包涵体纯化与复性：
色谱柱纯化包涵体
包涵体纯化的方法
与肝素有亲合力的包涵体的纯化
包涵体纯化复性的一篇文章
HIS包涵体的NI纯化
包涵体的纯化和复性总结(精华呦)
洗涤纯化的原理
GST融合蛋白包涵体的纯化
Amersham关于包涵体蛋白复性、纯化的报告
包涵体提出、纯化、复性"必胜技"
Pet28a/Bl21plys 表达体系包涵体的纯化
GST融合蛋白的包涵体能过柱子纯化吗？
含量低的目的蛋白的纯化
包涵体的进一步处理
包涵体直接纯化效果好还是复性以后纯化效果好?
包涵体如何复性
关于包涵体蛋白的复性，浓缩，纯化
关于包涵体的提取方法
制备多克隆抗体的蛋白是否需要除去尿素
从包涵体中提纯蛋白
有关包涵体的溶解问题
包涵体的洗涤
请教：菌体超声破壁时，所用的频率及时间是怎样的？另外应该菌体完全破壁时，菌液应该是怎样的？（也就是说超声的程度）
xxz990913 wrote:
请教：菌体超声破壁时，所用的频率及时间是怎样的？另外应该菌体完全破壁时，菌液应该是怎样的？（也就是说超声的程度）
超声时所用的频率以及时间是跟你的表达菌的种类以及你目的蛋白的性质密切相关的。比如说你的表达菌的承受能力比较强的话，你就可以适当加大超声频率以及超声时间，另外，比如说你的目的蛋白是以包涵体形式存在的话那么你就要注意你的超声力度了，因为很有可能对目的蛋白有很大的影响。一般实验室的超声仪探头的最大承受频率大概也就是400W，所以可以选用300w，超声10s，停止10s，或是选用400w，超声5s，停止5s。超声如果效果较好的话，整个样品应该是比较清亮的，但是并不是十分清亮，当然这跟你在湿菌体中加入pbs的量是有关系的，加多了，就清亮些，加少了，就浑浊些。还有就是超声效果如果好的话，样品不会出现像原来的那种教粘稠的情况，因为长链核酸全部被打断了。
当然为了减小超声的负担，可以在超声前加入溶菌酶，反复冻融等步骤。这也要根据宿主菌而确定。
20021108战友辛苦了
很需要有你这样的热心战友！
请教：蛋白质复性的具体步骤，我的目的蛋白溶解在20mM tris-hcl ,ph 7.2 0.5M Nacl, 复性缓冲液需要Tris缓冲液还是Pbs缓冲液？我用的是Pbs缓冲液，老是出现沉淀
谢谢
xxz990913 wrote:
请教：蛋白质复性的具体步骤，我的目的蛋白溶解在20mM tris-hcl ,ph 7.2 0.5M Nacl, 复性缓冲液需要Tris缓冲液还是Pbs缓冲液？我用的是Pbs缓冲液，老是出现沉淀
谢谢
复性问题是表达蛋白过程中的一个很棘手的问题，因为氨基酸组成的不同，造成蛋白不同的性质，同时也使复性变得困难。
包涵体蛋白复性方法大概有如下几种：
稀释复性、透析复性、超滤复性、柱上复性、高蛋白质浓度下的复性，此外，吸附法、反胶束法和双水相萃取法等都可用蛋白质的复性。
鉴于战友的情况，我个人认为应该使用Tris缓冲液较好，因为目前普遍认为大多数蛋白复兴使用Tris缓冲液效果较好（这可是有文献可查的哦）。至于出现沉淀这一点是不用说的，再成功的复性也会出现沉淀，而且我觉得复性也可以看作是一个纯化的过程，我们期望看到沉淀，因为沉淀的不仅仅是我们的目的蛋白，还有一些杂蛋白，即使按比例沉淀，我们的目的蛋白还是越来越纯了，不是吗？而且这一点我认为战友没有必要担心，如果目的蛋白浓度过小的话，你可以在复性结束后浓缩一下以提高浓度。当然如果目的蛋白全部沉淀的话，就说明这种缓冲液不适合你的目的蛋白，就要改变复性方案了。
影响复性效率的因素就有很多了，比如蛋白质的复性浓度、pH和温度等等等等。
这样的贴为什么不加分啊！！我强烈支持加分斑竹！！
20021108
衣带渐宽终不悔
这是个好战友，希望以后能多请教！！
biosepq wrote:
20021108战友辛苦了
很需要有你这样的热心战友！
谢谢龙版的鼓励！
vicardin wrote:
这样的贴为什么不加分啊！！我强烈支持加分斑竹！！
20021108
衣带渐宽终不悔
这是个好战友，希望以后能多请教！！
谢谢战友您的鼓励！
请教不敢当，互相学习吧。
加不加分没什么太大的关系，开设这个帖的主要目的是和大家共同探讨纯化和复性的经验、技巧等等。
斑竹也不是每时每刻都在线的，也许是还没阅帖吧，呵呵。
谢谢你们
请问Tris缓冲液如何配制?急需
谢谢你们
请问Tris缓冲液如何配制?急需
谢谢你们
请问Tris缓冲液如何配制?急需
xxz990913 wrote:
谢谢你们
请问Tris缓冲液如何配制?急需
Tris缓冲液：
50mM Tris
0.5mM EDTA
50mM Nacl
5%或10％甘油
如果有条件加入1％的甘氨酸或精氨酸和谷胱甘肽会更好些。也可以在其中
加入氧化还原系统，如双型谷胱甘肽、DTT等。
PH理论上是要根据你蛋白的等电点来确定的，应该是比等电点稍高一些。但是PH7.9、8.0我都试过，效果没区别。
我曾经使用过PH 9.5成功复性目的蛋白
天边的一片云wrote:
我曾经使用过PH 9.5成功复性目的蛋白
如上所述,缓冲液的PH是根据你的目的蛋白的等电点而确定的,呵呵.
