western的操作步骤

Western-Blot 操作流程（一）组织中总蛋白的提取用干净的剪刀剪取绿豆大小的组织块于1.5ml的EP管中，加入200uLRIPA裂解液(含PMSF，比例为97：1：1：1)，用杵子研磨3-4min,段事先在酒精里浸泡至少30min，用之前用滤纸吸干酒精，）20-30s,每隔5min后在 4℃下12000rpm 离心 5min，取上清分装于 1.5mlEP管中并置于-80℃冰箱保存。

（二）BCA法蛋白含量的测定(1) 从-20℃取出 1mg/ml BSA，室温融化后，备用。

(3)以上步骤完成后，在所有加样的孔里各加上200uLBCA蛋白浓度测定试剂（按试剂A：试剂B=50：1的比例配置），然后置于37℃水浴锅30min后取出。

(4)酶标仪测定OD值。

(5)EXCEL表格制作标准曲线，按照标准曲线计算各样本的蛋白浓度。

（三）稀释蛋白及蛋白变性如果计算出的样本的蛋白浓度偏高，需要用RIPA裂解液将蛋白稀释（一般将蛋白浓度稀释至5-10ug/uL）;稀释完后取10-30uL的样本蛋白置于新的1.5mLEP管中，加入新EP管中总体积1/4体积的上样缓冲液，置于99-100℃的干式恒温器中加热5-10min,使蛋白变性。

（注意：将EP管的盖子盖紧，插入加热器的大圆孔中）煮过的蛋白置于-20℃冰箱保存。

（四）制作SDS电泳胶⑴清洗玻璃板，双蒸水冲洗晾干后，根据厂家说明安装玻璃板。

⑵配置10%的分离胶配方：H2O2 4.0ml30%丙烯酰胺液 3.3ml1.5mol/l Tris （ PH8.8）2.5ml10%SDS 100ul10%过硫酸胺 100ulTEMED 4ul⑶分离胶溶液中加入 TEMED 以及 10%过硫酸胺后需立即混匀（防止未灌胶就发生凝固），将混合液立即加入玻璃板内，距梳子下缘约 lcm 处即可，蒸馏水封顶，待凝胶完全聚合（约30min）后，倒去双蒸水。

⑷制备5%的浓缩胶配方；H2O2 3.4ml30%丙烯酰胺液 0.83ml1.5mol/l Tris （ PH6.8） 0.63ml10%SDS 50ul10%过硫酸胺 50ulTEMED 5ul(5)将所剩余空间加满浓缩胶，迅速将梳子插入浓缩胶中，室温放置约10min，待浓缩胶凝固后，轻轻将梳子拔出。

Western blot实验步骤一、制备蛋白样品（单层贴壁细胞总蛋白提取）1.倒掉细胞培养液,加3ml预冷的PBS洗涤细胞，重复两次，弃掉PBS后将细胞培养瓶置于冰上。

2.裂解液RIPA(强)1ml +PMSF10ul(100:1),两者混匀后加入培养瓶中裂解细胞，冰上裂解30min,为使细胞充分裂解,培养瓶要经常来回摇动。

3.裂解完后，用细胞刮将细胞刮于一侧（动作要快），转移至ep管中.4.4度，12000rpm,离心5min.离心后取上清至新的ep管中，用于后续实验（-80保存）常用蛋白收样：倒掉细胞培养基后，预冷PBS洗涤细胞2次，弃去，再加入1ml PBS，用细胞刮轻轻刮取细胞，转移至1.5ml ep管中，12000rpm，离心5min，尽量吸净上清，沉淀于-80保存，用于后续实验。

融化蛋白样品，加入RIPA+PMSF细胞裂解液（200ul/ep管），充分混匀，冰上裂解20min，4度离心，5min ，12000rpm，小心吸取上清至新的ep管中。

二、蛋白浓度测定(BCA法)BCA(碧云天)蛋白浓度测定试剂盒灵敏度高，检测浓度下限达到25ug/ml，最小检测蛋白量达到0.5ug，待测样品体积为1-20ul。

在50-2000ug/ml浓度范围内有较好的线性关系。

标准蛋白BSA浓度：5mg/ml (-20保存) ,完全溶解蛋白标准品，取10ul稀释至100ul，使终浓度为0.5mg/ml(ug/ul)。

蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。

但为了简便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。

1. 配置BCA工作液A液： B液= 50 : 1 ，混匀 A液+B液=200ul (每个样本)样本数量： 7个标准品 + N 个待测蛋白样本2. 先将每孔加入200ul BCA工作液，再加入蛋白样本。

