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酵母双杂交操作手册 by shenao Y2H所需材料:PJ69-4A PJ69-4α or AH109 Y187pGBKT7 DNA-BD Vector (bait)pGADT7 AD Vector (prey)pGBKT7-53 Control VectorpGBKT7-Lam Control VectorpGADT7-T Control VectorpCL1 Control Vector3' DNA-BD & AD Sequencing PrimersHerring testes carrier DNAYeast extract，Dextrose(glucose); SD base; DO Supplement; Peptone，with DMF) TE buffer DMSO PEG/LiAc (10X) TE/LiAc buffer (10X) X-a-gal(Yeast Phenotypes–––Ade, His, Leu, Requires adenine (Ade), histidine (His), leucine (Leu), or tryptophan (Trp) in the–or Trp medium to grow; is auxotrophic for at least one of these specific nutrients.Expresses the ADE2 reporter gene; i.e., does not require Ade in the medium to +Ade grow.+His Expresses the HIS3 reporter gene; i.e., does not require His in the medium to grow.+LacZ Expresses the lacZ reporter gene; i.e., is positive for b-galactosidase activity.+Mel1 Expresses the MEL1 reporter gene; i.e., is positive for a-galactosidase activity. MiscellaneousAde2p Protein encoded by the yeast ADE2 gene.3-AT 3-amino-1,2,4-triazole; a competitive inhibitor of the His3 protein.CHX CycloheximideDropout (supplement or solution); a mixture of specific amino acids and nucleosidesDO used to supplement SD base to make SD medium; DO solutions are missing one ormore of the nutrients required by untransformed yeast to grow on SD medium.His3p Protein encoded by the yeast HIS3gene.Minimal Synthetic Dropout medium; comprised of a nitrogen base, a carbon source SD medium (glucose or galactose), and a DO supplement.YPH Yeast Protocols HandbookSD/–Ade SD/–Met SD/–His SD/–Ura YPDA YPD/CHX SD/–Leu SD/–Trp StrainPJ69-4A – + – + + –––––– + + ––– PJ69-4α1SD/–Ade SD/–Met SD/–His SD/–Ura YPDA YPD/CHX SD/–Leu SD/–Trp StrainAH109 – + – + + –––––– + + ––– Y187Yeast selection Bacterial selection Fusion EpitopeCloning vectorspGBKT7 DNA/bait c-Myc TRP1 kanamycinpGADT7 AD/library HA LEU2 ampicillin Control vectorspCL1 GAL4 LEU2 ampicillinpGADT7-T AD/T-antigen HA LEU2 ampicillin pGBKT7-53 DNA-BD/p53 c-Myc TRP1 kanamycin pGBKT7-Lam DNA-BD/lamin C c-Myc TRP1 kanamycin .缩写:Ade腺嘌呤(adenine) His组氨酸(histidine) Leu亮氨酸(leucine) Trp色氨酸(tryptophan)培养基成分及配制方法:YPD & SD Base from CLONTECH already contains a carbonsource(Dextrose(glucose))YPD: 20g/L Peptone, 10g/L Yeast extract, 2% Dextrose(20g/L), 20 g/L Agar (for plates only) 加入上述药品，加水至1L，调节PH值到6.5。