复性是一个十分复杂的过程，解决得方法也是多种多样。首先是选择合适的表达载体和表达菌株，尽量少产生包含体。可以先进行预实验确定表达条件，我建议采用正交分析法来进行。一般的我采用4因素3水平的正交实验，因素主要考虑培养温度、诱导物加入量、加入诱导物时的菌浓度和诱导时间。每个因素考虑小、中、大三个水平。我曾经使用这种方法，很好的选择了一个蛋白的表达条件，使其大部分以可溶形式表达。
再谈包含体的复性，在采用通常的方法不行的条件下，可以考虑加入一些化学试剂，一般报道的有PEG、丁酸和多糖。
chinna wrote:
复性是一个十分复杂的过程，解决得方法也是多种多样。首先是选择合适的表达载体和表达菌株，尽量少产生包含体。可以先进行预实验确定表达条件，我建议采用正交分析法来进行。一般的我采用4因素3水平的正交实验，因素主要考虑培养温度、诱导物加入量、加入诱导物时的菌浓度和诱导时间。每个因素考虑小、中、大三个水平。我曾经使用这种方法，很好的选择了一个蛋白的表达条件，使其大部分以可溶形式表达。
再谈包含体的复性，在采用通常的方法不行的条件下，可以考虑加入一些化学试剂，一般报道的有PEG、丁酸和多糖。
这位战友说的是正确的.
但是如果表达载体和表达菌一旦确定以后,想在根据温度、IPTG等来控制包涵体的形成我想并不是很现实，因为每次你加入的母液的浓度总是不一样的，即使是做成了，这种实验的可重复性也是比较差的。因为不稳定性因素太多了，呵呵。
谢谢你们
用Trition -100可以洗涤任何包涵体吗？会不会有什么影响？
谢谢！
xzyzb wrote:
用Trition -100可以洗涤任何包涵体吗？会不会有什么影响？
谢谢！
曲拉通是一种表面活化剂，润湿及洗涤剂。
在洗涤包涵体的时候是把它当作洗涤剂来用的，也就是主要是把它当作一种去垢剂，用它来洗涤一些杂质或是分子量很大的一些杂蛋白。不能说可以洗涤任何包涵体，因为“任何”包括的太多了。但是我想绝大多数的包涵体还是可以用曲拉通来洗涤的，我也曾经试过用PBS
来当作曲拉通来洗涤，效果也还可以，所以说曲拉通的洗涤只是一个可有可无的过程，对于整个包涵体蛋白的纯化来说不是很主要的一个过程。
看了些资料，发到自己的帖子上面，呵呵。
菌体/细胞裂解法：
一、反复冻融法：
1、将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
2、至少3次以上冻溶。
3、IFCC推荐法：
收集细胞悬液，4℃低温离心（3000rpm，5min），弃上清，加入一定量PBS（200ul），轻轻吹打混匀，-200C 冷冻30 min，370C 解冻，如此反复3次，可形成细胞裂解液。步骤如下：
1）收集细胞悬液
2）40C 低温离心（3000rpm，5min）
3）弃上清，加入一定量PBS（200ul），轻轻吹打混匀，-200C 冷冻30 min，
370C 解冻，如此反复3次，可形成细胞裂解液。
4、用液氮冻融三四次就可以了，细胞冻住后，取出放37度水浴，溶解后震荡，再冻
二、超声波处理法
1、要设定好超声时间和间隙时间，一般超声时间不超过5秒，间隙时间最好大于超声时间，这些都有利于保护酶的活性。我的实验超声时间5秒、间隙时间10秒、工作次数20次。注意事项：
1）、一个细胞超声仪可以配备不同尺寸的探头，根据你实验中收集细胞的容器大小选择合适规格的探头。
2）、另外冰浴非常重要，空化效应会局部产热，从而使细胞内酶失活，所以我通常将收集细胞的离心管置于冰盒中。
3）、要设定好超声时间和间隙时间，一般超声时间不超过5秒，间隙时间最好大于超声时间，这些都有利于保护酶的活性。我的实验超声时间5秒、间隙时间10秒、工作次数20次，镜下观察细胞破碎效果很好，供参考。不同细胞实验条件得具体摸索。
4）、最后好好看仪器说明书，探头到液面下的距离及与容器底部的距离都有要求。
2、每个样本超声时间5秒,每个间隔5秒,粉碎5次。
3、100ml菌液离心，用8ml缓冲液悬浮，加8mg溶菌酶，冰浴30min，然后超声处理。750W 40％功率。5秒超声，9秒间隔。超声至少90min。超声完毕后，菌液应该是澄清的，略显油状。
4、综合冻融和超声的方法：
1500g离心，弃除上清。冰上，用小体积PBS重悬细胞。
将重悬液集中，1500g离心浓缩，弃除上清。液氮骤冷。用约5倍体积的PBS缓冲液重悬
细胞，并搅拌。
可选择：4℃下超声破碎细胞。加入终浓度为0.25M的KCl，15mM的DTT。4℃下111500g×60min离心裂解液。取出上清。过柱子。
三、渗透法：
冰冷的20 mmol/L Tris-Cl（pH8.0），2.5 mmol/L EDTA处理，冰浴放置10min。《精编分子生物学实验指南》
四、裂解液处理法：