（96孔板）,总体积为10ul.待测蛋白样本先10倍稀释。

3.37度，温箱中孵育30min。

Western Blot 实验基本步骤一、原理Western blotting（免疫印迹）是在蛋白质电泳分离和抗原抗体检测的基础上发展起来一项检测蛋白质的技术。

它将SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨力与抗原抗体反应的特异性相结合。

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应飞抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体其反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。

既可以定性，又可以半定量的Western是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。

典型的印迹实验包括三个步骤：①蛋白质的电泳分离②将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性，非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域③免疫学检测。

免疫印迹克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分析的弊端，极大地提高了其利用率、分辨率和灵敏度，使其成为使用最广泛的免疫化学方法之一。

第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。

抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰酰凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。

此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。

第二阶段为电转移。

将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（1～2A），通电45min转移即可完成。

此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。

第三阶段为酶免疫定位。

将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。

阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。

western显色的方法主要有以下几种：i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECLiii. 底物荧光ECFiv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。

WesternBlot操作流程Western Blot操作流程本⼈将⾃⼰做WB实验时的具体操作流程，做了详细的记录并整理。

因为每个实验室的条件不⼀样，所以本流程仅供参考，具体适合⾃⼰的实验操作需要⼤家摸索。

由于知识量有限，有些描述⽤词并不专业，请⼤家谅解。

⼀、流程图制胶→→电泳跑胶(1.5-2.5h)→→转膜（3h）→→（可使⽤⽴春红检测是否蛋⽩是否成功转移）TBST清洗（10min）→→封闭（2h）→→TBST清洗（10min）→→附Ⅰ抗（内参：⼩⿏抗β-Actin，先摇床轻摇30min，再放冰箱4度过夜）→→TBST 清洗三次（10min/次）→→附Ⅱ抗（内参：⼭⽺抗⼩⿏，轻摇1.5h）→→TBST清洗三次（10min/次）→→显影⼆、物料及配制1、电泳液：⼀包电泳粉+1000ml双蒸⽔（可回收使⽤）2、10%过硫酸铵：1g过硫酸铵+10ml双蒸⽔3、转膜液：⼀包转膜粉+800ml双蒸⽔+200ml甲醇（可回收使⽤）4、TBST溶液：50ml 20*TBS+950ml双蒸⽔+1ml吐温20。

（⽆需回收）5、封闭液：购买6、Ⅰ抗（内参）：将⼩⿏抗β-Actin：Ⅰ稀释液按1:500稀释待⽤，4度保存。

Ⅰ抗（⽬的蛋⽩58kDa）：将smad2：Ⅰ稀释液按1:1000稀释待⽤，4度保存。

7、Ⅱ抗（内参）：将⼭⽺抗⼩⿏：Ⅱ抗稀释液按1:5000稀释代⽤，4度保存。

Ⅱ抗（⽬的蛋⽩58kDa）：将⼭⽺抗兔：Ⅱ抗稀释液按1:5000稀释待⽤，4度保存。

7、显影液：按说明书配制，避光可长期回收使⽤8、定影液：按说明书配制，可长期回收使⽤9、发光液：超敏发光液A液：B液=1:1三、步骤（⼀）制胶1、Tris-⽢氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液的配制2、Tris-⽢氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳5%积层胶所⽤溶液3、1）将规格1.0mm或其它规格的玻璃板固定好。

2）依次将所需试剂加⼊烧杯中，加⼊TEMED之后，混匀，⽤1000ml的移液枪沿玻璃板缝左右两边的⾓交替加⼊分离胶溶液，也可从左到右连续加⼊（⽬的：两种⽅法都可以使液⾯快速达到⽔平状态）。

western蛋白提取步骤•相关推荐western蛋白提取步骤蛋白提取方法一、对于培养细胞样品：1. 融解Western及IP细胞裂解液，混匀。

取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。

2. 对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗)。

按照6孔板每孔加入100-200微升（6cm培养皿200-300ul）裂解液的比例加入裂解液。

用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。

通常裂解液接触细胞1-2 秒后，细胞就会被裂解。

对于悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。

按照6孔板每孔细胞加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。

再用手指轻弹以充分裂解细胞。

充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。

如果细胞量较多，必需分装成50-100万细胞/管，然后再裂解。

大团的细胞较难裂解充分，而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触，相对比较容易裂解充分。

3. 在冰上充分裂解20-30min后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

裂解液用量说明：通常6孔板每孔细胞加入100微升裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到150微升或200微升。

