mc1r基因mrna的表达均明显高于对照组。

结论:不同剂量和不同类型紫外线照射对体外培养人正常黑素细胞的数量、黑素含量及mc1r表达均可产生正性作用。

【关键词】黑皮质素受体； mc1r；紫外线；黑素细胞【中图分类号】s821【文献标识码】b【文章编号】1008-6455（2011）08-0018-02紫外线（uv）按波长分为长波紫外线（uva）,中波紫外线（uvb）和短波紫外线。

短波紫外线在到达地球之前几乎全部被大气层吸收,故而对人类皮肤而言,最有影响力的是中长波紫外线。

紫外线对人皮肤的影响,包括光老化，光损伤，色素沉着反应，导致皮肤肿瘤等，其中紫外线对人黑素细胞及黑素合成有着极复杂重要的影响。

人类皮肤色素形成具有半孟德尔遗传模式，有多基因特性，由主要基因和修饰基因共同作用。

色素形成是外界环境影响下的各种基因同步化相互作用产生的一大性状［1］。

众多基因中，能影响人黑素细胞功能的有黑皮质素受体，p基因，tyrp 及silv基因家族成员等,其中mc1r表达于人黑素细胞，mc1r和α-msh及acth有亲近性（α-促黑素细胞激素和acth均促进黑素形成使皮肤着色），一旦黑皮质素肽结合mc1r，就会刺激黑素的形成。

［2］ mc1r是决定人类皮肤颜色的主要基因之一，已被成功克隆，其位点在16q24.3。

人表皮黑素细胞的原代培养方法人表皮黑素细胞是一种位于表皮层的细胞，负责生产黑色素，并影响皮肤的颜色。

对于研究人类皮肤生理与病理的机制，以及开发新型美容化妆品，人表皮黑素细胞的原代培养非常重要。

本文将介绍人表皮黑素细胞的原代培养方法，具体内容如下：一、实验器材和试剂的准备在进行人表皮黑素细胞原代培养前，需要准备一些实验器材和试剂，包括：1.1 ml和5 ml的离心管；2.无菌的培养皿和台式离心机；3.口罩、手套、护目镜、移液器等安全防护用品；4.DMEM/F-12培养基、1%青霉素/链霉素混合液、10%胎牛血清、1%乙酰化胰蛋白酶（trypsin）液。

二、人表皮黑素细胞的收集与分离1.从健康志愿者皮肤中取一小块组织，并用1%的青霉素/链霉素混合液溶解；2.用剪刀把组织剪成小段，并用口贴和镊子将其放入含10%胎牛血清和1%乙酰化胰蛋白酶液的培养皿中，在37℃的恒温下孵化大约2小时，使细胞进行消化；3.在消化完成后，离心5 min，将5 ml血清补充的DMEM/F-12培养基加入离心管中。

液体呈沉淀状，将其放入台式离心机里，用2000 rpm 的速度旋转5 min，将上清液抛去；4.再次加入培养基，将其盖满淀粉样细胞沉淀，稍加搅拌，将液体小心地移入其它离心管中。

三、人表皮黑素细胞的培养与传代1.将分离后的细胞移入无菌的培养皿中，加入10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素混合液的DMEM/F-12培养基，放入37℃恒温培养箱内，进行孵化；2.观察细胞的生长情况，当细胞数量逐渐增多，且已贴壁生长4－5天后，进行第一次传代；3.移除培养皿中的培养基，用去菌液或PBS洗涤一遍细胞，并加入0.05%的trypsin，放在37℃下孵化2-3分钟，使细胞充分分离；4.加入等量的终止胰酶的胎牛血清，离心5分钟；5.移除上清液，并加入培养基，旋转5分钟，将上清液抛去；6.在第三－五代时，再次均分，放入无菌的培养皿中，加入10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素混合液的DMEM/F-12培养基进行培养。

原代培养第1 天1. 用70 % 乙醇浸洗皮肤标本，然后用D-PBSA 浸洗2 次。

2. 将组织移入无菌100 mm 培养皿，表皮面朝下。

3. 用解剖剪除去皮下脂肪和深部真皮。

4. 将剩余的组织用手术刀切成2 mm ×2 mm 小块。

刀片在组织上摇动，但不要采用锯切。

5. 将组织块移入盛有冷的0.25 % 胰蛋内酶的15ml 离心管。

6. 在室温条件下，将组织块孵育60~90 min 。

对于某些供体的皮肤，先在4°C 条件下孵育18~24 h，然后在37°C 条件下孵育1~2 h，这样可获得较多的黑素细胞。

第2 天7. 轻拍离心管，使沉于底部的组织块移动。

然后，将离心管内的内容物快速倒入60 mm 培养皿。

8. 用手术镊将组织块逐一地移入100 mm 干培养皿，上皮面朝下。

轻轻摇动组织块，使其接触培养皿底壁。

应使表皮层附着在培养皿上，以便用手术镊彻底分离真皮。

除去真皮片。

9. 将表皮片移入盛有5 ml 0.02% EDTA （0.7 mmol/L）的15 ml 离心管。

注意将表皮片放入EDTA 液，不要贴在离心管壁上。

10. 轻轻摇晃离心管，使表皮片分散成单细胞。

11. 离心（350 g，5 min），然后吸去上清液。

12. 用MHSM 混悬细胞。

13. 用血细胞计数板计数细胞，然后在35 mm 培养皿用2 ml 含有5 % FBS 的MHSM 孵育细胞，细胞密度为1×106个（约2×104~4×104 个黑素细胞）。

FBS 促进细胞贴壁。

14. 用含有生长因子和牛垂体提取物的MHSM 换液，每周2 次。

第3~30 天15. 培养24 h 后，培养的细胞中含有原代角质形成细胞和散在的黑素细胞。

角质形成细胞在几天后停止增殖，角质形成细胞克隆在第2 周浮起。

第2 周末，只剩有黑素细胞。

在大多数情况下，细胞在2~4 周内生长接近汇合，此时准备传代。