1、细胞裂解液：50 mmol/L Tris-Cl pH 6.8，100 mmol/L DTT，2% SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油。SDS是阴离子型表面活性剂、极易促溶、强变性作用。
2、在loading buffer加SDS，100度5分钟，是变性方法。SDS与蛋白等量结合，可以通过条带位移判断蛋白大小，考染不会影响结果。
3、如果是做小量菌液，跑PAGE胶看其表达情况的话，可以直接加蛋白loading buffer 煮沸5分钟即可，需注意的是上样前要离心12000rpm至少5分钟，然后上样时，枪头别吸最底下的。
4、20毫升细胞裂解液配方:40 μL 0.5M EDTA (PH8.0)，4 ml 10% SDS，1 ml 1M Tris-cl(PH6.8)，14.96 ml 蒸馏水。可以适当加入几种蛋白酶的抑制剂，如PMSF，leupeptin等。
5、检测蛋白诱导：
从培养的不同时期各取出1ml，12000g×1min离心。将沉淀重悬于100ul 1×SDS上样缓冲液（50mM Tris-Cl（pH6.8），100mM DTT，2％SDS，0.1％溴酚蓝，10％甘油）中，100℃加热3min，然后12000g×1min离心。上样15ul，6％SDS-PAGE电泳。《分子克隆》P826
7、5-10秒离心，弃除上清，用50ul蒸馏水重悬沉淀。加入1ul PMSF，再加入50ul热的2×SDS上样缓冲液（100℃加热）。迅速混匀后100℃加热3-5min。将样品冰上放置（或-20℃放置），然后再溶解，煮沸1min。离心30秒。上样5ul进行SDS-PAGE电泳。
2×SDS上样缓冲液：250mM Tris-Cl，6.2％（w/v）DTT，8％SDS，0.002％（w/v）溴酚蓝，40％甘油。
Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli。
我看到你的这个专区很高兴，我正在做这方面的实验，有很多问题想请教你，谢谢。“Tris缓冲液：
50mM Tris
0.5mM EDTA
50mM Nacl
5%或10％甘油
如果有条件加入1％的甘氨酸或精氨酸和谷胱甘肽会更好些。也可以在其中
加入氧化还原系统，如双型谷胱甘肽、DTT等。
PH理论上是要根据你蛋白的等电点来确定的，应该是比等电点稍高一些。但是PH7.9、8.0我都试过，效果没区别。”
关于你提到的Tris缓冲液，请问我用的是20mM Tris，没有加Nacl，有影响吗？甘油有什么作用？
我的蛋白复性后上离子交换柱，无论是阴离子还是阳离子柱，都是大部分穿透，不知是不是复性效果不好造成的。
谢谢！！！急。。。
whitewater wrote:
我看到你的这个专区很高兴，我正在做这方面的实验，有很多问题想请教你，谢谢。“Tris缓冲液：
50mM Tris
0.5mM EDTA
50mM Nacl
5%或10％甘油
如果有条件加入1％的甘氨酸或精氨酸和谷胱甘肽会更好些。也可以在其中
加入氧化还原系统，如双型谷胱甘肽、DTT等。
PH理论上是要根据你蛋白的等电点来确定的，应该是比等电点稍高一些。但是PH7.9、8.0我都试过，效果没区别。”
关于你提到的Tris缓冲液，请问我用的是20mM Tris，没有加Nacl，有影响吗？甘油有什么作用？
我的蛋白复性后上离子交换柱，无论是阴离子还是阳离子柱，都是大部分穿透，不知是不是复性效果不好造成的。
谢谢！！！急。。。
请教不敢当，互相学习吧。
1、关于你提到的Tris缓冲液，请问我用的是20mM Tris，没有加Nacl，有影响吗？
我觉得影响不会很大。
因为包含体蛋白透析主要是根据透析样品中尿素的浓度差的原理来进行的。其实有文献报道透析的复性率只能达到40％（我对这个数字表示怀疑），所以我认为透析这个过程与其说是复性的过程倒不如说是个纯化的过程。
2、甘油有什么作用？
甘油在整个缓冲体系中起到的是稳定蛋白的作用。还有就是保存蛋白的作用，就像细菌保种的时候要加入甘油一样的，如果你想长时间保存就多加点甘油，如果保存时间较短就少加点。
3、我的蛋白复性后上离子交换柱，无论是阴离子还是阳离子柱，都是大部分穿透，不知是不是复性效果不好造成的。
这个我不敢说，因为在没有纯化蛋白之前我考虑了几种纯化方法，最后选择了HIS纯化柱，
没用离子交换这种方法，所以知道的不是很多。就我所知道的给您提点建议吧，希望我没有理解错。
我觉得您的这种情况肯定是跟复性的效果有关系的，而且我觉得多数是跟PH值有关，因为离子交换纯化跟缓冲液的PH值以及你蛋白的等电点有很大关系。以ph7的缓冲液为例,如果你的目标蛋白等电点小于7,呢就带负电荷,用阴离子交换的柱子,如果是大于7,那选择阳离子交换的柱子,如果等电点是7,那上样的缓冲液pH大于它的等电点用阴离子,小于7的用阳离子,如此类推就可以.
