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第五章 工业微生物育种诱变剂

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工业微生物诱变育种诱变剂(ppt)

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2、紫外光的剂量
单位:尔格能量/mm2 (灯具发射强度随使用时间延长而下降。) 实际应用-相对剂量：照射时间、杀菌率来表示 杀菌率：90.0%-99.9% 时间：芽孢菌10min；
小芽孢杆菌营养缺陷型1-3min； 一般营养体3-5min； 无芽孢菌和革兰氏阳性菌0.5-2min。
3、诱变机理
照射 ❖ 设备：紫外灯、磁力搅拌器、暗室、培养皿等; ❖ 紫外灯：波长为253.7nm,功率是15W; ❖处理时的照射距离：20cm — 30cm; ❖ 样品：要直接暴露在紫外灯下，厚度不能超过
3mm,照射时，要用磁力搅拌器搅拌。 注意：操作和培养时必需避免可见光直射液面， 最好在黄色或红色灯光下操作。
后培养：1.5-2小时；
稀释涂皿
（四）、电离辐射
（五）新型诱变剂
❖ 微波:电磁波 ❖ 红外线：0.75～1000μm ❖ 激光：光量子流 ❖ 高能电子流：强电离辐射 ❖ 航天育种：利用返回式卫星进行农作
物新品种的选育的一种方法。
航椒1号
航茄2号
航 天 葫 芦
6、低能离子注入
过程：能量沉积、动量传递、离子注入和电荷 交换
染色体方面的表现: 断裂，形成染色体断片、环、桥等。 染色体畸变率与辐射剂量成正比 染色体畸变率是评价遗传损伤的指标
DNA方面的表现: DNA断裂、分解，形成单链结构 DNA非按时合成 存在自我损伤修复机制，提前进行DNA合成， 进行DNA损伤修复 生长素类物质促进DNA损伤修复 咖啡因、EDTA等拟制DNA损伤修复
结合的复合诱变效应
二、化学诱变剂
化学诱变剂是一些能和DNA起作用，改变 其结构，并引起遗传变异的化学物质。
碱基类似物 烷化剂 种类 移码突变剂 其他类
第五章 工业微生物诱变育种

第五章 工业微生物诱变育种


株时，应选择多种遗传类型的菌株作为出发菌株比较
稳妥，容易在较短时期内达到育种目的。
8. 菌种代谢特点
了解菌种代谢特点有助于选择有效的出发菌株。 有人曾研究过肌苷酸产生菌的代谢特性，发现肌苷 酸的生物合成过程与肌苷、肌苷酸及核苷酸、磷酸 化酶的活性有关，如果从产生肌苷酸野生型的枯草 杆菌中筛选到降解酶活性低而磷酸化酶活性强的作 为诱变出发菌株，一般都能得到良好的诱变效果。
6. 药品和原材料质量
药品规格和原材料来源不同，都会影响菌种的质量。
四、了解菌种有效产物中的 各种组分在代谢 合成过程中与培养条件的关系
由棘孢小单孢菌(Micromonospora echinopora) 产生的庆大霉素，其中C1是有效的组分； C2是无效
的。在发酵过程中加入适量的磷或蛋白胨以及加大 通 风量都有利于C1的合成；反之，C2的比例就上升。

菌悬液由出发菌株的孢子或菌体细胞与生理盐水或 缓冲液制备而成。对菌悬液的制备有如下的要求：
1、供试菌株的孢子或菌体要年轻、健壮。
细胞要新培养的，细胞生理活性方面既要同步， 又要处在最旺盛的对数期，这样突变率高，重现性也 好。 霉菌孢子浓度约为：106ml-1，放线菌孢子浓度约 为：106~107ml-1。菌悬液通常采用生理盐水制备。如 果用化学诱变剂处理时，应采用相应的缓冲液配制， 以防处理过程中pH变化而影响诱变效果。
1. 对一般出发菌株的要求
（1）从自然界样品中分离筛选出来的野生菌株，虽 然产量较低，但对诱变因素敏感，变异幅度大，
正突变率高；
（2）在生产中使用的，具有一定生产能力，并且在 生产过程经过自然选育的菌株； （3）采用具有有利性状的菌株，如生长速度快、营 养要求低以及产生孢子早而多的菌株；
第五章工业微生物育种诱变剂

第五章工业微生物育种诱变剂

18

亚硝酸诱发的突变
HNO2 A T H C G C G C HNO2 A U A T
A:T
G┆C
19

亚硝酸的处理方法
1. 试剂的配制
（1）1mol/LpH4.5醋酸缓冲液
（2）0.1mol/L亚硝酸钠溶液 （3）0.07mol/LpH8.6磷酸氢二钠溶液
2.处理方法（以处理浓度0.025mol/L为例）
第五章 工业微生物育种诱变剂 本章内容：
化学诱变剂
物理诱变剂
生物诱变剂
•诱变：通过人为的方法，利用物理、化学因素处理微 生物以引起突变，这一过程称为诱发突变。

