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深海鲣鱼(Katsuwonus pelamis)眼窝油中DHA和EPA的提取及其抗抑郁活性研究李海波;吕倩倩;白冬;王欢;关丽萍;谢超【摘要】为了探索鲣鱼(Katsuwonus pelamis)鱼头眼窝肉中的DHA(C22∶6n3)和EPA(C20∶5n3)的抗抑郁活性效果,采用现代食品分离技术分离提取鲣鱼眼窝肉中的DHA和EPA,并对其抗抑郁活性效果进行研究.研究结果发现,当DHA和EPA 剂量分别为50,100和300mg/kg时,能够对强迫游泳实验和悬尾实验的小鼠产生抗抑郁作用,其中低剂量(50mg/kg)表现为最活跃.DHA和EPA还能够对引起头抽动综合征的5-羟色胺小鼠产生轻微的增强作用.通过高效液相色谱-电化学法同时测定小鼠大脑区域内主要的单胺类神经递质及其代谢产物.本实验发现,与用压力媒介物处理的小鼠相比,DHA和EPA能够显著增加主要神经递质5-羟色胺和去肾上腺素在小鼠海马体、下丘脑及皮质层中的浓度,并减少5-羟色胺的代谢.DHA和EPA 能够在预测抗抑郁特性的动物模型中(强迫游泳实验,悬尾实验)明确其具有抗抑郁活性效果,具有潜在的生物医学应用前景和环保效应.【期刊名称】《海洋与湖沼》【年(卷),期】2016(047)006【总页数】7页(P1214-1220)【关键词】鲣鱼;DHA;EPA;抗抑郁活性;5-羟色胺;神经递质【作者】李海波;吕倩倩;白冬;王欢;关丽萍;谢超【作者单位】浙江国际海运职业技术学院舟山 316021;浙江省海产品健康危害因素关键技术研究重点实验室浙江海洋大学食品与医药学院舟山 316022;浙江省海产品健康危害因素关键技术研究重点实验室浙江海洋大学食品与医药学院舟山316022;浙江省海产品健康危害因素关键技术研究重点实验室浙江海洋大学食品与医药学院舟山 316022;浙江省海产品健康危害因素关键技术研究重点实验室浙江海洋大学食品与医药学院舟山 316022;浙江省海产品健康危害因素关键技术研究重点实验室浙江海洋大学食品与医药学院舟山 316022【正文语种】中文【中图分类】TS254;R964抑郁症是主要的精神疾病之一, 它通常伴随着某些相关的症状, 如: 定期的消极情绪, 减少体力活动, 产生无助感以及思想和认知功能的迟钝表现。
基金项目：舟山市科技计划项目（编号：２０２１Ｃ４１００６，２０２１Ｃ１２００３）作者简介：楚玉柔，女，浙江海洋大学在读硕士研究生。
通信作者：王家星（１９９４—），女，浙江省海洋开发研究院中级工程师，硕士。
Ｅ ｍａｉｌ：１８８６８００５７５６＠１６３．ｃｏｍ收稿日期：２０２２ ０３ ０４ 改回日期：２０２２ １０ １０犇犗犐：１０．１３６５２／犼．狊狆犼狓．１００３．５７８８．２０２２．９０２５２［文章编号］１００３ ５７８８（２０２３）０３ ０１５３ ０８鲣鱼背腹肉降尿酸肽制备工艺优化及体外活性研究Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎ ｖｉｔｒｏａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｕｒｉｃａｔｅ ｌｏｗｅｒｉｎｇｐｅｐｔｉｄｅｆｒｏｍｄｏｒｓａｌｂｅｌｌｙｍｅａｔｏｆｓｋｉｐｊａｃｋ楚玉柔１，２犆犎犝犢狌 狉狅狌１，２ 孙继鹏２犛犝犖犑犻 狆犲狀犵２ 朱秋语１犣犎犝犙犻狌 狔狌１ 姚 玮２犢犃犗犠犲犻２ 宋 茹１犛犗犖犌犚狌１ 王家星２犠犃犖犌犑犻犪 狓犻狀犵２（１．浙江海洋大学，浙江舟山 ３１６０２２；２．浙江省海洋开发研究院，浙江舟山 ３１６０２１）（１．犣犺犲犼犻犪狀犵犗犮犲犪狀犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犣犺狅狌狊犺犪狀，犣犺犲犼犻犪狀犵３１６０２２，犆犺犻狀犪；２．犣犺犲犼犻犪狀犵犕犪狉犻狀犲犇犲狏犲犾狅狆犿犲狀狋犚犲狊犲犪狉犮犺犐狀狊狋犻狋狌狋犲，犣犺狅狌狊犺犪狀，犣犺犲犼犻犪狀犵３１６０２１，犆犺犻狀犪）摘要：目的：提高鲣鱼加工副产物利用率，开发具有降尿酸活性的食品基料。