关于离子交换我只知道这么多了，呵呵。
建议你还是先看一下相关的资料和教材吧。武大赵俊芳编的＜生物化学实验技术和基本原理＞挺好挺详细的。还有一本冷泉港实验室的蛋白质提取纯化的书也挺好的。具体链接如下：>
还有，既然这种方法不理想为什么不换一种纯化方法试试呢？
谢谢20021108。
我还要摸索很多条件，谢谢你的建议。我试后再和你联系
复性成功与否，应该有特异性的方法。
总之不管是先纯化后复性，还是先复性再纯化，离子交换挂不上柱应该和复性成功与否关系不是特别大，主要原因是你的条件不合适。当然，折叠状态影响电荷分布，但不会改变的特别大。
你的等电点低，应该考虑用阴离子交换，这和你的复性buffer也比较接近。
那么你的样品电导是多少？最好不要超过5ms/cm，根据实验结果在进行调整。电导过高是binding不上的。
pH3上阳离子是不合适的。
试管试验意义不是很大，对于完全未知的蛋白，pH7.0直接挂柱，试不了几次就可以找到biniding的条件，但只是纯化的第一步，怎么分离度更好才是学问。
biosepq wrote:
复性成功与否，应该有特异性的方法。
总之不管是先纯化后复性，还是先复性再纯化，离子交换挂不上柱应该和复性成功与否关系不是特别大，主要原因是你的条件不合适。当然，折叠状态影响电荷分布，但不会改变的特别大。
你的等电点低，应该考虑用阴离子交换，这和你的复性buffer也比较接近。
那么你的样品电导是多少？最好不要超过5ms/cm，根据实验结果在进行调整。电导过高
是binding不上的。
pH3上阳离子是不合适的。
试管试验意义不是很大，对于完全未知的蛋白，pH7.0直接挂柱，试不了几次就可以找到biniding的条件，但只是纯化的第一步，怎么分离度更好才是学问。
受益匪浅！
问个关于溶解浓度的问题。
一般大致上是多少的浓度？我现在采用的浓度是1g包涵体（湿重）/ml溶解缓冲液。
jingluo wrote:
问个关于溶解浓度的问题。
一般大致上是多少的浓度？我现在采用的浓度是1g包涵体（湿重）/ml溶解缓冲液。
并无文献上说明具体的比例，说说我的供你参考。
100ml大概能得到0.03－0.05g的包涵体（每次称重都特别不好称，可能是由于每次液体吸的不干净，或是由于天平的误差)。不管得到的是多少我都是加入1.5ml的溶解液（我用的是8M的尿素）后加入15ul的DTT，然后4度过夜，或是室温5小时，效果一直很好。就这样。
我觉得如果不是GST融合蛋白都可以用8M的尿素溶解，而且加多加少不会有很大影响，我们实验室的几个人表达的蛋白都是以包涵体的形式存在的，都是用我上述的方法，效果都一样。
请教：我是用PET-HIS表达蛋白和纯化的，目的蛋白分子量大小为42KD.我是在31°
1mmol/L的IPTG诱导下表达的。表达后蛋白存在于包涵体中。我用6M尿素变性后蛋白都溶解了，然后0.45um过滤后上柱，上柱时发现有结晶析出，好奇怪啊！！我的bingding buffer里也加了6M的尿素了，Elution buffer中没加，20mM咪唑浓度洗脱的，结果什么都没有。是不是我的Elution buffer中没加尿素的缘故？还有说明书上说柱中含有尿素的话低咪唑浓度就可以洗脱了，我的咪唑浓度还需要提高吗？那位战友帮帮我啊。急！谢谢！！！！
cherry126 wrote:
请教：我是用PET-HIS表达蛋白和纯化的，目的蛋白分子量大小为42KD.我是在31°
1mmol/L的IPTG诱导下表达的。表达后蛋白存在于包涵体中。我用6M尿素变性后蛋白都溶解了，然后0.45um过滤后上柱，上柱时发现有结晶析出，好奇怪啊！！我的bingding
buffer里也加了6M的尿素了，Elution buffer中没加，20mM咪唑浓度洗脱的，结果什么都没有。是不是我的Elution buffer中没加尿素的缘故？还有说明书上说柱中含有尿素的话低咪唑浓度就可以洗脱了，我的咪唑浓度还需要提高吗？那位战友帮帮我啊。急！谢谢！！！！
战友有几个问题没有说清楚：
你说上柱时出现结晶，是什么地方出现呢？是在柱内还是在EP管中。如果我没记错的话，6M的尿素的冰点好像是－11度，这样如果避免低温的话，应该不会出现结晶。
你的binding里面加的咪唑浓度是多少，binding buffer的咪唑浓度一定要比最低的洗涤buffer的浓度低。
还有一个就是战友出现了重大错误就是在Elution buffer中没有加入尿素。虽然说咪唑和蛋白竞争柱中的镍离子从而达到纯化的目的，但是我试过如果洗涤液中不加入尿素的话而仅仅用PBS是洗不下来的，具体为什么不能理解，猜测可能是由于蛋白不能溶于其他溶液中，所以即使脱离了镍离子也不能被洗涤流出，而是短暂的脱离后又重新结合了。
镍柱纯化要利用一个咪唑剃度来洗脱目的蛋白，而不是仅仅用一个浓度的洗涤液来纯化。低浓度的咪唑是洗不下来的或者说洗下的非常少（没有结合牢固的蛋白）。所以你要加大咪唑浓度，而且要做一个剃度，看一下在哪个浓度你的目的蛋白的洗脱量达到最大而杂蛋白的洗脱量相对最小。
第二部分：蛋白的纯化 如何区分蛋白表达在上清还是包涵体？ 破碎细胞后离心分别收集上清和沉淀，表达的蛋白可能分布在上清中也有可能分布在沉淀中，还有可能是二者中都有分布。 根据我们实验室的经验，超声碎菌之后，如果菌液比较清亮，沉淀比较少，那表达的蛋白基本上是可溶的。但如果超声完之后，菌液是浑浊的，而且当离心之后，离下的沉淀比较多，而且沉淀的颜色也比较白，那基本上就是包涵体了。包涵体是基因重组蛋白在大肠杆菌中高水平表达时所形成的无活性的蛋白质聚集体，难溶于氺，可溶于变性剂如尿素，盐酸胍等，其实，包涵体也就是我们常说的不可溶蛋白。对于后者，可将上清和沉淀分别跑一个PAGE,看看上清中的量能达到多少，对于某些蛋白来说，一部分是以包涵体形式表达，一部分是以可溶的形式表达，而且量也不少，可以满足后续实验的需要，这个时候最好是纯可溶的，因为包涵体即使最后复性，活性也不太可信。 对于沉淀跑SDS-PAGE，如何处理，用什么使其溶解，还有在大肠杆菌中表达的蛋白，在提取过程中，使用什么蛋白提取缓冲液。 沉淀用Buffer B重悬，（组成：8M尿素+10mMTRIS base+100mM NaH2PO4，用NaOH调节pH到8.0),1克沉淀（湿重）加5ml Buffer B,使其充分溶解（可以放在微量震荡器上震荡20min），然后室温下12000转离心20min，留上清，弃沉淀。 取10ul上清加入10ul 2xSDS上样缓冲液，就可以跑PAGE了。 无论是纯可溶蛋白还是包涵体，在菌体裂解这一步我用的都是Lysis Buffer（组成：10mM 咪唑+300mM NaCl+50mM NaH2PO4,用NaOH调节pH到8.0)每克菌体（湿重）加2-5ml Lysis Buffer，充分悬起后，加入溶菌酶4度作用半小时就可以超声破碎了。 包涵体，简单的说就是翻译的蛋白没有正确折叠而聚集在一起形成的，主要的是疏水作用。实际上就是很多个蛋白分子，这些蛋白并不是交联在一起的，用高浓度的尿素和盐酸胍可以使他们变性，解聚。 电泳检测的话，可以用SDS-PAGE检测，在上样之前，需要用上样缓冲液处理样品，处理后，包涵体也就解聚了，每个蛋白分子与SDS结合，形成了可溶物。 包涵体是不容易破碎的，超声可以破碎菌体释放里面的包涵体，但是不能破碎包涵体；但如果用水煮的话，包涵体会变性，会有一部分可溶于水，所以你跑的上清中有可能有包涵体存在，也有可能没有包涵体； 建议： 还是先将菌体超声破碎，然后离心，取沉淀和上清再跑一次电泳，如果沉淀上清中都有你要的蛋白，说明表达的结果是部分可溶；如果仅上清有就是可溶性表达；如果仅沉淀中有，就是完全包涵体了。不过，一般情况下，应该是第一者的可能性大。