诱发突变(induced mutation)的发现

1927年，Muller 用X射线诱发果蝇遗传性状变异。

在第二次世界大战中，又发现化学物质氮芥也能导致细菌性状变
5-BU掺入后的复制错误
A:T
G ≡ BUe G≡ C
G≡ C
A: BUk
A:T
A:T
G ≡ BUe
A=BUk
A=T
G ≡ C→A=T
G ≡ BUe
G ≡C A: T → G ≡ C
G ≡ BUe
10
•由于5-BU的诱变作用是在DNA复制过程中实现的，因
此，处在静止或休眠状态的细胞是不适合的。
•细菌采用对数期的细菌，霉菌、放线菌采用孢子，
处理浓度为25—40μg/ml,混合均匀——取0.1—0.2ml菌悬液
加入到琼脂平板上涂布培养——在适宜温度下，使之在生长 过程中诱变处理——培养后挑取单菌落，进行筛选。
真菌、放线菌孢子，则要提高5-BU的浓度（0.1—1mg/ml）， 加到孢子悬液后，进行振荡培养数小时(一般6—12h)——分离
工业微生物育种诱变剂

工业微生物育种诱变剂

第一章工业微生物育种诱变剂1物理诱变剂的总类：物理辐射分为电离辐射和非电离辐射。

包括紫外线、X射线、r射线。

快中子。

微波，超声波、电磁波、激光射线和宇宙线等。

（X 射线、r射线属于电离辐射，紫外线属于非电离辐射）2物理诱变剂对微生物的影响实质：由高能辐射导致生物系统损伤，继而发生遗传变异的一系列复杂的连锁反应过程。

3辐射作用的时相阶段：物理阶段——直接作用DNA或作用于水物理化学阶段——激发和电离DNA分子或激发电离水分子化学阶段——产生生物自由基生物学阶段——分子发生变化，变异或死亡4细菌中紫外线对DNA的影响：促使G:C A:T的转换； DNA链断裂，单链或双链；嘧啶或嘌呤被氧化脱去氨基；碱基分子结构中碳与碳之间的链断裂形成开环现象；辐射击中单个核苷酸后，使碱基或磷酸酯游离出来；交联作用5辐射引起的生物学效应的影响因素：微生物的遗传背景；微生物的生理状态；可见光；细胞水分；温度；空气或氧气。

6紫外线的诱变机理及原因？机理：(1)DNA与蛋白质交联(2)胞嘧啶与尿嘧啶之间的水合作用(3)DNA链断裂，形成嘧啶二聚体原因：形成嘧啶二聚体7DNA损伤修复中光修复与暗修复的主要机理？光修复：嘧啶二聚体被一种光激活酶结合形成复合物，这种复合物在可见光下由于光激活酶获得光能而发生解离，从而使二聚体重新分解成单体。

暗修复：嘧啶二聚体的5’端限制性内切酶和外切酶的作用下，造成单链断裂，接着在外切核酸酶的作用下，切除嘧啶二聚体。

然后再DNA聚合酶Ⅰ、Ⅲ的作用下，并以另一条完整的单链做模板合成正确的碱基对序列，最后由连接酶完成双链结构。

8紫外线有效波长（诱变）范围是：200~300nm9紫外线的剂量以什么计算？绝对剂量：erg/mm2；相对剂量：照射时间、杀菌率表示10紫外线诱变的步骤方法（以及应用，包括如何计数、致死率的计算）步骤：（1）出发菌株的选择将细菌斜面培养至对数期，霉菌或放线菌培养至孢子刚成熟（2）前培养培养基中可添加咖啡碱或异烟肼等抗修复物质。

5工业微生物育种诱变剂

5工业微生物育种诱变剂

2. 电离辐射的诱变机理
X射线波长是0.06~136纳米， X射线一般由X光机产生。 γ射线的波长是0.006~1.4纳米 ，γ射线来自放射性元素钴、
镭或氡等。 中子可以从回旋加速器、静电加速器或原子反应堆中产生 快中子具有的能量最高，为0.2~10MeV
电离辐射诱变机理
直接作用：打断化学键 间接作用：通过自由基打断化学键，引起缺失和损伤 • 效应：染色体畸变，碱基置换，移码突变
1.4 非电离辐射——紫外线
–2. 紫外线诱变
(4) 紫外线诱变的步骤与方法
① 出发菌株：把细菌斜面培养到对数期，霉菌或放线菌则培养到孢子 刚成熟。
② 前培养：营养丰富的培养基+抑制修复物质，如咖啡碱或异烟肼等。 霉菌、放线菌培养到绝大部分孢子刚刚萌发。
③ 制备菌悬液：离心去除培养基，用生理盐水制备菌悬液，分散程度 达90~95%。要求菌悬液浓度：细菌约1×108个/毫升，放线菌107~108 个/毫升，霉菌约106~107个/毫升。
1.4 非电离辐射——紫外线
136-390nm
1.4 非电离辐射——紫外线
紫外线可由紫外灯管产生。要求的设备 简单、操作方便、价格低廉。
紫外线诱变效果显著。诱变频率高，而 且不易发生回复突变。
因此紫外线是一种使用最早也是沿用最 久的应用效果最明显的物理诱变剂。
DNA分子能吸收紫外线光谱。其中嘧啶碱基比嘌呤碱基敏感上 百倍。 紫外线使DNA分子发生如下几种变化：①DNA与蛋白质交联； ②胞嘧啶和尿嘧啶之间的水合作用；③DNA链的断裂；④形成 嘧啶二聚体。这是紫外线引起的主要变化。
碱基类似物：是指其分子结构同DNA分子中的碱基非常类 似，因此能取代碱基掺入到DNA分子中的一类化合物。 主要诱变剂：5-溴尿嘧啶（5-BU） /T
第四章 工业微生物育种诱变剂