目录(一介绍 4(二试剂盒物品清单 7(三额外附加物品列表 9(四酵母菌株 11(五酵母载体 14(六方法简述:单杂交文库的构建和筛选 16 方法简述:双杂交文库的构建和筛选17(七构建用于酵母单杂交的报告质粒载体 18(八构建用于酵母双杂交的 DNA-BD 融合载体 19(九构建生成 cDNA 文库 21(十构建和筛选酵母单杂交和双杂交文库(简述 27 (十一酵母单杂交文库的构建和筛选 28 (十二酵母双杂交文库的构建和筛选 30 方法 A:通过酵母配对(Yeast Mating来筛选目的蛋白 30 方法 B:通过共转化的方法筛选目的蛋白 35 (十三分析阳性相互作用结果 38 (十四问题解决指南 44 (十五参考文献 47 (十六相关产品 50 附录 A: 双链 cDNA合成的典型结果 51 附录 B: 酵母感受态的制备— LiAc 法 52 附录C :单杂交对照载体信息 53 附录 D :双杂对照载体信息 54 表格列表Table I. BD Matchmaker酵母菌株的基因型 11 Table II. BD Matchmaker酵母菌株的表型 11 Table III.单杂交系统的载体 14 Table IV. 双杂交系统的载体 15 Table V. 各 BD-Matchmaker DNA-BD 载体的比较 19 Table VI. RNA起始浓度和 PCR 扩增循环数之间的关系 24 Table VII.单杂交共转化的对照实验的设置 29 Table VIII.单杂共转化对照实验:期望的结果 29 Table IX. 双杂交转化的对照实验的设置 33 Table X. 双杂交配对筛选的对照实验的设置Table XI. 双杂交共转化的对照实验的设置Table XII. 双杂交共转化的对照实验:期望的结果Table XIII. 用于 PCR 筛选菌落的 Assembling Master Mixs图片列表Figure 1.使用 BD Matchmaker单杂交系统筛选蛋白 -DNA 相互作用 4 Figure 2.使用 BD Matchmaker单杂交系统筛选蛋白 -蛋白相互作用 4 Figure 3.酵母单杂交和双杂交筛选的大致步骤 5 Figure 4.构建和筛选 BD Matchmaker酵母单杂交和双杂交文库 6 Figure 5.酵母菌株 AH109和 Y187中的报告基因 12 Figure 6. BD Matchmaker 酵母单杂交文库的构建和筛选 16 Figure 7. BD Matchmaker酵母双杂交文库的构建和筛选 17 Figure 8.用 BD SMART技术合成高质量的 ds cDNA 21 Figure 9. BD CHROMA SPIN纯化柱和收集管 26 Figure 10.通过酵母重整合作用来构建 AD 融合文库 27 Figure 11.为双杂交筛选 AD 融合文库 32 Figure 12.分析和证明可能的单杂交和双杂交相互作用阳性结果的策略 39 Figure 13.通过酵母配对来验证蛋白 -蛋白相互作用 42 Figure 14.用对照用人胎盘 Poly A+ RNA合成双链 cDNA 51 Figure 15. p53HIS 对照载体的图谱 53 Figure 16. pGAD-Rec2-53 AD对照载体的图谱 53 Figure 17. pGADT7-RecT AD对照载体的图谱 54 Figure 18. pGBKT7-53 DNA-BD 对照载体图谱 54 Figure 19. pGBKT7-Lam DNA-BD 对照载体图谱 55(一介绍BD Matchmaker TM Library Construction & Screening 试剂盒提供一种简便的方法构建 cDNA 文库用来进行酵母双杂交和单杂交的筛选,这些试剂盒结合了 BD Matchmaker TM Systems 和 BD SMART TM cDNA Synthesis的技术,只需要用任何组织的1 μg poly A+ RNA 或 total RNA就能构建 cDNA 文库。
（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中）概念：1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。
优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。
2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。
优点：比次序转化更容易操作。
pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）？pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林) ？各种SD培养基：1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml) （？“四缺”）酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ;葡萄糖 20g (即2%)2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g. (即2%)3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”）酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）;葡萄糖 20g (即2%)4)SD/-leu (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)5)SD/-trp (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。
目录（一）介绍 4 （二）试剂盒物品清单 7 （三）额外附加物品列表9 （四）酵母菌株11 （五）酵母载体14 （六）方法简述：单杂交文库的构建和筛选16 方法简述：双杂交文库的构建和筛选17 （七）构建用于酵母单杂交的报告质粒载体18 （八）构建用于酵母双杂交的DNA-BD融合载体19 （九）构建生成cDNA文库21 （十）构建和筛选酵母单杂交和双杂交文库（简述）27 （十一）酵母单杂交文库的构建和筛选28 （十二）酵母双杂交文库的构建和筛选30 方法A:通过酵母配对（Yeast Mating）来筛选目的蛋白30方法B:通过共转化的方法筛选目的蛋白35 （十三）分析阳性相互作用结果38 （十四）问题解决指南44 （十五）参考文献47 （十六）相关产品50 附录A: 双链 cDNA合成的典型结果51 附录B: 酵母感受态的制备—LiAc 法52 附录C：单杂交对照载体信息53 附录D：双杂对照载体信息54 表格列表Table I． BD Matchmaker酵母菌株的基因型11 Table II． BD Matchmaker酵母菌株的表型11 Table III．单杂交系统的载体14 Table IV．双杂交系统的载体15 Table V．各BD-Matchmaker DNA-BD 载体的比较19 Table VI． RNA起始浓度和PCR扩增循环数之间的关系24 Table VII．单杂交共转化的对照实验的设置29 Table VIII．单杂共转化对照实验：期望的结果29 Table IX．双杂交转化的对照实验的设置33 Table X．双杂交配对筛选的对照实验的设置Table XI．双杂交共转化的对照实验的设置Table XII．双杂交共转化的对照实验：期望的结果Table XIII．用于PCR筛选菌落的Assembling Master Mixs图片列表Figure 1．使用BD Matchmaker单杂交系统筛选蛋白-DNA相互作用 4 Figure 2．使用BD Matchmaker单杂交系统筛选蛋白-蛋白相互作用 4 Figure 3．酵母单杂交和双杂交筛选的大致步骤5 Figure 4．构建和筛选BD Matchmaker酵母单杂交和双杂交文库6 Figure 5．酵母菌株AH109和Y187中的报告基因12 Figure 6．BD Matchmaker酵母单杂交文库的构建和筛选16 Figure 7．BD Matchmaker酵母双杂交文库的构建和筛选17 Figure 8．用BD SMART技术合成高质量的ds cDNA 21 Figure 9．BD CHROMA SPIN纯化柱和收集管26 Figure 10．通过酵母重整合作用来构建AD融合文库27 Figure 11．为双杂交筛选AD融合文库32 Figure 12．分析和证明可能的单杂交和双杂交相互作用阳性结果的策略39 Figure 13．通过酵母配对来验证蛋白-蛋白相互作用42 Figure 14．用对照用人胎盘Poly A+ RNA合成双链cDNA 51 Figure 15．p53HIS对照载体的图谱53 Figure 16．pGAD-Rec2-53 AD对照载体的图谱53 Figure 17．pGADT7-RecT AD对照载体的图谱54 Figure 18．pGBKT7-53 DNA-BD 对照载体图谱54 Figure 19．pGBKT7-Lam DNA-BD 对照载体图谱55（一）介绍BD Matchmaker TM Library Construction & Screening试剂盒提供一种简便的方法构建cDNA文库用来进行酵母双杂交和单杂交的筛选，这些试剂盒结合了BD Matchmaker TM Systems和BD SMART TM cDNA Synthesis的技术，只需要用任何组织的1 μg poly A+ RNA 或total RNA就能构建cDNA文库。
（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中）概念：1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。
优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。