方法：通过响应面分析酶解过程中酶的种类及添加量、ｐＨ值、酶解温度和酶解时间对抑制肽固含量和黄嘌呤氧化酶（ＸＯＤ）抑制率的影响。
结果：胰蛋白酶为最佳水解鲣鱼背腹肉的蛋白酶，最佳酶解工艺条件为酶添加量４％，ｐＨ８．０，酶解温度５５℃，酶解时间５ｈ，料液比１∶３（ｇ／ｍＬ）。
该条件下制备的ＸＯＤ抑制肽固含量为７．９６％，ＸＯＤ抑制率为４３．９４１％，具有很强的抗氧化能力，清除羟自由基和ＤＰＰＨ自由基的ＥＤ５０分别为６．０，１０．０ｍｇ／ｍＬ。
鲭科鱼类活性肽的酶法制备及其生理功能研究进展向泽敏;葛俊驿;邱晓挺;严小军【摘要】鲭科鱼类作为重要的海洋经济种类，资源丰富，是食源性蛋白的重要来源，但目前对其综合利用却徘徊在较低水平。
酶解鲭科鱼类蛋白以制备具有抗氧化、降血压、免疫、抗菌等作用的活性肽是将鲭科鱼类进行高附加值利用的一条有效途径。
就酶解鲭类蛋白质制备活性肽的工艺条件、活性肽常见的分离纯化和序列鉴定方法、活性肽的主要生理功能等方面的研究进展进行综述，讨论了酶法制备活性肽的研究中所面临的问题和相应对策，并对其应用前景予以展望。
%Scombridae fishes , as economically important marine species , are abundant sourcesof food proteins .Their comprehensive utilization rate , however , is still at a low level .Bioactive peptides with various biological activities such as antioxidation , anti-hyper-tension, immunization and antibacterial prepared by enzymatic hydrolysis is an efficient way for higher added -value of Scombridae fi-shes.This paper reviewed the conditions of enzymatic hydrolysis of Scombridae proteins , the approaches for purification and identifica-tion as well as the primary physiological functions of Scombridae peptides .Furthermore, the problems and corresponding countermeas-ures were discussed and potential applications of bioactive peptides from hydrolysates of Scombridae fishes were summarized .【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2017(034)001【总页数】5页(P65-69)【关键词】鲭科;活性肽;酶法制备;分离纯化;生理功能【作者】向泽敏;葛俊驿;邱晓挺;严小军【作者单位】宁波大学应用海洋生物技术教育部重点实验室，宁波315211;宁波大学应用海洋生物技术教育部重点实验室，宁波315211;宁波大学应用海洋生物技术教育部重点实验室，宁波315211;宁波大学应用海洋生物技术教育部重点实验室，宁波315211【正文语种】中文【中图分类】S917.4;TS254.9鲭科(Scombridae)隶属硬骨鱼纲(Osteichthyes)、辐鳍亚纲(Actinopterygii)、鲈形目(Perciformes)、鲭亚目(Scombroidei)，是一类海洋中上层洄游性鱼类。
![酶解金枪鱼血蛋白降血压肽的制备方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/015368a7e518964bce847c9e.png)
专利名称：酶解金枪鱼血蛋白降血压肽的制备方法
专利类型：发明专利
发明人：郭健,吴凯强,宋文东,胡世伟,纪丽丽,蔡璐,姜维,李世杰,王亚宁