第四章 工业微生物育种诱变剂


（三）紫外线诱变的步骤与方法： （1）出发菌株 细菌斜面培养到对数期，霉菌或放线菌则培养到孢子 刚成熟。 （2）前培养 对细菌类以肉汤为主，适量加人核酸类物质或酵母膏 等制成营养丰富的培养基，还可加人抑制修复的物质， 如咖啡碱或异烟肼等。 （3）制备菌悬液 单细胞：细菌约108 ml-1；放线菌约107～108ml-1， 霉菌约106 ml-1。 （4）紫外线照射 3-5ml，搅拌；避光，提前20min预热紫外灯。结 束时冰浴1-2h。
2．甲基磺酸乙酯（简称EMS） 甲基磺酸乙酯是磺酸酯类中诱变效果较好的一 种烷基化合物，外观呈粉末状或无色液体，难溶于 水，不稳定，易水解成无活性物质。 EMS的诱变处理方法： ①EMS母液的配制：为了安全和防上失效，配制前将 需用的器皿，置冰箱内预冷，然后在冰浴中进行配 制。取0.5ml EMS原液，加人到10 ml pH7.2磷酸缓 冲液中，加盖，并轻轻转动试管。由于在水溶液中 易失效，故尽可能低温保藏，并要现用现配。
2、辐射引起的生物效应，根据辐射种类和微生物种 类不同有所差异。 3、同一种辐射线对不同微生物的效应不一样，这与 每种微生物修复系统的强弱有关。
二、辐射引起生物效应的影响因素
1．微生物的遗传背景 ：G+C% 2．微生物的生理状态 3．可见光 4．细胞水分 5．温度 尤其对于电离辐射，较高温度能促进氧与自由基之间的相互作 用、加速与DNA发生的化学反应。在氧气充足的条件下要比在缺 氧条件下的电离辐射的生物学效应显著。
烷化剂主要是通过烷化基团使DNA分子上的碱基及 磷酸部分烷化，DNA复制时导致碱基配对错误而引起 突变，碱基中容易发生烷化作用的是嘌呤类。其中鸟 嘌呤N7是最易起反应的位点，几乎可以和所有烷化剂 起烷化作用；此外，DNA分子中比较多的烷化位点是 鸟嘌呤O6和胸腺嘧啶O4，这些可能都是引起突变的主 要位点。其次引起烷化的位点是鸟嘌呤N3、腺嘌呤N2， 腺嘌呤N7和胞嘧啶N3。这些位点引起碱基置换的仅占 烷化作用的10％左右。因此，由这些位点改变所引起 的突变仅是少数。 烷化剂也能造成磷酸和核糖之间的共价键断裂， 而造成突变。
第五章工业微生物育种诱变剂

第五章工业微生物育种诱变剂

突变的主要位点：鸟嘌呤的N7，鸟嘌呤的O6、 胸腺嘧啶O4
突变的次要位点：鸟嘌呤的N3，腺嘌呤的N2、 腺嘌呤的N7、胞嘧啶N3
（二）烷化剂的性质
① 溶液烷化剂的性质比较活泼，不太稳定，在水溶 液中容易发生分解。
② 大部分半衰期很短，其长短与温度、溶液pH关系 很大。因此，化学诱变剂要现用现配还要避光。 配制烷化剂时，要采用合适的出缓冲液。
（6）稀释涂皿，后培养结束后，从中取一定量培养物，作不同稀释度，涂皿，并
且以未经紫外线照射过的菌悬液作对照，培养后，挑取菌落，以待筛选。
四、电离辐射
伦 琴 和
射 线
X
四川成都放60CO运输
河南杞县“杞人忧钴”
2. 电离辐射剂量
快中子：拉德（rad）；伦琴（R）
致死率达到50％～85％比较合适，诱变剂量大约在15～
1. UPF值是紫外线对未防护的皮肤的平均辐射量的比 值，UPF值越大，表明防紫外线性能越好。
2. 只有当UPF＞30时，并且UVA的透过率小于5％时，才 能称为防紫外线产品，防护等级标识为UPF30＋；
3. 而当UPF＞50时，则表明该产品的紫外线防护性能极 佳，防护等级标识为UPF50＋。
UPF范围 15－24 25－39
处理完毕后继续冰浴可降低或抑制修复酶的活性。
宇宙射线
五、近年来发展的新型诱变剂
1. 微波 微波对微生物的诱变效应有2个方面的因素，即
热效应和非热效应。 ① 热效应是指物料吸收微波能量，使温度升高从而 达到灭菌的效果； ② 非热效应则是在电磁波的作用下，生物体内不产 生明显的升温，却可以产生强烈的生物效应。
2-氨基嘌呤（AP）可以和胸腺嘧啶互配，但出 现亚氨基状态时，和胞嘧啶配对。
工业微生物育种学4