2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。
优点：比次序转化更容易操作。
pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林)各种SD培养基：1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（“四缺”）酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ;葡萄糖20g (即2%)2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g. (即2%)3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （“二缺”）酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）;葡萄糖 20g (即2%)4)SD/-leu (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)5)SD/-trp (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。
研究蛋白互作的方法蛋白互作的研究一直以来都受到重视，是研究细胞信号传导等非常重要的方面。
我就我现在做过的方法给大家介绍一下，抛砖引玉了，大家多补充纠正一下吧常用的体外互作研究方法：1、酵母双杂交（yeast two-hybrid,Y2h)酵母双杂交作为最经典的蛋白互作方法一直沿用至今，并且仍然保持着自己的优势。
酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。
酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。
优点在于:优点: ⑴作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。
⑵检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。
⑶检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。
⑷酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。
但是酵母双杂交有自己的缺点：⑴双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。
另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。
⑵酵母双杂交系统的一个重要的问题是"假阳性"。
由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。
另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生"假阳性"结果。
“假阳性”对策：即使根据严格的对照实验证明确实发生了蛋白间的相互作用，还应对以下方面进行分析：(1)这种相互作用是否会在细胞内自然发生,即这一对蛋白在细胞的正常生命活动中是否会在同一时间表达且定位在同一区域。
（完整版）酵母双杂交原理酵母双杂交系统原理酵母双杂交系统(Yeast Two-hybrid System)由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。
典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA 结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。
前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。
二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。
而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。
酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。
主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。
上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。
融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。
例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)，而GAL4-ad没有。
因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。
双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。