申请号：CN201510565220.3
申请日：20150908
公开号：CN105063150A
公开日：
20151118
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了酶解金枪鱼血蛋白降血压肽的制备方法，包括以金枪鱼血为原料，取金枪鱼血，去腥，用NaOH溶液调节pH，加热后保存；将金枪鱼血的温度升至55-60℃预热，而后加入碱性蛋白酶进行酶解，离心后，将酶解液依次经超滤、脱盐、冷冻干燥和层析，得到降血压肽。
通过采用金枪鱼血为原料，可以将原先废弃物重新利用，有利于环境保护。
金枪鱼血调节pH后经预热处理并酶解后，可以得到产率较高的活性物，且活性物的降压应用效果显著，本方法的综合效果显得出乎意料。
因而本发明有有效成分产率高、降压效果好、安全可靠、生态友好的优点。
申请人：浙江海洋学院
地址：316022 浙江省舟山市临城街道长峙岛海大南路1号
国籍：CN
代理机构：杭州浙科专利事务所(普通合伙)
代理人：吴秉中
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910280945.6(22)申请日 2019.04.09(71)申请人 浙江荣舟海洋产业股份有限公司地址 316100 浙江省舟山市普陀区展茅街道丰岛工业园区A区6路申请人 浙江荣生海洋生物制品有限公司(72)发明人 倪剑波 史跃 黄开秋 (74)专利代理机构 深圳市科吉华烽知识产权事务所(普通合伙) 44248代理人 谢肖雄(51)Int.Cl.C07K 14/78(2006.01)C12P 21/06(2006.01)C07K 1/34(2006.01)C07K 1/14(2006.01)(54)发明名称一种金枪鱼蛋白肽的制备方法(57)摘要本发明公开了一种金枪鱼蛋白肽的制备方法，包括以下步骤，所述步骤一：首先选取新鲜的金枪鱼皮为原料，接着将鱼皮与水按照1:30的比例进行混合，接着放在密封的容器中加热至沸点，使得水温始终保持在100摄氏度，此过程维持两到三小时后得到混合溶液，步骤二：将得到的混合溶液降温至40-65摄氏度，接着在混合溶液中加入酶，静至一至两小时后充分搅拌，步骤三：本发明金枪鱼蛋白肽的制备方法，产量得率较高，抑菌性能好，养颜润肤效果较佳，同时本发明所用的原料中无有害物质，不会污染环境，且本发明中材料来源广泛，制备工艺较为简单，产品具有美容养颜、促进细胞生长、抗衰老的作用，对生命活动发挥着极其重要的作用。
权利要求书1页 说明书4页 附图1页CN 109988235 A 2019.07.09C N 109988235A权 利 要 求 书1/1页CN 109988235 A1.一种金枪鱼蛋白肽的制备方法，包括以下步骤，其特征在于：所述步骤一：首先选取新鲜的金枪鱼皮为原料，接着将鱼皮与水按照1:30的比例进行混合，接着放在密封的容器中加热至沸点，使得水温始终保持在100摄氏度，此过程维持两到三小时后得到混合溶液；步骤二：将得到的混合溶液降温至40-65摄氏度，接着在混合溶液中加入酶，静至一至两小时后充分搅拌；步骤三：接着将步骤二中搅拌后的混合溶液加入胰凝乳蛋白酶和脂肪酶，搅拌酶解两到四小时，得到酶解液；步骤四：将酶解液用活性炭进行脱腥脱色，过滤，得到脱色液，纯化和干燥后得到胶原蛋白肽。
金枪鱼碎肉酶解液对巴马香猪肉风味和滋味的作用乙丛敏;苏秀榕;陈义芳;王求娟;袁剑;杨茗媛;申慧婷;耿灵鑫;王小凤;张凌芷;芦晨阳;周君;李晔【摘要】以金枪鱼碎肉酶解液作为添加剂喂养巴马香猪,研究其对猪肉风味和滋味的影响.运用电子鼻与气相色谱-质谱(GC-MS)测定巴马香猪肉风味,运用电子舌和高效液相色谱(HPLC)测定其滋味.结果显示:GC-MS测得实验组的醛类总的相对百分含量为65.63％,比对照组高出20.44％,使猪肉具有明显的清香、果香和油脂香气味;电子舌与HPLC测定出实验组鲜味氨基酸和甜味氨基酸的质量分数为38.39％和27.04％,比对照组高5.76％和1.8％,味道阀值比对照组高2.09和0.45,实验组苦味氨基酸比对照组少3.05％,味道阀值相差较小.本研究表明金枪鱼碎肉酶解液喂养巴马香猪对肉质的风味和滋味有很好的改善作用,能明显的增加肉的鲜味和甜味.