工业微生物育种学4


四、电离辐射
常用的微生物诱变电离辐射
物理诱变剂 X射线 波长 生物学效应 0.06~136nm 1 脱氧核糖的降解 2 糖-磷酸骨架的断裂 3 丧失嘌呤 0.006~1.4nm 4 碱基的羟基化 5 自由基和DNA分子反应 6 DNA链的断裂
γ射线
快中子
X射线和γ射线
X射线和γ射线的剂量单位通常以伦琴来表示，即 1cm3干燥空气在0℃、1.013×105帕气压下，产生 2.08×109离子时所需的能量。 其作用机理是使原子中的电子被击出而变成正离子。 由于具有很强的穿透能力，所以对细胞的杀死作用 比紫外线和一般化学试剂更强。在实践中不用象紫 外线那样进行反复多次照射。 切忌使用高剂量进行处理，一般掌握在90~99.9% 的杀菌率为宜。
电离辐射
一些高能射线在照射并穿过物质的过程中，能把 该物质分子或原子上的电子击中而产生正离子， 故称电离辐射。产生的正离子数量随着射线发射 的能量增高而增加。 如X射线、γ射线和快中子等。
快中子有点特别。它本身是不带电荷的粒子，不 直接产生电离，但是它可使吸收中子物质的原子 核被撞击出质子。
杀菌率和诱变效果
照射剂量越高，杀菌率也越高，在残存细胞中的 变异幅度也广。一般认为杀菌率以90%~99%效 果较好。但也有报道说，较低的杀菌率 （70%~80%）有利于正突变型的产生。
因此我们要设法掌握好减少死亡率和提高诱变效 果之间的矛盾。
紫外线诱变的步骤和方法
1 斜面培养出发菌株
关于辐射引起的生物效应
辐射引起的生物效应与射线种类和微生物的种 类有关。同一种射线对不同的微生物其效应也 不一样，这与每种微生物修复系统的强弱不同 有关。 电离辐射主要引起DNA上的基因突变和染色体 畸变；非电离辐射主要是形成嘧啶二聚体。 物理诱变剂引起微生物的变异或死亡与辐射剂 量成正比。在相同的总辐射剂量的条件下，不管是一次连续
食用菌生产技术 育种的诱变剂

食用菌生产技术 育种的诱变剂

第五章 工业微生物育种的 诱变剂
诱变剂及其诱变机制
• 诱变剂（mutagen）：凡能提高突变率的 诱变剂（mutagen）：凡能提高突变率的 ）： 任何理化因子， 任何理化因子，就称为诱变剂 • 种类：诱变剂的种类很多，作用方式多 种类：诱变剂的种类很多， 即使是同一种诱变剂， 样。即使是同一种诱变剂，也常有几种 作用方式。 作用方式。 • 按照遗传物质结构变化的特点讨论几种 有代表性的诱变剂及其作用机制。 有代表性的诱变剂及其作用机制。
（三）化学诱变剂的作用机理
• 化学诱变剂的作用机理比较复杂，请看下 面的介绍．
碱基置换（substitution） （1）碱基置换（substitution）诱变剂
定 义 ： 对 DNA 来 说 ， 碱 基 的 置 换 属 于 一 种 染 色 体 的 微 小 损 伤 microlesion） 一般也称点突变（ mutation） （microlesion），一般也称点突变（point mutation）。它只涉及一 对碱基被另一对碱基所置换。 对碱基被另一对碱基所置换。 分类：转换（transition） DNA链中的一个嘌呤被另一个嘌呤或是一 分类 ： 转换 （ transition ） ， 即 DNA 链中的一个嘌呤被另一个嘌呤或是一 个嘧啶被另一个嘧啶所置换； 个嘧啶被另一个嘧啶所置换； 颠换（transversion） 即一个嘌呤被一个嘧啶, 颠换 （ transversion ） ， 即一个嘌呤被一个嘧啶 , 或是一个嘧啶 被一个嘌呤所置换。 被一个嘌呤所置换。
温馨提醒
做诱变育种工作，一定要注意自身 安全和环境安全！不留遗憾和后患！
• 谢谢大家，再见！
对某一具体诱变剂来 说，即可同时引起转 换与颠换， 换与颠换，也可只具 其中的一种功能。根 其中的一种功能。 据化学诱变剂是直接 据化学诱变剂是直接 还是间接地引起置换， 间接地引起置换 还是间接地引起置换， 可把置换的机制分成 以下两类来讨论。 以下两类来讨论。
工业微生物育种学5