二、对于组织样品：1. 把组织剪切成细小的碎片。

2. 融解Western及IP细胞裂解液，混匀。

取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的`最终浓度为1mM。

3. 按照每20毫克组织加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。

(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。

)4. 用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。

5. 充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

Western blotting步骤一：配胶用具：玻璃板（厚板和薄板），海绵垫，梳子，移液枪（1000ul、200ul、20ul等）。

试剂：分离胶成分10%（水、Tris8.8、40%丙烯酰胺、10%APS、TEMED），浓缩胶5%（水，Tris6.8、40%丙烯酰胺、10%APS、TEMED），压线液异丙醇。

过程：1.配制40%的丙烯酰胺溶液，放4℃保存，配制10%APS溶液（0.1g/ml)，备用2.用一蒸水清洗玻璃板，海绵垫和梳子用自来水冲洗，必须冲洗干净，放入烘箱中烘干。

3.组装玻璃板，放入架子中夹紧，注意板一定要平齐后再放入，将各个量程的移液枪调至所需的量程，先配分离胶，加入各组分至50ml离心管中（最后加TEMED），充分混匀后，立即加入板中，注意沿着玻璃板壁加入，加至液面与板子凹槽平齐，立即加入0.5ml 高度的压线液异丙醇赶走气泡，并及时清洗配胶用的管子以防凝固，30min后待出现折光线即可倾倒去除异丙醇，用吸水纸将残留液体吸净，再配浓缩胶。

4.浓缩胶配制类似分离胶，配好后加入到玻璃板中，至顶部加满即可，插入梳子，及时洗配液管，待凝固后拆板，用双蒸水浸泡，现用或放入4℃冰箱中存放平衡，待第二天取用。

注意：APS，为白色粉末，常温保存，10%APS存于-20℃冰箱配置时提前半小时取出放置室温预热。

TEMED需4℃保存丙烯酰胺粉末，常温保存即可，而40%的丙烯酰胺溶液则需4℃避光保存步骤二、电泳用具：移液枪（20ul，100ul)，上样枪头试剂：marker，蛋白样品（已加上样缓冲液和100℃，5min加热处理）准备工作：配制10*电泳液保存，电泳时稀释成1*的电泳液1L现用过程：将玻璃板装入电泳架中，放入电泳槽中，垂直拔出梳子，先在两板内侧加满电泳液，外侧加一些，不得影响上样，吹打胶丝，去除样品孔中的气泡，上样20ul每孔，左端和右端不加样组分别加多（5ul）和少（2.5ul）的marker，枪头可以看出界线，主要是使marker 的量不一样，右端的多颜色深，左端的量少颜色浅，能区分左和右。

western-blot实验操作步骤Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。

可按照以下步骤操作。

1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)使用细胞裂解液，对贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品进行裂解。

然后测定每个蛋白样品的蛋白浓度。

2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶（分离胶及浓缩胶）可以参考一些文献资料进行配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

使用5X的SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。

5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制， 100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。

(3) 上样与电泳（1）冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。

为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准。

（2）电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。

对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。

（3）为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为90－120分钟。

设置定时可以避免经常发生的电泳过头。

通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。

3. 转膜(Transfer)（1）我们推荐在Western实验中选用PVDF膜。

硝酸纤维素膜(NC膜)也可以使用，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。

随着生物学领域的不断发展，Western blot（蛋白质印迹）实验技术已成为研究蛋白质表达和相互作用的重要手段。

本文将为大家提供一份Western blot实验技术全攻略，附详细操作步骤，希望对大家的科研工作有所帮助。

Western blot实验技术全攻略第一步：制备样品Western blot实验需要使用蛋白质样品，因此首先需要制备样品。

一般来说，可以从细胞、组织或生物液中提取蛋白质。

提取蛋白质的方法有很多种，例如细胞裂解、超声波破碎、切片法等。

提取后的样品需要通过蛋白质定量方法确定蛋白质的浓度。

第二步：电泳分离蛋白质将制备好的样品经过蛋白质电泳分离，将蛋白质分离成不同的带状条带。

电泳分离可以采用SDS-PAGE或非变性PAGE方法。

SDS-PAGE适用于大多数蛋白质，这种方法可以将蛋白质分离成不同的分子量带状条带。

非变性PAGE则适用于大分子蛋白质和蛋白质复合物的分离。

第三步：转移蛋白质将分离好的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜（PVDF）或硝酸纤维素膜（NC）上。