%The effects of Parmesan pork flavor and taste were studied by feeding tuna meat as an additive.The taste of Bamaxiang pork was determined by Electronic Nose and Gas chromatography-mass Spectrometry (GC-MS).The taste was determined by Electronic Tongue and High Performance Liquid Chromatography (HPLC).The results showed that could distinguish the difference of volatiles;The total relative content of Aldehydes in the experimental group was 65.63％ by the GC-MS,with 20.45 ％ higher than that of control group,so that the pork had a clear fragrance,fruity and fat incense;Compared with the control group,the mass fraction of amino acids and sweet amino acids were 38.39％ and 27.04％ by using the Electronic tongue and HPLC,respectively,were higher 5.76％ and 1.8％,and taste threshold higher 2.09 and 0.45,the bitterness amino acid was less3.05％,Taste threshold gap is not obvious.In a conclusion,tuna meat lysis feeded Bama pig had a good effect on meat flavor and taste,and it could significantly increase the meat flavor and sweetness.【期刊名称】《食品工业科技》【年(卷),期】2018(039)003【总页数】6页(P259-264)【关键词】金枪鱼碎肉酶解液;巴马香猪肉;风味和滋味;电子鼻和电子舌;气质和液相色谱【作者】乙丛敏;苏秀榕;陈义芳;王求娟;袁剑;杨茗媛;申慧婷;耿灵鑫;王小凤;张凌芷;芦晨阳;周君;李晔【作者单位】宁波大学海洋学院,浙江宁波315211;宁波大学海洋学院,浙江宁波315211;宁波今日食品有限公司,浙江宁波315211;宁波今日食品有限公司,浙江宁波315211;宁波今日食品有限公司,浙江宁波315211;宁波大学海洋学院,浙江宁波315211;宁波大学海洋学院,浙江宁波315211;宁波大学海洋学院,浙江宁波315211;宁波大学海洋学院,浙江宁波315211;宁波大学海洋学院,浙江宁波315211;宁波大学海洋学院,浙江宁波315211;宁波大学海洋学院,浙江宁波315211;宁波大学海洋学院,浙江宁波315211【正文语种】中文【中图分类】TS207.3巴马香猪产于广西巴马瑶族自治县境内,外貌清秀,个体短、圆、矮、小,性野早熟。
金枪鱼(Katsuwonus pelamis)碎肉蛋白降压肽的酶解制备及活性研究张朋;贺卯苏;迟长凤;王斌【期刊名称】《海洋与湖沼》【年(卷),期】2014(045)005【摘要】以血管紧张素转换酶(ACE)抑制率为指标,通过正交试验L9(34)确定碱性蛋白酶(Alcalase)对金枪鱼(Katsuwonus pelamis)碎肉蛋白的最佳酶解条件,利用D101大孔树脂建立了酶解物的脱盐工艺,利用超滤、葡聚糖凝胶(G-25)色谱和反相-高效液相色谱(RP-HPLC)分离降压肽,并确定其纯度,利用氨基酸序列分析和ESI-MS鉴定纯化多肽的结构.