工业微生物育种学5


介绍几种烷化剂 及其诱变处理方法
Ⅰ亚硝基胍
亚硝基胍的结构式
亚硝基胍的性质
亚硝基胍是1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍的简称， 简写成NTG、NG或MNNG。
亚硝基胍为黄色结晶状物质，性质稳定，遇光易 分解，放出NO，颜色由黄变绿，诱变效应降低。 NTG不溶于水，须加助溶剂（甲酰胺或丙酮）
碱基类似物诱变的具体机制
正常的碱基存在着同分异构体，碱基类似物也 一样有同分异构现象，它是由电子结构改变引 起的。在嘧啶分子中异构现象以酮式和烯醇式 两种形式存在，在嘌呤分子中异构现象以氨基 和亚氨基两种形式存在。 一般互变异构现象在碱基类似物中比正常DNA 四种碱基中出现的频率高。而不同的异构体对 应的互补碱基是不同，由此造成基因的突变。
①取新鲜、年轻的斜面，用pH值一定的磷酸 缓冲液或tris缓冲液洗下细菌做成菌悬液。如 果细菌细胞或丝状菌孢子需进行前培养的，可 用有关培养基代替缓冲液，培养结束后离心洗 净，用同一种缓冲液做成菌悬液，浓度约控制 在106~107个/mL。 这一步的主要目的是使材料处于生长代谢的旺 盛期，有利于诱变。
脱氨基作用
脱氨基作用主要有三种变化： 腺嘌呤（A）变为次黄嘌呤（H）； 胞嘧啶（C）变为尿嘧啶（U）； 鸟嘌呤（G）变为黄嘌呤（X）。
腺嘌呤→次黄嘌呤
A→H时，第一次DNA 复制后次黄嘌呤不与 胸腺嘧啶（T）配对， 而与胞嘧啶配对，第 二次复制后，A：T就 变成了G：C。 脱氨基后碱基转换。
本节主要内容
介绍几种主要的化学诱变剂
二、化学诱变剂的种类
化学诱变剂种类
碱基类似物 烷化剂 脱氨剂 移码诱变剂 羟化剂 金属盐类 其他诱变剂
（一）碱基类似物
工业微生物育种复习题解析

工业微生物育种复习题解析

工业微生物育种复习题解析第一章绪论1.什么是工业微生物？作为工业微生物应具备哪些特征？答：工业微生物：对自然环境中的微生物经过改造，用于发酵工业生产的微生物。

具备特征：(1)菌种要纯(2)遗传稳定且对诱变剂敏感(3)成长快，易繁殖(4)抗杂菌和噬菌体的能力强(5)生产目的产物的时间短且产量高(6)目的产物易分离提纯2.工业微生物育种的基础是什么？答：工业微生物育种的基础是遗传和变异。

3.常用的工业微生物育种技术有哪些？答：常用技术：(1)自然选育【选择育种】(2)诱变育种(3)代谢控制育种(4)杂交育种(5)基因工程育种第二章微生物育种的遗传基础1.基因突变的类型有哪些？答：有碱基突变，染色体畸变2.叙述紫外线诱变的原理？答：原理：紫外线对微生物诱变作用，主要引起DNA的分子结构发生改变（同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），从而引起菌体遗传性变异。

3.基因修复的种类有哪些？答：种类：(1)光复活修复(2)切除修复(3)重组修复(4)SOS修复4.真核微生物基因重组的方式有哪些？答：方式：(1)有性杂交(2)准性生殖(3)原生质体融合第三章出发菌株的分离与筛选1.什么是富集培养？答：富集培养：指在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境中的优势种，以利于分离到所需要的菌株。

2.哪些分离方法能达到“菌落纯”？哪些分离方法能达到“细胞纯（菌株纯）”？答：菌落纯：稀释分离法、划线法、组织法细胞纯：单细胞或单孢子的分离法3.分离好氧微生物常用的方法有哪些？答：(1)稀释涂布法(2)划线分离法(3)平皿生化反应分离法4.平皿生化反应分离法有哪些？分别用来筛选哪些菌？各自原理如何？答：(1)透明圈法原理：在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊，能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小可以放映该菌株利用底物的能力。

[给学生]《微生物遗传育种学》复习思考题(1)

[给学生]《微生物遗传育种学》复习思考题(1)2021级生物技术专业微生物技术方向《微生物遗传育种》复习思考题《微生物遗传育种》复习思考题01 绪论1、工业微生物菌种应具有哪些基本特征？非致病性；适合大规模培养工艺要求；利于规模化产品加工工艺；具有相对稳定的遗传性能和生产性状；形成具有商业价值的产品或具有商业应用价值。