报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。
最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。
〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。
〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。
一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA －结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。
酵母双杂交检测（Yeast Two酵母双杂交检测（Yeast Two-Hybrid Assay）产品专题检测原理：酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid assay）是⽤于体内研究蛋⽩相互作⽤的⼀种⾮常便利的⼯具，常⽤的如GAL4为基础的系统，使⽤酵母转录因⼦GAL4来检测转录激活后的蛋⽩相互作⽤。
某些转录因⼦（如GAL4）由两个可以分开，功能上相互独⽴的结构域组成，N端有⼀个147个氨基酸组成的DNA结合域（DNA binding domain，BD），C端有⼀个由113个氨基酸组成的转录激活域（transcription activation domain，AD）。
BD可以和上游激活序列（UAS）结合，⽽AD能激活UAS下游基因进⾏转录。
单独的BD或AD不能激活基因转录，两者只有通过某种⽅式结合在⼀起形成完整的转录激活因⼦的功能【见图1】。
酵母双杂交系统主要利⽤酵母GAL4的这个特性通过两个杂交蛋⽩在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来研究活细胞内蛋⽩质的相互作⽤，对蛋⽩质之间微弱、瞬间的作⽤都能通过报告基因敏感的检测到。
酵母双杂交系统应⽤：1）对新的与已经蛋⽩相互作⽤的鉴定2）对预测蛋⽩相互作⽤的确认3）对蛋⽩相互作⽤区域的鉴定双杂交检测原理图。
两个蛋⽩分别表达，⼀个（诱饵蛋⽩bait protein）融合到Gal4 DNA 图1.双杂交检测原理图。
结合域表达，另⼀个（诱捕蛋⽩prey protein）融合到Gal4转录激活结构域（AD）表达。
在Y2HGold酵母菌株中，只有当两个蛋⽩之间相互作⽤并结合到Gal4反应性启动⼦上才能活化报告基因（AUR1-C, ADE2, HIS3, 和MEL1）的表达。
酵母双杂交系统重要元件介绍（以Matchmarker GAL4-based two hybrid assay为例）诱饵（the bait）⼀、⼀、诱饵（为了建⽴GAL4 DNA-BD/bait融合蛋⽩，推荐使⽤质粒pGBKT7；要调查三元蛋⽩复合物，推荐使⽤含2个MCS区域的三杂交载体，能表达GAL4 DNA-BD/bait融合蛋⽩和第⼆个感兴趣蛋⽩，在bait和prey蛋⽩之间发挥桥梁作⽤。
3.1实验材料3.1.1 菌株酵母菌株AH109，带有四个报告基因，ADE2，HIS3，MELI和lacZ，在三个不同的GAL4上游激活序列和TATA box的控制下ADE2和HIS3提供了营养选择标记，可以减少假阳性克隆的机率：MELI编码α-半乳糖苷酶，当底物X-α-Gal存在时，阳性克隆就会变成蓝色；lacZ编码β-半乳糖苷酶，当底物为X- Gal存在时，阳性克隆就会变成蓝色。
该菌株具体特点见图3-1，3-2。
图3-1 酵母菌株AH109的报告基因图3-2 酵母菌株表现型3.1.2 质粒载体阳性对照质粒pGBKT7-53；阴性对照质粒pGBKT7-Lam；对照的AD质粒载体pGADT7-RecT均为clontech公司提供。
Herring testes carrier DNA（10mg/ml）购自invitrogen公司。
载体信息见表3-1。
表3-1 本实验所用酵母双杂交载体信息3.1.2 培养基⑴YPDA培养基Tryptone 20g/LYeast extract 10g1LAdenine hemisulfute 30mg/LAgar 20g/L定容至950ml，PH=5.8116℃高压灭菌15min，冷却至55℃时加入50m1过滤灭菌的40%的葡萄糖。
⑵营养缺陷培养基（1L）YNB（Yeast nitrogen base without amino acids） 6.7g/LAgar 20g/L根据不同的营养选择性培养基加入如下的dropout Solution粉剂：SD/-Leu-Trp（二缺）：在不含任何氨基酸的SD培养基中加入二缺粉剂0.64g/L。
SD/-His-Leu-Trp (三缺)：在不含任何氨基酸的SD培养基中加入三缺粉剂0.62g/L。
SD/-His-Leu-Trp-Ade（四缺）：在不含任何氨基酸的SD培养基中加入四缺粉剂0.60/L定容到950ml，高压灭菌后加入灭菌的40%葡萄糖50ml，倒平板，于4℃保存。
酵母双杂交系统酵母双杂交系统，又称蛋白阱捕获系统，是由Fields和Song等人根据真核转录调控的特点创建的。