转移蛋白质可以采用湿式电转移或半干式电转移方法。

湿式电转移适用于小分子蛋白质的转移，而半干式电转移则适用于大分子蛋白质的转移。

第四步：阻断和孵育将转移膜放入含有牛血清白蛋白（BSA）或非脂类干奶粉的TBST中，进行阻断。

然后将膜孵育于含有一定浓度的一抗体的TBST中，以便与目标蛋白结合。

第五步：检测和成像将膜孵育于含有适量的二抗体的TBST中，以便与一抗体结合。

二抗体通常被标记为辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）。

在使用HRP的情况下，将膜浸泡在ECL底物中，然后用射线或荧光成像系统观察蛋白质的信号。

在使用AP的情况下，将膜浸泡在BCIP 和NBT底物中，然后用射线或荧光成像系统观察蛋白质的信号。

下面是Western blot实验的详细操作步骤：1. 蛋白质提取：将待测样品（如细胞、组织等）进行裂解，以获得蛋白质样品。

2. SDS-PAGE电泳：将蛋白质样品进行电泳分离，以分离不同大小的蛋白质。

western blotting的基本操作过程Western blotting是一种常用的分子生物学技术，在蛋白质分析中具有重要的应用。

它可以用于检测、分析、定量和分离蛋白质分子，并广泛应用于生物医学、病理学、免疫学、遗传学等领域。

本文将介绍Western blotting的基本操作过程，以帮助读者了解和掌握Western blotting技术的实验操作。

一、材料准备在进行Western blotting之前，必须准备好所有需要的材料和试剂。

首先需要制备胶液和凝胶，包括聚丙烯酰胺凝胶、缓冲液、Tris-HCl缓冲液、SDS-PAGE凝胶、封盘液、扩增液等。

此外，还需要准备电泳装置、电源、电极、磁力搅拌器、主机等实验设备。

此外，还需要准备细胞或组织样本，并提取蛋白质。

提取蛋白质的方法有很多，目前常用的包括酚/氯仿法、三氯乙酸法、离子交换柱法、氨基酸顺序法等。

二、电泳分离Western blotting是基于电泳的分析方法，因此第一步是将提取的蛋白质进行电泳分离。

在分离之前，必须将样品加入载体缓冲液，以确保其稳定性和一致性。

将样品加入凝胶槽中，用电泳装置进行电泳分离。

在电泳期间，缓冲液通过电解质稀释样品。

当电流通过凝胶时，带电粒子会在电场中移动，分离出不同的组分，最后嵌入凝胶中。

分离后的蛋白质按照其分子量大小排列，从而形成一条蛋白质带。

三、转膜将蛋白质分离带从聚丙烯酰胺凝胶中转移到聚氟乙烯膜上，这个步骤称为转膜。

转膜要求将聚氟乙烯膜浸泡在沉淀剂中，使其吸水并增加其静电位，然后放置在集装箱中。

加入转移缓冲液、荷载样品和过硫酸铵，启动转移。

转膜电源把电流传递到电极板上，导致电子从内极板流向外极板。

这个过程产生的电流足以推动带电粒子（即蛋白质）从凝胶中转移到聚氟乙烯膜上。

由于膜具有不吸水的特性，其吸附的蛋白质能够保持原来的位置和形式。

借助荧光染料可以对蛋白质进行原位成像，并进一步进行分析。

四、免疫分析Western blotting的第四个步骤是免疫分析。

简述western印迹的基本过程Western印迹是一种常用的分子生物学技术，它可以检测蛋白质的存在、分子量和相对丰度。

Western印迹技术主要包括以下几个步骤：样品制备、电泳分离、转膜、阻断、一抗和二抗探针探测等。

一、样品制备Western印迹技术需要使用样品来进行分析，通常我们需要从细胞或组织中提取蛋白质。

提取方法可以根据不同的实验目的进行选择，例如RIPA缓冲液法、SDS-PAGE法等。

提取后的蛋白质需要经过浓缩和纯化处理，以便于后续的电泳分离。