2、简述工业微生物遗传育种的分类。

天然菌种（native strain）：通过自然筛选和分离获得的工业菌种；诱变菌种（mutagenized strain）：通过物理、化学等诱变剂在实验室人工诱变自然筛选与分离的菌株所获得产量或/和性状改善的工业菌种；重组菌种（recombinant strain）是通过遗传重组技术对菌种进行定向遗传改良获得的工业菌种；遗传修饰生物体（genetic modification organisms, GMOs）：经外源基因导入并因此发生遗传整合和性状改变的生物体。

3、试从微生物遗传学的不同角度阐述你对微生物多样性的认识。

一、微生物物种的多样性; 二、微生物遗传的多样性;三、微生物代谢的多样性 ;四、微生物的生态多样性;五、微生物利用的广泛性02 第四章工业微生物育种诱变剂1、什么是诱变剂？可分为哪几种类型？诱变剂：凡能诱发生物基因突变，并且突变频率远远超过自发突变率的物理因子或化学物质.可以分为三类：物理诱变剂；化学诱变剂：一类能对DNA起作用，改变DNA结构，并引起遗传变异的化学物质；生物诱变剂：采用某些噬菌体来筛选抗噬菌体突变菌株时，常常发现伴随着出现抗生素产量明显提高的抗性突变株。

因此，可以认为这些溶源性噬菌体是一种生物诱变剂。

2、什么是突变？突变的表现型有哪些？基因突变的特点有哪些？突变，从广义上讲，除了转化、转导、接合等遗传物质的传递和重组引起生物变异以外，任何表型上可遗传的突变都属突变范围，如染色体整倍性和非整倍性的变化及染色体结构上的畸变等都包括在内。

工业微生物菌种的选育——诱变选育(1)

工业微生物菌种的选育——诱变选育（1）工业微生物菌种的选育——诱变选育（1）诱变选育诱变育种是指利用各种诱变剂的物理因素和化学因素处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需的高产优质菌种的育种方法。

诱变育种具有速度快、方法简便等优点，是当前菌种选育的一种主要方法，使用普遍。

诱变育种的理论基础是基因突变，所谓突变是指由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。

诱变育种的步骤与方法（一）、工业育种的一般步骤（图）（二）、诱变育种方案设计诱变育种方案包括突变的诱发、突变株的筛选和突变高产基因的表现。

1、出发菌株的选择工业上用来进行诱变处理的菌株，称为出发菌株。

出发菌株选择目前主要依据实际经验，总结如下：①以单倍体纯种为出发菌株；②采用具有优良性状的菌株；③选择对诱变剂敏感的菌株；④许多高产突变往往要经过逐步累积的过程，才变得明显，所以有必要多挑选一些已经过诱变的菌株为出发菌株，进行多步育种，确保高产菌株的获得。

2、出发菌株的纯化为什么要对出发菌株进行纯化呢？这是因为微生物容易发生变异和染菌，同时一般丝状菌的野生菌株多为异核体。

生产菌在不断移代过程中，菌丝间接触、吻合后，易产生异核体、部分结合子、杂合二倍体及自然突变株等。

这些都会造成细胞内遗传物质的异质化，使遗传性状不稳定。

通过纯种分离，从中挑选所需的优良菌株。

常用划线分离和稀释分离法，并结合显微镜操纵器分离单孢子。

3、单孢子悬液的制备诱变育种要求所处理的细胞必须是处于对数生长期同步生长的细胞，并且是均匀状态的单细胞悬液。

首先是细胞的生理状态对诱变处理也会产生很大的影响，如细菌在对数期诱变处理效果较好；霉菌或放线菌的分生孢子一般都处于休眠状态，所以培养时间的长短对孢子影响不大，但稍加萌发后的孢子则可提高诱变效率。

其次是分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，又可避免长出不纯菌落。

由于在许多微生物的细胞内同时含有几个核，所以即使用单细胞悬浮液处理，还是容易出现不纯的菌落。

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于平皿——适温培养——挑取单菌落，进行筛选。
2.与辐射线复合处理 据报道，如果菌体先用5-BU等碱基类似物进行处理， 使它们首先渗入到DNA分子中，然后用辐射线照射，诱变 效果会比单独使用辐射线更好。因此，碱基类似物也是一 种辐射诱变的增敏剂。
二、化学修饰碱基的诱变剂

改变碱基结构的化学修饰剂：脱氨剂、羟化剂 常见的碱基修饰剂
第五章 工业微生物育种诱变剂 本章内容：
化学诱变剂
物理诱变剂
生物诱变剂
•诱变：通过人为的方法，利用物理、化学因素处理微 生物以引起突变，这一过程称为诱发突变。