利用酵母双杂交系统能够快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用，并能寻找、分离与已知蛋白相互作用的配体，在研究抗原和抗体相互作用、发现新的蛋白质和发现蛋白质的新功能、筛选药物作用位点及药物对蛋白互作影响、建立基因组蛋白连锁图等方面应用广泛。
酵母双杂交原理酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物转录调控过程的认识。
真核生物中基因转录需要转录激活因子的参与，真核生物的转录激活因子含有两个不同的结构域：DNA结合结构域（DNA binding domain，DNA-BD）和DNA转录激活结构域（Activation domain，AD），这两个结构域可以独立分开，功能互不影响。
BD和AD分别单独作用并不能激活转录反应，只有当二者在空间上充分接近时，才呈现完整的转录激活因子活性，使下游基因得到转录。
根据这一原理，可设计酵母双杂交系统。
将两待研究蛋白（蛋白X与蛋白Y）分别与BD、AD结构域构建融合质粒。
将构建好的两个质粒转入同一酵母细胞中表达，如果两蛋白之间不存在相互作用，则下游基因（报告基因）不会转录表达；如果两个蛋白存在相互作用，则BD与AD两结构域空间上很接近，从而下游基因（报告基因）得到转录。
判断通过报告基因表达与否，即可判断两蛋白之间是否存在相互作用。
图1：酵母双杂交原理如何判断是否存在相互作用？报告基因作为一种营养标记，常用的有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等，对应的宿主菌则是相应标记的缺陷型细胞，必须要在含有该营养标记的培养基中生长。
因此，当有相互作用的蛋白存在时，激活报告基因的表达，从而能够在不含营养标记的培养基中生长，以此验证是否存在相互作用。
酵母双杂交系统重要元件酵母双杂交系统由三个部分组成：•与DNA结合结构域（BD）融合的蛋白表达载体（BD-X），被表达的蛋白称为诱饵蛋白（bait）或称为诱饵，通常诱饵蛋白为已知蛋白。
酵母双杂交技术引言酵母双杂交技术是一种常用的分子生物学技术，用于研究蛋白质-蛋白质相互作用。
该技术能够检测和分析细胞内发生的蛋白质-蛋白质相互作用，帮助科学家了解细胞信号传导、代谢途径和疾病发生机制。
本文将介绍酵母双杂交技术的原理、应用和优缺点。
原理酵母双杂交技术利用酵母细胞（通常是酿酒酵母）作为表达蛋白质的平台，通过操纵DNA序列，使得感兴趣的两个蛋白质分别与酵母细胞内的两个杂交域相连。
当两个蛋白质相互作用时，通过激活或抑制报告基因的表达来检测相互作用的发生。
具体来说，酵母双杂交技术包括以下几个步骤：1.构建融合基因表达质粒：将感兴趣的两个蛋白质的编码序列插入特定的表达质粒中，其中一个蛋白质与活化域相连，另一个蛋白质与靶向域相连。
2.转化酵母细胞：将构建好的表达质粒导入酵母细胞中，使其能够表达融合蛋白质。
3.遴选正交剪切位点：利用酵母细胞染色质中的正交剪切位点，确保融合蛋白质能够发挥其相互作用。
4.检测相互作用：通过报告基因（如荧光蛋白）的表达情况来检测融合蛋白质之间的相互作用程度。
一般来说，如果两个融合蛋白质相互作用，则报告基因被激活，表达结果可通过荧光显微镜观察或酵母细胞生长的特征来检测。
应用1.蛋白质相互作用网络研究：酵母双杂交技术可以帮助科学家构建蛋白质相互作用网络，了解细胞内不同蛋白质之间的相互关系和调控机制。
2.疾病相关蛋白质研究：酵母双杂交技术可以用于筛选和鉴定一些与疾病相关的蛋白质，帮助研究人员深入了解疾病的发生机制，并开发新的治疗方法。
3.药物靶点筛选：酵母双杂交技术可以用于筛选药物靶点，帮助研究人员发现新的药物靶点，从而加速药物研发过程。
优缺点酵母双杂交技术具有以下优点：•高通量：酵母双杂交技术可以同时检测大量蛋白质之间的相互作用，有助于加速研究的进程。
•对新蛋白质相互作用的发现：酵母双杂交技术可以帮助发现未知的蛋白质相互作用，有助于揭示新的细胞信号传导途径和代谢途径。
•相对简洁易行：酵母双杂交技术不需要复杂的实验设备，相对容易实施。
目录（一）介绍 4 （二）试剂盒物品清单 7 （三）额外附加物品列表9 （四）酵母菌株11 （五）酵母载体14 （六）方法简述：单杂交文库的构建和筛选16 方法简述：双杂交文库的构建和筛选17 （七）构建用于酵母单杂交的报告质粒载体18 （八）构建用于酵母双杂交的DNA-BD融合载体19 （九）构建生成cDNA文库21 （十）构建和筛选酵母单杂交和双杂交文库（简述）27 （十一）酵母单杂交文库的构建和筛选28 （十二）酵母双杂交文库的构建和筛选30 方法A:通过酵母配对（Yeast Mating）来筛选目的蛋白30方法B:通过共转化的方法筛选目的蛋白35 （十三）分析阳性相互作用结果38 （十四）问题解决指南44 （十五）参考文献47 （十六）相关产品50 附录A: 双链 cDNA合成的典型结果51 附录B: 酵母感受态的制备—LiAc 法52 附录C：单杂交对照载体信息53 附录D：双杂对照载体信息54 表格列表Table I． BD Matchmaker酵母菌株的基因型11 Table II． BD Matchmaker酵母菌株的表型11 Table III．