二、电泳分离将制备好的样品通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。

根据蛋白质大小不同选择不同浓度的凝胶，通常使用10%或12%聚丙烯酰胺凝胶。

在电泳过程中，蛋白质会被拉伸成条状并向阳极移动。

三、转膜将电泳分离后的蛋白质转移到聚乙烯膜上。

转膜的目的是将凝胶上分离出来的蛋白质迁移到一个新的固体载体上，以便于后续的探测。

通常使用半湿式或干式转膜法。

四、阻断在转膜后，需要对聚乙烯膜进行阻断处理，以避免非特异性结合和减少假阳性结果。

通常使用5%的非脂类奶粉或3%的BSA进行阻断处理。

五、一抗在阻断处理后，加入第一抗体进行特异性结合。

第一抗体可以是单克隆或多克隆抗体，具有高度特异性和亲和力。

将第一抗体加入后，在室温下或4℃下孵育数小时甚至过夜。

六、二抗探针探测加入与第一抗体来源不同物种的二抗（例如羊或马）与荧光素等探针进行反应，通过荧光素发射信号检测目标蛋白质的存在、分子量和相对丰度。

Western印迹技术中最常用的二抗是HRP（辣根过氧化物酶）标记的二抗。

七、成像和分析Western印迹技术的结果可以通过化学发光、荧光或放射性等多种方法进行检测。

Western印迹技术的结果通常以数字图像的形式保存下来，可以使用专业软件进行分析和定量。

综上所述，Western印迹技术是一种常用的分子生物学技术，通过样品制备、电泳分离、转膜、阻断、一抗和二抗探针探测等步骤，可以检测蛋白质的存在、分子量和相对丰度。

Western Blot操作方法及步骤1).蛋白质提取Extraction buffer组成:蔗糖0.7 MTris/HCl0.5 MEDTA 50 mMKCl0.1 M配制成母液pH 9.4巯基乙醇2%蛋白酶抑制剂25×取100-200 mg植物叶片，用液氮速冻后用研磨仪打碎（若量比较大可用液氮研磨，分装到多管中），加入500 µl 提取缓冲液，涡旋；完全混匀后加入500 µl 苯酚（分层，取下层酚层）, 涡旋；在3000 g 的转速下离心10 min, 4 °C拿两只新的EP管，各取200 µl 离心后的上清液；向两只EP管中各加入1 ml 0.1M NH4Ac（用甲醇溶解配制）；在-20°C下沉淀放置至少2 h过夜放置；在13000 rpm转速下离心5 min，4 °C；用0.1 M NH4Ac（用甲醇溶解配制）洗涤，用枪头将蛋白吹散，洗净杂质；在13000 rpm转速下离心5 min，4 °C；取上清后空甩EP管，去除多余的溶液；室温干燥蛋白, 用1% SDS（100ul左右）溶解蛋白。

2). 测定总蛋白浓度。

用BCA蛋白检测试剂盒测定提取物中的蛋白质含量(1)蛋白浓度测定1、考马斯亮蓝G250通过与蛋白质内的氨基和羧基基团间的静电结合作用以及范德华力，考马斯亮蓝与蛋白质形成强但非共价键连接的复合物。

蛋白-染料复合物的形成稳定染料携带的负电荷阴离子，从而产生在膜上或者胶上肉眼可见的蓝色①测定总蛋白浓度步骤：按照BCA试剂盒说明书进行操作1.配制标准曲线的标准样品--胎牛血清蛋白（BSA）浓度BSA原液浓度：5mg/ml②待测样品稀释用Nanophotometer（纳米光度计）初步测一下待测样品的浓度，计算好稀释的体积，使得终浓度在标准曲线区间内。

③加样准备测定标准样品和待测样品各准确吸取20μl溶液于酶标孔中，加入BCA工作液200μl。

Western Blotting （His-tag ）一、SDS-PAGE 电泳Sample 加入5×SDS Loading ，99℃、5分钟热处理，SDS －PAGE 电泳。