诱发突变(induced mutation)的发现

1927年，Muller 用X射线诱发果蝇遗传性状变异。

在第二次世界大战中，又发现化学物质氮芥也能导致细菌性状变
沸点53℃/5mmHg
84
117
亚硝基甲基脲(NMU)
硫酸二乙酯(DES) 亚硝基胍(NTG)
黄色固体
无色油状 物 黄色固体 不易溶 熔点118℃ 3.34
35
1 0.5
103
• 几种常用的烷化剂：
1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍（简称亚硝基胍，NTG或NG或 MNNG） 为黄色结晶状物质，性质不稳定，遇光易分解，放出NO， 颜色由黄色变为绿色，诱变效应降低。须保存在棕色瓶中， 并在避光、干燥、低温条件下贮存。 NTG不溶于水，须加助溶剂，使用时现配现用。 NTG有超诱变剂之称，能使细胞发生一次或多次突变，诱变效 果好，尤其适合于诱发营养缺陷型突变株。其中处理细菌、放线 菌等微生物时，不经淘汰，就可以直接得到10%以上的营养缺陷 型突变株。而用一般诱变剂处理只能达百分之几至千分之几。
反应，引起鸟嘌呤从DNA分子上脱落下来，使DNA链上碱基空 缺，在以后的复制过程中其它游离碱基有可能错误掺入。
GC就可能变为任何碱基对
G:C——A:T转换及G:C——C: G或G:C——T: A 颠换而导致 突变。
由于烷基化后的鸟嘌呤，易离子化，由原来的酮式变为 不稳定的烯醇式，不能和胞嘧啶配对，而是与胸腺嘧啶错误
套，穿工作服，带口罩，用称量瓶称量，最好在
通风橱中进行。凡接触过NTG的器皿必须及时、
单独处理，例如用自来水大量冲洗或用1—
2mol/L的NaOH或2%的Na2S2O3浸泡过夜，洗净。

甲基磺酸乙脂（EMS）
使G的第6位烷化，使T的第4位上烷化，结果产生的
G C
O-6-E-G T
A T
T A
O-4-E-T G
33
• 烷化剂的性质
——烷化剂的性质比较活泼，不太稳定，在水溶液中容易发 生水解。 ——它们大部分半衰期很短，其长度与温度、溶液pH关系 很大。因此，化学诱变剂要现用现配。 ——不少烷化剂见光后，容易发生光化学反应，和水解作用 一样，有的分解产物会失去诱变作用或具毒性。因此，保藏 时要注意避光，臵棕色瓶中，放在干燥器或冰箱中保存。 ——另外，配制烷化剂溶液时，要采用合适的pH缓冲液。
5-BU掺入后的复制错误
A:T
G ≡ BUe G≡ C
G≡ C
A: BUk
A:T
A:T
G ≡ BUe
A=BUk
A=T
G ≡ BUe
G ≡C A: T → G ≡ C
G ≡ BUe
G ≡ C→A=T
10
•由于5-BU的诱变作用是在DNA复制过程中实现的，因
此，处在静止或休眠状态的细胞是不适合的。
•细菌采用对数期的细菌，霉菌、放线菌采用孢子，
配对，结果发生G:C——A:T转换而导致突变。
烷 化 鸟 嘌 呤 的 碱 基 配 对
烷化剂除了以上诱变作用之外，还有可能使两个鸟嘌呤 N7位点形成共价键，一般双功能烷化剂容易引起DNA双链间的 交联，造成变异或死亡。
鸟嘌呤通过N7位点的共价结合而发生交联
•总结鸟嘌呤N7位点的 烷化作用
烷化剂作用： 通过对鸟嘌呤N7位点的烷化而导致突变有三 烷化嘌呤引起碱基配对错误， 脱嘌呤作用， 鸟嘌呤的交联作用
烷化剂的某些性质
理化特性
烷化剂名称 状态 水溶性 溶点或沸点 20℃ 30℃ 37℃
pH7水中半衰期/h
分子 量
甲基磺酸乙酯(EMS)
无色液体
约8%
沸点 85~86℃/10mmHg
93
26
10.4
124
乙烯亚胺(EI)
无色液体
易溶于水
沸点56℃/760mmHg
43
亚硝基乙基脲(NEU)
粉红色液
约5%
多功能烷化剂
部分烷化剂 和 烷化碱基 部分烷化剂
甲基磺酸甲酯 烷化碱基
亚硝基乙基脲
7-甲基鸟嘌呤
3-甲基腺嘌呤
O6-甲基鸟嘌呤
26
• 烷化剂的诱变机制
——烷化剂主要使通过烷化基团使DNA分子上的碱基及磷酸 部分烷化，DNA复制时导致碱基配对错误而引起突变。
碱基中容易发生烷化作用的是嘌呤类。其中鸟嘌呤N7是最易 起反应的位点，几乎可以和所有烷化剂起烷化作用；甲基TG不溶于水，配制需加助溶剂甲
酰胺或丙酮少许，然后加缓冲溶液，其比例为9：1（缓
冲溶液9ml：NTG丙酮溶液1ml），一般NTG母液浓度配成 1mg/ml。使用时取母液0.2ml，加菌悬液1.8ml，NTG最后
处理浓度为100μg/ml。一般处理浓度随菌种不同而异，
通常细菌为100—1000μg/ml，而放线菌、真菌孢子为 1000—3000 μg/ml 。 3.将以上菌悬液和NTG溶液混合于一试管内，臵该菌生长 适宜的温度下保温处理若干时间。
• 取孢子悬液1ml，pH4.5醋酸缓冲液2ml及0.1mol/L亚硝酸钠溶 液1ml，最后处理浓度为0.025mol/L。于25—26℃保温10— 20min，加入0.07mol/L、pH8.6的磷酸氢二钠溶液20ml，使 pH下降至6.8左右，以终止反应。稀释分离于平板。
• 如果是处理细菌，亚硝酸最后浓度以0.05mol/L为例：将
G:C转换，进行逆向突变。 A:T的专一性诱变剂，因 G:C还是G:C
A:T