包涵体得形成以及处理方法 1包涵体形成得原因 (1)表达量过高,研究发现在低表达时很少形成包涵体,表达量越高越容易形成包涵体L２]。原因可能就是合成速度太快,以至于没有足够得时间进行折叠,二硫键不能正确配对,过多蛋白间得非特异性结合,蛋白质无法达到足够得溶解度等。(2)重组蛋白就是大肠杆菌得异源蛋白,真核糖蛋白无法糖基化使中问体溶解度下降,导致不溶解包涵体形成］。(3)重组蛋白分泌序列得存在阻碍折叠,导致错误折叠分子得产生。(４)重组蛋白得氨基酸组成,一般来说含硫氨基酸越多越容易形成包涵体。(５)包涵体形成动力学研究表明,包涵体就是由部分变性得中阃体聚合而成。因此,任何影响中间体稳定得因素,如pH值(ｐＨ接近蛋白得等电点时容易形成包涵体)离子强度与温度都可以引起蛋白聚合反应。(6)在细菌分泌得某个阶段,蛋白质分子间得离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体得形成、(７)有报道认为,丰富得培养基有利于活性蛋白质得表达,当培养条件不佳时,容易形成包涵体？。 包涵体得处理 包涵体得形成具有有利得一面,也有不利得一面、有利得一面就是包涵体得形成去除了几乎全部得细胞内可溶性蛋白质。同时,因包涵体形成避免了蛋白水解酶对表达产物得降解而大大提高产率,通常其表达量可占菌体总蛋白得１0％～30％,甚至高达５0％。不利得一面就是溶解包涵体进行复性折叠得过程中需要加变性剂与去垢剂,而引起蛋白质得不可逆修饰以及性质改变,这些试剂价格昂贵,且复性得操作过程不好控制;另一方面复性过程常伴有蛋白质水解与沉淀,有些还形成异构体【s] ５。因此复性就是蛋白质工程中最关键、最复杂得问题。
包涵体得处理一般有如下几个步聚。 破碎细菌细胞 提取包涵体时,首先要裂解细菌,为了防止在裂解细菌得过程中目得蛋白质变性,常常采取一些保护措施:合适得缓冲体系,如磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、柠檬酸缓冲液;加 入保护剂,如还原剂DTT(２一巯基苏糖醇)、２一巯基乙醇;加防止水解酶作用得试剂,如酶得抑制剂、EDTA(乙二胺四乙酸)。破菌得方法很多,主要包括以下几种:(１)渗透破碎法: 这种方法就是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。(2)冷热交替法:把待碎样品投人90℃左右水中维持数分钟后取出投入冰浴内,可使大部分细胞破碎、可用于提取蛋白质与核酸。 (3)反复冻融法:把待碎样品冷却到一2Ｏ℃,冻固后取出,缓慢解冻,如此反复操作,细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破导致部分细胞及胞内得颗粒破碎,但也可使生物活性物质失活。这种方法虽简单方便,但对温度变化敏感得蛋白质却不宜采用。(4)超声波法:使用超声波仪使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎、根据不同待碎样品采用不同频率,不同时间;另外,超声波处理时溶液温度升高会使不耐热得物质失活,因此使用时为防止温度升高,除间歇开机外,还需人工降温、避免溶液内存在气泡,这样会使蛋白质变性【６】。(5)溶菌酶处理法:多用于破坏大肠杆菌等微生物得细胞壁、在每毫升含2亿个细胞得悬液中加1０0 g至1 mg溶菌酶,37℃保温１0 min,或者室温作用30 ｍｉｎ,细胞就破坏了、 洗涤包涵体 洗涤包涵体前先8000 r/rａin,412离心15 ｒaｉn,可使大多数包涵体沉淀,
包涵体的纯化和复性总结（二） 关于包涵体的纯化是一个令人头疼的问题，包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化，内容比较庞杂 一、菌体的裂解 1、怎样裂解细菌？ 细胞的破碎方法 1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。 3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG 频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。 4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。 这是标准配方: 裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-1 00, 1mg/ml溶菌酶。(溶菌酶在这个pH范围内比较好发挥作用) 但我个人的经验是:如果你裂解细菌是为了提取蛋白的话,而且蛋白的分子量又小于20kd的话,尽量减少溶菌酶的用量,会引入溶菌酶这种杂蛋白.一般配60ml裂解液用药匙匙柄盛一点就够.判断裂解好坏的标准是,溶液很粘. protocol是10ml-50ml缓冲液(菌体洗涤液,裂解液等)/1g湿菌体. 如果只做一个鉴定,我觉得100-200ml菌就够了. 但凡超声,我都用60ml裂解液,因为我们的超声仪(现代分子生物学实验技术录象里的那种)很适合用100ml小烧杯,装60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会冒泡泡,也不会洒出来.菌多我就延长超声时间. 沉淀,也就是包涵体沉淀了,如果要上柱纯化,一定要先用4M尿素洗涤一下再用8M尿素溶解.如果不上柱,只是跑跑电泳,可以直接用8M尿素溶解以后,离心取上清,加入适量体积的load ing buffer.loading buffer对于包涵体的溶解能力是较弱的. "取200微升菌液，离心后直接加上样buffer，100度3分钟后上样，然后SDSPAGE. 这个方法到底能不能溶解细菌中的包涵体? " 而楼主的问题,虽然loading buffer对于包涵体的溶解能力是较弱的,但是我觉得你的做法只是在鉴定有无表达,用loading buffer是没有问题的.