使用 Marker ：M1：Precidion Plus ProteinTM Dual Color Standards 5μl （Bio_Rad Catalog 161-0374） M2：Perfect ProteinTM Makers 10-225KDa 5μl （Novagen Catalog 69079）二、转膜（Blotting ）1、裁剪SDS －PAGE 胶，使所有样品、Marker 均包含在内，量取裁剪后胶的 长×宽，并裁剪相同尺寸的转膜滤纸12张，PVDF 膜1张；2、将PVDF 膜用甲醇浸泡10秒；3、将胶、转膜滤纸、PVDF 膜分别浸泡在如下图所示的相应转膜缓冲液中3~5分钟；4、依次按照下图所示的顺序在转膜仪的下表面叠放胶、转膜滤纸、PVDF 膜，用干净面巾纸拭干滤纸周围多余的液体，将转磨仪上表面安装好，轻轻下压上盖，使其与滤纸充分接触；5、按照胶尺寸1cm 2= 1mA 设定电流， 转膜120 min 。

三、封闭（Blockin ）1、配制Blockin 溶液，一般40ml 较合适（Blockin ：10ml 、一抗：14ml 、二抗：14ml ）；2、确认转移转膜后PVDF 膜上Marker-M1清晰，此时转膜成功；3、将转印后的PVDF 膜装入干净的水煮袋中，加入10ml 1.5%BSA/TBST ，尽量将气泡排干净，封口，用铝箔纸将水煮袋覆盖，RT 、摇动1hr 或4℃、O/N 封闭。

四、一抗1、取出封闭后的PVDF 膜，转入新的水煮袋中；A 液（负 极）（正极）C液B液胶PVDF膜2、加入14ml 1.5%BSA/TBST，按照1000：1的比例加入14μl一抗——Penta-HisAntibody, BSA free(QIAGEN Code.34660)，尽量将气泡排干净，封口，用铝箔纸将水煮袋覆盖，RT、摇动1hr进行反应。

Western Blotting 操作步骤Western Blotting 操作步骤一、Western Blotting 实验步骤概述1、组织取材：组织块称重2、利用液氮、研钵粉碎组织块3、加入RIPA缓冲液（每克组织3ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃4、加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟5、移入离心管4℃，约20,000g（约15,000转）15分钟6、上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存7、进行Bradford比色法测定蛋白质浓度8、取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液9、沸水浴中3分钟10上样11、电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA）12、电转膜仪转膜（100mA 40分钟）13、膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色14、Westernblot 试剂盒显色15、分析比较记录二、Western Blotting 具体实验步骤Western，也称Western blot、Western blotting、Western 印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。

Western可以参考如下步骤进行操作：1、收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。

对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提。

收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。

根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。

因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。

2、电泳(Electrophoresis)（1）、SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。

Western blotting试剂的配制①100mMPMSF：0.0174gPMSF 溶于1mL异丙醇中，-20°C保存。

注：PMSF 严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸和、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。

一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量水冲洗之。

PMSF在水溶液中不稳定，应在使用前从贮存液中现用现加入裂解缓冲液中。

② 1.5M Tris-base PH8.8：36.33gTris-base 溶于60mL双蒸水中，调PH为8.8，再加入双蒸水定容至200mL。

1.0M Tris-base PH6.8：24.22gTris-base 溶于60mL双蒸水中，调PH为6.8，再加入双蒸水定容至200mL。

③10%SDS：SDS 10g溶于60mL双蒸水中，68°C助溶，由于SDS溶解时会产生很多泡沫，定容时应先定容至95mL，等泡沫散去，再加入双蒸水定容至100mL。

④30%Acry/bis：29g丙烯酰胺，1g甲叉丙烯酰胺，双蒸水60mL，37°C助溶，然后定容至100mL，-4°C保存。

注：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。

称量丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺时应戴手套和口罩，配制该溶液时应在通风橱中进行，操作过程中应穿好实验服，注意防护。

⑤5×SDS凝胶上样缓冲液：1.25mL1MTris-base PH6.8，2.5mL丙三醇，0.5g SDS，0.025g溴酚蓝，用双蒸水定容至5mL，1mL分装后，于室温保存，使用前每mL中加入50μLβ-巯基乙醇，加入β-巯基乙醇的上样缓冲液可在室温中保存一个月，使用时稀释为1×工作液。

⑥TBST缓冲液：2.42gTris-base，8.8gNacl，500μLTween-20，用双蒸水定容至1000mL，调PH为7.4。

⑦10%APS：0.1gAPS溶于1mL双蒸水中，4°C保存一星期有效，最好现配现用。