由于羟胺是诱发G:C
此，可以用来鉴别突变体是A:T
A:T转换。

羟胺的处理方法：常用浓度为0.1—5%，可直接
在溶液中处理，时间1—2h，然后分离培养。但一般 都加到琼脂平板或振荡培养基中，然后接入孢子或 细菌，在适温下培养，生长过程中处理，所用浓度
18

亚硝酸诱发的突变
HNO2 A T H C G C G C HNO2 A U A T
A:T
G┆C
19

亚硝酸的处理方法
1. 试剂的配制
（1）1mol/LpH4.5醋酸缓冲液
（2）0.1mol/L亚硝酸钠溶液 （3）0.07mol/LpH8.6磷酸氢二钠溶液
2.处理方法（以处理浓度0.025mol/L为例）
通常在pH6.0的条件下进行诱变处理。由于酸碱条件影响NTG 的诱变效果，因此，无论是配制NTG溶液，还是制备均悬液都 要用适宜的缓冲溶液。常用的由磷酸缓冲液和Tris缓冲液.
NTG的诱变处理方法：
1.取新鲜的斜面，用一定pH值的缓冲液或Tris缓冲液洗 下细菌制成菌悬液。如果采用细菌细胞或丝状菌孢子 （真菌或放线菌）须进行前培养，可用有关培养基代替 以上缓冲液，孢子培养时间控制在大部分孢子处在萌动 阶段，经离心、洗涤，用缓冲液制成悬液，浓度约在 106-107ml-1；
（a）亚硝酸（b）羟胺（c）甲基磺酸乙酯（d）N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍
16
1．脱氨剂

亚硝酸（nitrous acid）是典型的脱氨剂
亚硝酸可直接作用于正在复制或未复制的DNA分子
G C A 黄嘌呤X（xanthine ） U 次黄嘌呤H
17
亚 硝 酸 的 脱 氨 基 作 用 及 其 诱 发 的 突 变
4.终止反应。用冷的生理盐水稀释到50倍以上或在低温 下进行离心洗涤，除去药液，加无菌水使沉淀悬浮并作
成一定稀释度分离于平皿。 处理完毕后，马上把接触过NTG的器皿用NaOH或Na2S2O3浸
泡处理。
除以上直接以溶液处理外，也可以进行如下方法诱变处理： 1.摇瓶振荡处理
2.在平皿上生长过程处理
•NTG是一种强烈的致癌物质，操作时要带橡皮手

化学诱变剂种类：碱基类似物、碱基修饰剂、移码突变
4
一、碱基类似物 base
analogue
碱基类似物：是指其分子结构同DNA分子中的碱基非常类似

主要诱变剂：5-溴尿嘧啶（5-BU） /T
2-氨基嘌呤（2-AP） /A

诱发的突变：AT
GC的转换。
1.
2.
5
碱基类似物是如何提高突变频率的?
在DNA复制过程中取代正常碱基，整合进 DNA分子 它们产生异构体的频率高，出现碱基错配 的概率也高
比直接处理时低些。
3．烷化剂
——烷化剂是诱发突变中一类相当有效的化学诱变剂， 这类诱变剂具有一个或多个活性烷基，它们易取代DNA 分子中活泼的氢原子，直接与一个或多个碱基起烷化反 应，从而改变DNA分子结构，引起突变。 烷根 基据 的烷 数化 目剂 中 活 性 单功能烷化剂 亚硝基类、磺酸酯类、硫酸酯类、 重氮烷类、乙烯亚胺类化合物 双功能烷化剂 硫芥子、氮芥子类等
6
（一）碱基类似物的诱变机制
——现以5-BU为例来分析碱基类似物的诱变机制。当胸 腺嘧啶分子结构中5位碳原子上的甲基被溴（Br）原子取 代，就构成了5-BU的结构式。
5-溴尿嘧啶（5-BU）的结构
5 溴 尿 嘧 啶 （ 5 ） 的 碱 基 配 对
8
-BU

诱发的突变