包涵体： 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。 包涵体的组成与特性： 一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF 和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶与水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。 包涵体的形成： 主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。 1、表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。 2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。 3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。 4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。 包涵体表达的有利因素： 1、可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。 2、降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高。 3、包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化。 4、对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与细胞膜碎片分离。 破菌： 1、机械破碎 2、超声破碎 3、化学方法破碎 分离： 1、离心：5000-20000g15min离心，可使大多数包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。 2、过滤或萃取方法： 洗涤： 由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一起，在溶解包涵体之前要先洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂如2M尿素在50mM TrispH7.0-8.5左右,1mMEDTA中洗涤。此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。 溶解：
一、包涵体的纯化和复性总结（二） 二、[ 2008-2-25 14:25:00 | By: 飞鸿 ] 三、关于包涵体的纯化是一个令人头疼的问题，包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化，内容比较庞杂 一、菌体的裂解 1、怎样裂解细菌？ 细胞的破碎方法 1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。 3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。 4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等
细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。 这是标准配方: 裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 1mg/ml 溶菌酶。(溶菌酶在这个pH范围内比较好发挥作用) 但我个人的经验是:如果你裂解细菌是为了提取蛋白的话,而且蛋白的分子量又小于20kd的话,尽量减少溶菌酶的用量,会引入溶菌酶这种杂蛋白.一般配60ml裂解液用药匙匙柄盛一点就够.判断裂解好坏的标准是,溶液很粘. protocol是10ml-50ml缓冲液(菌体洗涤液,裂解液等)/1g湿菌体. 如果只做一个鉴定,我觉得100-200ml菌就够了. 但凡超声,我都用60ml裂解液,因为我们的超声仪(现代分子生物学实验技术录象里的那种)很适合用100ml小烧杯,装60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会冒泡泡,也不会洒出来.菌多我就延长超声时间. 沉淀,也就是包涵体沉淀了,如果要上柱纯化,一定要先用4M尿素洗涤一下再用8M尿素溶解.如果不上柱,只是跑跑电泳,可以直接用8M尿素溶解以后,离心取上清,加入适量体积的loading buffer.loading buffer对于包涵体的溶解能力是较弱的. "取200微升菌液，离心后直接加上样buffer，100度3分钟后上样，然后SDSPAGE. 这个方法
随着分子生物学的发展，越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术，并研制成套试剂盒，使基因克隆表达变得越来越容易lIl。但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的，分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物，以研究其生物学作用，或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。相对与上游工作来说，分子克隆的下游工作显得更难，蛋白纯化工作非常复杂，除了要保证纯度外，蛋白产品还必须保持其生物学活性。纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白，重复性良好。这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败，因为后者要求规模化，且在每日的应用中要有很好的重复性。本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性，以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导。 1 蛋白纯化的一般原则 蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速，颗粒大、粒径分布宽．并可 以迅速将蛋白与污染物分开，防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨常用的离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。选择性指树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指蛋白的各成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。 2.各种蛋白纯化方法及优缺点 2.1蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸。在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或特别低，蛋白则倾向于从溶液中析出。硫酸铵是沉淀蛋白质最常用的盐，因为它在冷的缓冲液中溶解性好，冷的缓冲液有利于保护蛋白的活性。硫酸铵分馏常用做纯化的第一步，它可以初步粗提蛋白质，去除非蛋白成分。蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定，可以短期在这种状态下保存中间产物，当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题，硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。其他的盐如硫酸钠不存在这种问题，但其纯化效果不如硫酸铵。除了盐析外蛋白还可以用多聚物如PEG 和防冻剂沉淀出来，PEG是一种惰性物质，同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果， 在缓慢搅拌下逐渐提高冷的蛋白溶液中的PEG浓度，蛋白沉淀可通过离心或过滤获得，蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法，因为它只能达到几倍的纯化效果，而我们在达到目的前需要上千倍的纯化。其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱出来。