结果表明,碱性蛋白酶酶解金枪鱼碎肉蛋白制备降压肽的最佳酶解条件是:pH 9.5,酶用量1.5％,酶解温度50℃,酶解时间5h; D101大孔吸附树脂脱盐工艺条件为:上样浓度10 mg/mL、上样流速1.5 BV/h、解吸剂为75％乙醇;酶解物经超滤和Sephadex G-25分离获得一个纯度较高的四肽,经氨基酸序列分析和ESI-MS鉴定结构为Phe-Gly-Gly-Val (FGGV),ESI-MS检测给出分子离子峰m/z 379.50([M+H]+).利用碱性蛋白酶酶解并经超滤和色谱技术制备的金枪鱼碎肉蛋白降压肽具有良好的ACE抑制活性,可作为降压药物、保健食品或添加剂进行开发.【总页数】7页(P1092-1098)【作者】张朋;贺卯苏;迟长凤;王斌【作者单位】浙江海洋学院海洋科学与技术学院国家海洋设施养殖工程技术研究中心舟山 316022;浙江海洋学院海洋科学与技术学院国家海洋设施养殖工程技术研究中心舟山 316022;浙江海洋学院海洋科学与技术学院国家海洋设施养殖工程技术研究中心舟山 316022;浙江海洋学院食品与医药学院浙江省海洋生物医用制品重点工程技术研究中心舟山 316022【正文语种】中文【中图分类】Q516【相关文献】1.金枪鱼碎肉蛋白的酶解工艺研究 [J], 王芳;杜帅;罗红宇2.金枪鱼碎肉酶解液对巴马香猪肉风味和滋味的作用 [J], 乙丛敏;苏秀榕;陈义芳;王求娟;袁剑;杨茗媛;申慧婷;耿灵鑫;王小凤;张凌芷;芦晨阳;周君;李晔3.鲣鱼(Katsuwonus pelamis)肌肉蛋白在热处理过程中的营养变化及功能性评价[J], 李海波;杨雪;白冬;王欢;关丽萍;谢超4.深海鲣鱼(Katsuwonus pelamis)眼窝油中DHA和EPA的提取及其抗抑郁活性研究 [J], 李海波;吕倩倩;白冬;王欢;关丽萍;谢超5.双酶分步水解金枪鱼(Eleotridae)碎肉制备高F值酶解液的工艺研究 [J], 罗红宇;杜帅;郑斌;宋茹;杨会成因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
第45卷 第5期 海 洋 与 湖 沼Vol.45, No.5 2014年9月OCEANOLOGIA ET LIMNOLOGIA SINICASep., 2014*浙江省重大科技专项, 2009C03017-2号; 国家星火计划项目, 2010GA700088号。
张朋, E-mail: 978526461@ ① 通讯作者: 迟长凤, 博士, 副教授, E-mail: amyccf@ 收稿日期: 2014-04-22, 收修改稿日期: 2014-07-27金枪鱼(Katsuwonus pelamis )碎肉蛋白降压肽的酶解制备及活性研究*张 朋1 贺卯苏1 迟长凤1①王 斌2(1. 浙江海洋学院海洋科学与技术学院 国家海洋设施养殖工程技术研究中心 舟山 316022; 2. 浙江海洋学院食品与医药学院 浙江省海洋生物医用制品重点工程技术研究中心 舟山 316022)提要 以血管紧张素转换酶(ACE)抑制率为指标, 通过正交试验L 9(34)确定碱性蛋白酶(Alcalase)对金枪鱼(Katsuwonus pelamis )碎肉蛋白的最佳酶解条件, 利用D101大孔树脂建立了酶解物的脱盐工艺, 利用超滤、葡聚糖凝胶(G-25)色谱和反相-高效液相色谱(RP-HPLC)分离降压肽, 并确定其纯度, 利用氨基酸序列分析和ESI-MS 鉴定纯化多肽的结构。
结果表明, 碱性蛋白酶酶解金枪鱼碎肉蛋白制备降压肽的最佳酶解条件是: pH 9.5, 酶用量1.5%, 酶解温度50°C, 酶解时间5h; D101大孔吸附树脂脱盐工艺条件为: 上样浓度10 mg/mL 、上样流速1.5 BV/h 、解吸剂为75%乙醇; 酶解物经超滤和Sephadex G-25分离获得一个纯度较高的四肽, 经氨基酸序列分析和ESI-MS 鉴定结构为Phe-Gly- Gly-Val (FGGV), ESI-MS 检测给出分子离子峰m/z 379.50 ([M+H]+)。
利用碱性蛋白酶酶解并经超滤和色谱技术制备的金枪鱼碎肉蛋白降压肽具有良好的ACE 抑制活性, 可作为降压药物、保健食品或添加剂进行开发。