单杂交系统的载体14 Table IV．双杂交系统的载体15 Table V．各BD-Matchmaker DNA-BD 载体的比较19 Table VI． RNA起始浓度和PCR扩增循环数之间的关系24 Table VII．单杂交共转化的对照实验的设置29 Table VIII．单杂共转化对照实验：期望的结果29 Table IX．双杂交转化的对照实验的设置33 Table X．双杂交配对筛选的对照实验的设置Table XI．双杂交共转化的对照实验的设置Table XII．双杂交共转化的对照实验：期望的结果Table XIII．用于PCR筛选菌落的Assembling Master Mixs图片列表Figure 1．使用BD Matchmaker单杂交系统筛选蛋白-DNA相互作用 4 Figure 2．使用BD Matchmaker单杂交系统筛选蛋白-蛋白相互作用 4 Figure 3．酵母单杂交和双杂交筛选的大致步骤5 Figure 4．构建和筛选BD Matchmaker酵母单杂交和双杂交文库6 Figure 5．酵母菌株AH109和Y187中的报告基因12 Figure 6．BD Matchmaker酵母单杂交文库的构建和筛选16 Figure 7．BD Matchmaker酵母双杂交文库的构建和筛选17 Figure 8．用BD SMART技术合成高质量的ds cDNA 21 Figure 9．BD CHROMA SPIN纯化柱和收集管26 Figure 10．通过酵母重整合作用来构建AD融合文库27 Figure 11．为双杂交筛选AD融合文库32 Figure 12．分析和证明可能的单杂交和双杂交相互作用阳性结果的策略39 Figure 13．通过酵母配对来验证蛋白-蛋白相互作用42 Figure 14．用对照用人胎盘Poly A+ RNA合成双链cDNA 51 Figure 15．p53HIS对照载体的图谱53 Figure 16．pGAD-Rec2-53 AD对照载体的图谱53 Figure 17．pGADT7-RecT AD对照载体的图谱54 Figure 18．pGBKT7-53 DNA-BD 对照载体图谱54 Figure 19．pGBKT7-Lam DNA-BD 对照载体图谱55（一）介绍BD Matchmaker TM Library Construction & Screening试剂盒提供一种简便的方法构建cDNA文库用来进行酵母双杂交和单杂交的筛选，这些试剂盒结合了BD Matchmaker TM Systems和BD SMART TM cDNA Synthesis的技术，只需要用任何组织的1 μg poly A+ RNA 或total RNA就能构建cDNA文库。
通过一般细胞内克隆步骤，你能利用BD Matchmaker Systems所提供的灵敏的转录方法所构建的文库来进行单杂交或双杂交实验。
单杂交实验的原理——蛋白-DNA相互作用实验单杂交实验使你能够确定和描述蛋白与目的顺式DNA激活序列的绑定，该序列可能是处于最小限度的启动子上游的用于增强转录的元件。
这个实验也可以用于预测或新蛋白的DNA 绑定结构域的确定。
通过BD Matchmaker One-Hybrid System你可以很容易的获得这些基因表达的蛋白在BD Matchmaker One-Hybrid实验中，潜在的DNA绑定蛋白基因是与克隆在pGADT7-Rec2（为单杂交设计的低拷贝载体）上GAL4激活结构域（AD）序列一起融合表达的。
一个或多个目的DNA序列的串联拷贝被构建在pHIS2（含有HIS3营养缺陷报告基因的报告载体）。
DNA绑定蛋白和目标序列的相互作用会激活HIS3的转录（Figure 1），该过程要在宿主菌株Y187（组氨酸缺陷型）中进行并在缺少组氨酸的培养基生长双杂交实验的原理——蛋白-蛋白相互作用的原理双杂实验分析能用于鉴定新的蛋白与蛋白相互作用、确定疑似作用、明确结构域。
在一个BD Matchmaker双杂交实验分析中，诱饵基因是与GAL4 DNA（DNA-BD）绑定结构域序列融合表达的，同时其他的基因或其cDNA与GAL4激活域（AD）序列融合表达（Fields & Song, 1989; Chien et al., 1991）。
当诱饵与文库融合蛋白在AH109（ADE2, HIS3, lacZ, MEL1）这样的报告菌株中相互作用，DNA-BD和AD相接近结合，并激活报告基因转录（Figure 2)DNA-BD 和AD的融合序列是将cDNA序列克隆进酵母表达载体pGBKT7 和pGADT7-Rec载体中来实现的。
pGBKT7表达了与GAL4 DNA-BD融合的蛋白，而pGADT7-Rec表达与GAL4 AD相融合的蛋白。
在酵母中，两种融合基因在组成型启动子P ADH1下高水平表达的。
其他的像pGBT9、ADH1、pAS2-1、pBridge基于GAL4的克隆载体与这个试剂盒也相兼容的。
pBridge载体能被用于鉴定三蛋白复合体的酵母三杂交实验。
单杂交和双杂交实验分析的生物学基础单杂交和双杂交方法是基于许多真核转录因子被发现是复合组成的，它们的转录激活和DNA绑第结构域在结构上和功能上是分开的。