包涵体纯化方案 缓冲液配方： 1.变性复性缓冲液 缓冲液A：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA①, 100mM NaCl②,1%Triton X-100③ 缓冲液B：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA, 100mM NaCl，1%Triton X-100，2M脲素④ 缓冲液C：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA, 100mM NaCl，1%Triton X-100 缓冲液D：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA, 100mM NaCl，1%Triton X-100，2M盐酸胍④ 溶解缓冲液E：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA, 100mM NaCl，10mM β-巯基乙醇/DTT⑤，2mM脱氧胆酸钠⑥， 8M脲素 复性缓冲液：50mM Tris-HCl (pH8.5)，100mM NaCl ，6M/4M/2M脲素,1%甘氨酸⑦，5%甘油⑧，0.2%PEG⑨，1mM氧 化型谷胱甘肽，1mM还原型谷胱甘肽⑩ 2.纯化缓冲液 Binding buffer：50mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 10mM 咪唑，pH8.5
Elution buffer：50mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 不同浓度梯度咪唑, pH8.5 具体实施步骤： 1.大量诱导表达的菌液7000rpm离心10min。弃上清，用1×PBS重悬，洗涤菌体细胞，7000rpm，离心10min。再用PBS重复洗一遍。离心后留菌体沉淀。 2.将菌体细胞用缓冲液A重悬，液氮中反复冻融后，超声破碎。13000rpm 离心10min，弃上清，收集包涵体沉淀。 2.分别用缓冲液B、C、D超声清洗包涵体沉淀。13000rpm离心10min 收集沉淀。 3.用缓冲液E溶解包涵体，缓慢摇动使其缓慢溶解，室温放置30min，然后13000rpm离心10min。取上清。 4.将上清稀释至0.1-1.0mg/ml，装入透析袋中，放置于梯度复性缓冲液中，4℃缓慢透析24-36h。最后在纯化binding buffer中透析，确保蛋白稳定可溶。 5.对溶解的包涵体蛋白进行亲和层析。 附注： ①EDTA防止蛋白降解 ②NaCl一定的盐离子可降低某些带电基团间的斥力 ③Triton X-100除去其他细菌成分，如膜外蛋白，质粒DNA和其他杂质 ④脲素，盐酸胍，洗掉包涵体表面的不溶性杂蛋白
包涵体蛋白的分离纯化 赵玲0743085096 包涵体是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与胞质中其他成分有明显区别。包涵体形成是比较复杂的，与胞质内蛋白质生成速率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体；此外，包涵体的形成还被认为与宿主菌的培养条件，如培养基成分、温度、pH 值、离子强度等因素有关。细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在，功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。包涵体的主要成分就是表达产物，其可占据集体蛋白的40%~95%,此外，还含有宿主菌的外膜蛋白、RNA聚合酶、RNA、DNA、脂类及糖类物质，所以分离包涵体后，还要采用适当的方法（如色谱法）进行重组蛋白质的纯化。 1. 包涵体的形成 重组蛋白不论在原核细胞还是真核细胞中表达时,都可形成包涵体。通常所说的包涵体是指重组蛋白在大肠杆菌中高效表达时形成的无活性蛋白聚集体,一般含有50%以上重组蛋白,其余为核糖体组分、RNA聚合酶,外膜蛋白等杂蛋白,以及质粒DNA、RNA片断、脂质、肽聚糖、脂多糖等成分]。由于包涵体在相差显微镜下为黑色斑点, 所以也称为折射体。包涵体形成的原因主要有以下几点: ⑴蛋白合成速度太快,以致于没有足够的时间进行折叠。蛋白折叠的动力学模型表明:蛋白质天然构象形成的速率取决于肽链的合成速率、折叠速率和聚集速率几个因素。中间体正确折叠是分子内的一级反应,而中间体的聚集是发生在分子间的二级或高级反应,因此,折叠中间体的浓度对聚集反应影响非常大];⑵重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白,由于缺少真核生物的翻译后修饰系统(如糖基化等) ,致使中间体大量积累,容易形成包涵体;⑶培养条件不佳和重组蛋白所处的环境也可导致包涵体形成,如发酵温度高,胞内pH 接近蛋白的等电点等;⑷二硫键在蛋白折叠中有重要作用,而大肠杆菌胞内的还原环境不利于二硫键的形成;⑸包 涵体不溶可能由于分子间无活性的β2片层含量高于天然结构或盐沉淀蛋白。包涵体蛋白虽然不具有天然
板块一、大肠杆菌 （这里讨论的大肠杆菌为非分泌到培养基中的重组蛋白，是否有重组蛋白分泌到培养基中的工程菌我没有见过。） 一、关于菌体的量 大肠杆菌表达的基因工程蛋白是纯化人员最方便获得的原料，对纯化工艺开发来说几乎没有原料方面的限制。常看到有战友用个几毫升的菌液去做纯化，对此我十分不解，同样要做，为什么不多做点呢？很少的菌体会给纯化带来一些难以估计的问题，工艺的重复性和放大往往出现问题。因此，要做个好工艺就多发酵表达一些菌体吧。我做纯化时，初始工艺摸索用的菌体量一般为10g左右。 二、关于是否包涵体表达 包涵体的定义我就不讲了。我要讲的是，一个基因工程蛋白是否是包涵体表达的说法本身就不完全准确。至于包涵体在电镜下的晶体颗粒表现等等对我们纯化来说毫无意义，我相信做纯化工艺的人没有谁去看这个电镜，也不关心。我们判断的依据只是SDS-PAGE，目的蛋白在破菌沉淀中，我们就认为是包涵体表达，但这是一个似是而非的结论。看着没问题，实际上是有毛病的。关键在于你用的是什么破菌缓冲液！有些蛋白在用缓冲液A破菌时是在破菌沉淀中，而用缓冲液B破菌时却在破菌上清中。缓冲液A和B的差别可能只是pH上相差1-2个单位。那么它是包涵体表达还是可溶上清表达呢？ 说这个问题主要在于有些战友往往非常在意他的目标蛋白是否包涵体表达。