关键词 金枪鱼碎肉; 降压肽; 碱性蛋白酶; 大孔树脂; 血管紧张素转换酶(ACE) 中图分类号 Q516 doi: 10.11693/hyhz20140600188 血管紧张素转换酶(ACE)是一种分子量为15kDa 膜结合糖蛋白, 当人体循环或者局部组织中ACE 活性过高, 会促使血管紧张素I (十肽, 由肾素转化而来)的肽链C 末端的组氨酸和亮氨酸残基水解形成具有增压作用的血管紧张素II (八肽), 同时促进具有促血管舒张作用的缓激肽P 物质的水解, 导致血压升高。
因此, 寻找合适物质, 抑制体内ACE 的活性, 即可达到降低血压的目的。
目前, 血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)是一类发展迅速的抗高血压药物, 如含巯基(–SH)或硫基(–SR)类的卡托普利(Captopril), 含羧基(–COOH)类的依那普利(Enalapril), 以及含次膦酸基(–POO–)类的福辛普利(Fosinopril)等。
此类化学合成药物在应用过程中常引起患者咳嗽、味觉异常、粒细胞减少、皮疹、发热等不良反应, 给患者带来较强的不适感。
与化学合成的ACEI 相比较, 通过酶解食源性蛋白质获得的ACE 抑制活性肽(ACEP)具有显著优点, 主要体现在: (1) 安全性高, 无毒副作用; (2) 原料来源广, 制备条件温和, 易于产业化; (3) 降压效果专一, 易于消化吸收。
因此, 选择合适的蛋白酶在体外降解蛋白资源, 研究和开发出具有降血压作用的活性肽食品或药物, 成为研究的热点(Liu et al , 2013)。
目前, 已经成功地从多种水产资源中获得了ACEP 。
如徐怀德等(2008)利用碱性蛋白酶水解甲鱼蛋白获得具有ACE 抑制作用的酶解物, 其对ACE 的体外抑制率为99.96%。
于娅等(2004)以牡蛎为原料制备的短肽在0.4 mg/mL 时的ACE 抑制率为51.4%。
戴志远等(2009)利用酶解和Sephadex G-50柱层析从河蚌酶解物中得到2个分子质量分别为14.1 (MPP1)和12.7 kDa (MPP2)的组分, 其对ACE 抑制作用的IC 50分别为0.88和0.32 mg/mL 。
Fujita 等(1999)利用5期张朋等: 金枪鱼(Katsuwonus pelamis)碎肉蛋白降压肽的酶解制备及活性研究 1093嗜热菌蛋白酶水解鲤鱼得到6种降压肽, 分别为IY、IKP、LKP、IWH、LKPNM和IWHHT, 均能明显降低原发性高血压大鼠的血压, ACE抑制活性的IC50值分别为2.31、6.9、0.32、3.5、2.4和5.8μmol/L。
Enari 等(2008)酶解鲑鱼蛋白获得降压肽IW, ACE抑制活性检测显示其IC50值为1.2μmol/L。
Jae等(2004)利用胃蛋白酶酶解鳕鱼蛋白, 利用色谱技术制备降压肽FGASTRGA, ACE抑制活性检测显示其IC50值为14.7μmol/L。
Liu等(2013)利用胃蛋白酶和木瓜蛋白酶水解水母蛋白, 利用色谱技术制备降压肽QPGPT和GDIGY, ACE抑制活性检测显示其IC50值分别为80.67和32.56μmol/L。
Lee等(2014)利用胰蛋白酶酶解, 色谱制备, 从大马哈鱼鱼皮酶解物中制备降压肽GLPLNLP, ACE抑制活性检测显示其IC50值为18.7μmol/L。
金枪鱼(Katsuwonus pelamis)是世界远洋渔业的重要作业鱼种之一, 年产量超过600万吨, 占公海渔业总产量70%以上(罗红宇等, 2013; Shyni et al, 2014)。
在金枪鱼加工过程中产生的碎肉、鱼头、鱼皮和鱼骨等下脚料约占总重量的50%—70%。
研究发现金枪鱼碎肉中粗蛋白含量很高, 是良好的蛋白质来源(杜帅等, 2013; 谭洪亮等, 2014)。
然而, 我国金枪鱼下脚料的加工利用不尽如人意, 90%以上仍然作为饲料原料或初级饲料利用, 造成了金枪鱼资源的大量浪费, 也给生态环境带来了较大压力(杜帅等, 2013)。
因此, 高效的利用金枪鱼下脚料资源具有重要的意义。
因此, 本实验以金枪鱼碎肉蛋白为原料进行ACEP的研发, 不仅会为高血压疾病的治疗提供候选药物, 还将为金枪鱼下脚料的综合利用提供一条可行的途径。