这使研究者可以构建各种融合基因，当在酵母中表达时，能同时结合到目标DNA序列并激活下游报告基因的转录（Figure1和Figure2），BD Matchmaker systems 使用的GAL4的转录激活域与DNA绑定域是被完全阐述的的转录因子（Zhu, L. & Hannon, G. J., 2000.）双杂和单杂文库的建立和筛选双杂和单杂文库的建立和筛选由四个主要步骤组成，（注：有两个步骤遵从同样的流程）。
如果想去筛选双杂交相互作用，第一步是建立一种DNA-BD融合载体。
第二步是使用试剂盒所提供BD SMART试剂从你所抽提poly A 和total RNA建立cDNA文库。
就酵母双杂筛选而言，如果你打算我们从预制的BD Matchmaker cDNA文库选取来替代自己准备文库，可以跳过RNA分离、cDNA合成、AD融合文库构建。
这些包含非常广泛组织的文库被有效的保存在甘油中或预转化到Y187酵母菌株。
我们也提供一种BD Matchmaker文库服务，基于这个服务，提供给我们你想筛选的组织与细胞，我们为你制作AD融合文库。
请注意，我们尽管在高拷贝酵母表达载体中建立了很多的预制和预转化的BD Matchmaker cDNA文库，对双杂工作非常理想的，但他们很少适合单杂分析。
在单杂分析中我们推荐使用pGADT7-Rec2 and pHIS2等低拷贝载体，因为他们产生较少的假阳性克隆。
其次是cDNA合成，把cDNA克隆到BD Matchmaker AD克隆载体中建立一个GAL4 AD 融合文库，如果是建立双杂文库是pGADT7-Rec载体，单杂则是pGADT7-Rec2载体。
克隆在细胞内通过同源重组来进行的，这一步利用酵母替内高效重组系统使ds cDNA和相应的GAL4 AD质粒融合。
采用重组介导的克隆，文库的构建和筛选能紧密的完成，而不需要任何的细菌转化和扩增步骤。
简单的把cDNA文库和相应的BD Matchmaker载体转化到酵母中，然后把细胞用于成分缺省培养基筛选双杂作用。
Figure 3. 酵母单杂和双杂筛选的一般步骤，更加详细单杂和双杂筛选流程图，请参考Figures 6 and 7.Figure 4. BD Matchmaker TM 单杂和双杂文库筛选与构建.如这个图表所示，As this diagram shows,重组介导克隆使文库构建和筛选更快捷高效，尽管这里没有显示，双杂文库能通过酵母融合筛选（细节参照Section XII）.BD SMART TM 的cDNA合成和扩增，请参照Section IX. pGADT7-Rec被用于双杂文库构建和筛选而pGADT7-Rec2被用于单杂文库构建和筛选。
被pGADT7-Rec[2]所显示的两个相关载体有不同复制元件。
更多的信息请参照Section X 和相关的载体信息包.i（二）试剂盒内试剂列表此试剂盒包含有足够试剂能制备5次单杂或5次双杂文库。
去离子水、BD CHROMA SPIN柱,、NaCl溶液、缺省(DO)补充物、NaOAc、LiAc、PEG、TE Buffer,、YPD Plus培养基在室温下保存；.酵母菌株、对照Poly A +和BD SMART III Oligo 保存在–70°C，其他试剂储存在–20°C.下。
cDNA第一条链合成cDNA扩增Trial –Size BD Advantage TM PCR 试剂盒cDNA 纯化单杂交文库构建双杂交文库构建BD Yeastmaker 酵母转化系统（三）自备材料下列试剂自备，无其他特别要求所有的试剂与溶液均储存与室温下。
cDNA第一条链合成●无菌0.5ml离心管●Poly A+ or total RNA●矿物油●热循环仪●DNA marker (1-kb DNA ladder)● 1.2% Agarose/EtBr gelcDNA的分离● 1.5ml无菌离心管●带有小架子环型支架●95%乙醇（-20℃）●1% 氯代二甲苯诱饵质粒构建● E. coli感受态细胞。
像DH5α or BD Fusion-Blue 感受态细胞●T4 DNA连接酶●10X T4 连接buffer●LB/amp 平板●50 mM NaCl●从E. coli转化子中提取质粒的试剂盒酵母转化（在无菌容器中准备试剂）●PEG/LiAc溶液● 1.1X TE/LiAc溶液●二甲亚砜酵母的培养与配对●YPD培养基(参照Yeast Protocols Handbook)●YPDA培养基（添加30 mg/L adenine hemisulfate，参照Yeast ProtocolsHandbook）●TE buffer或者无菌的蒸馏水●适合转化的无菌试管和烧瓶●100-和150-培养平板●无菌玻璃棒，用于扑板弯曲的吸管●X-α-Gal（用于酵母双杂MEL1表达的蓝白筛选）●有agar的Minimal SD Base和没有agar的Minimal SD Base●3-AT（抑制SD缺省his培养基背景生长）●Kanamycin 储存液（50 mg/ml ）保存于-20℃●Ampicillin 储存液（50 mg/ml ）保存于-20℃文库长期保存●100%甘油●YPD冷冻培养基（25%v/v甘油）酵母双杂文库的构建与筛选BD Matchmaker Two-Hybrid Library Construction & Screening Kit不提供下列缺省补充物。