1材料与方法1.1样品、试剂与仪器金枪鱼(Katsuwonus pelamis)碎肉由宁波丰盛食品有限公司提供。
Sephadex G-25购于安发玛西亚生物技术公司, 碱性蛋白酶购于上海源聚生物科技有限公司, 色谱纯乙腈购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司, 其他试剂为分析纯, 购于上海国药集团化学试剂有限公司。
Agilent 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司); U-2800紫外可见分光光度计(日本日立集团); Anke TDL-40B离心机(上海安亭科技仪器厂); HD 21C-A 核酸蛋白检测仪(上海康华生化仪器制造有限公司); DS-1高速组织捣碎机(上海精密仪器仪表有限公司); SC-15超级恒温槽(宁波江南仪器厂)。
1.2实验方法1.2.1金枪鱼碎肉酶解物的制备称取金枪鱼碎肉100g, 加入pH 10.0的甘氨酸 –NaOH缓冲液500 mL,于组织捣碎机内均质5 min, 用1mol/L HCl和NaOH将该混和物调pH至设定数值, 得混和液。
将混合液温度升至预定温度搅拌预热, 并于搅拌状态下保温20 min; 然后加入预定量的碱性蛋白酶(酶活力≥1.9×104 U/g), 在设定的时间下完成酶解之后, 放入95—100°C水浴15 min, 对酶灭活, 灭活液在4°C、4500 r/min离心30 min, 取上清液真空浓缩后冷冻干燥, 得酶解物(TPAP), 并于–20°C低温保存。
根据正交试验确定碱性蛋白酶水解金枪鱼碎肉蛋白的工艺条件。
L9(34)正交试验设计因素和水平见表1。
表1 正交实验中酶解条件的因素水平表Tab.1 The factors and levels of enzymatic hydrolysisconditions因素水平A pHB 酶用量(%)C 温度(°C)D时间(h)1 9 1.0 45 42 9.5 1.2 50 53 10 1.5 55 6 1.2.2 D101大孔吸附树脂对金枪鱼碎肉蛋白酶解物的脱盐工艺研究(1) D101大孔吸附树脂对TPAP的静态吸附及解析实验取 2.5 g预先处理的D101大孔树脂加入到250 mL具塞锥形瓶中, 用无水乙醇充分溶胀树脂,去离子水洗净无水乙醇, 再加入质量浓度为10 mg/mL的TPAP溶液150mL, 将锥形瓶放入25°C恒温摇床振荡12 h, 按照设定时间取样。
选择水、30%乙醇、50%乙醇、75%乙醇和无水乙醇作为洗脱剂, 对已吸附TPAP并达到饱和的D101大孔树脂解吸24 h, 洗脱, 按下式计算树脂的吸附率、吸附量和解吸率。
吸附率(%) = [(原液浓度–吸附液浓度)/原液浓度]×100吸附量(mg/g) = (原液浓度–吸附液浓度)×溶液体积/干树脂质量解吸率(%) = {(解吸液浓度×解吸液体积)/[(原液浓度–吸附液浓度)×吸附液体积]}×100(2) D101大孔吸附树脂对TPAP的动态吸附及解吸实验在室温条件下, ①质量浓度为10 mg/mL1094 海洋与湖沼45卷的TPAP分别以0.8 BV/h、1.5 BV/h、3 BV/h的流速经过层析柱; ②质量浓度为 5 mg/mL、10 mg/mL和20 mg/mL的TPAP分别以1.5 BV/h的流速经过层析柱, 用紫外检测流出液的A220, 以A220 = 0.05为透过点, 比较不同流速和浓度的穿透体积和吸附量。
1.2.3超滤分级TPAP用截留分子量为3 kDa和1 kDa的超滤膜超滤分级, 得三个组分: TPAP-I (MW > 3kDa)、TPAP-II (3kDa > MW >1kDa)和TPAP-III (MW < 1 kDa)。
1.2.4 Sephadex G-25凝胶过滤层析取500.0 mg 的TPAP-III溶于5 mL双蒸水中, 加入到预先平衡的Sephadex G-25凝胶柱(2.6×80cm)上, 用蒸馏水以1 mL/min的速度洗脱, 每5 min收集一管, 并于220 nm 检测吸光度, 按峰合并, 得5个组分(TPAP-III-1—5)。