甚至还有包涵体表达就用专门的包涵体蛋白纯化方法等等。 我们应该关心的是目标蛋白在什么缓冲体系下是可溶的，在什么缓冲体系下是不溶的！不要让包涵体这个概念给你误导。 三、关于表达量 我们常常在发表的文章上看到，我这个工程菌的目标蛋白的表达量达到菌体总蛋白的30%、50%等等。我要说都是文章的作者在忽悠。不知道他们是如何定量的，用的最多的大概就是SDS-PAGE的扫描分析吧。且不说一个SDS-PAGE不能表现出所有的菌体蛋白，电泳的染色方法、染色脱色强度、照片的曝光强度、扫描分析时的条带选择等等无不对这个百分比影响巨大。在公司的QC部门做的对此应该最有体验，20%的条带要它变成30%又有何难？我的观点是对待表达量的描述不可定量，只能定性。如用：很低、较低、中等、较高、很高等来描述。 有一个指标与表达量密切相关，那就是单位体积的菌体量。两者的乘积才是单位体积发酵液的目标蛋白产率。 与表达量相关的指标还有纯化倍数、纯化收率等，这些指标我们也常常在发表的文章中看到。同样，我也认为都是不准确的。除非你用的是活性测定的方法，用蛋白活性收率来表征。 纯化工艺的难易有时候也与表达量相关，表达量高时往往纯化也方便的多。所以，尽量提高你的目标蛋白表达量不只是基因工程上游和产量的问题，还是纯化工艺开发的问题。 四、菌体破碎
包涵体的纯化和复性总结 二、包涵体的洗涤? 1、包涵体的洗涤问题? 通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。? 包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。 此外刚处理完的包涵体好溶解。冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。? 2、如何得到比较纯的包涵体? 对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。 包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和?NP40等加EDTA 和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50?mM?NaCL。这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。EDTA为0.1-0.3?mM。去垢剂如Triton?X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp?T(37?KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。? 对于尿素和盐酸胍的选择： 尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。 盐酸胍溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰。但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。? 包涵体最后的纯化，一般是离子交换，疏水，或者是亲和层析，亲和层析尤其是金属螯合层析用得比较广泛，而纯化的效果也不错，通常是一步就能达到纯度为95%以上的包涵体。? 8M高浓度尿素溶解后离心获得的包涵体溶解液，放在4度冰箱过夜后出现沉淀，这种现象我也在实验中遇到过;开始感觉很奇怪，后来发现是我们的冰箱的温控出了问题实
蛋白质纯化的方法选择 随着分子生物学的发展，越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术，并研制成套试剂盒，使基因克隆表达变得越来越容易。但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的，分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物，以研究其生物学作用，或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。相对与上游工作来说，分子克隆的下游工作显得更难，蛋白纯化工作非常复杂，除了要保证纯度外，蛋白产品还必须保持其生物学活性。纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白，重复性良好。这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败，因为后者要求规模化，且在每日的应用中要有很好的重复性。本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性，以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导。 1、蛋白纯化的一般原则 蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速，颗粒大、粒径分布宽．并可以迅速将蛋白与污染物分开，防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨率，常用离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。选择性树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指各蛋白成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。 2、各种蛋白纯化方法及其优、缺点 2．1 蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸，在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或者特别低，蛋白则倾向于从溶液中析出。硫酸铵是沉淀蛋白最常用的盐，因为它在冷的缓冲液中溶解性好，冷的缓冲液有利于保持目的蛋白的活性。硫酸铵分馏常用作试验室蛋白纯化的第一步，它可以初步粗提蛋白质，去除非蛋白成分。蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定，可以短期在这种状态下保存中间产物，当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题，硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。其他的盐如硫酸钠不存在这种问题，但其纯化效果不如硫酸铵。除了盐析外蛋白还可以用多聚物如PEG和防冻剂沉淀出来，PEG是一种惰性物质，同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果，在缓慢搅拌下逐渐提高冷的蛋白溶液中的PEG浓度，蛋白沉淀可通过离心或过滤获得，蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法，因为它只能达到几倍的纯化效果，而我们在达到目的前需要上千倍的纯化。其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱出来。 2．2 缓冲液的更换虽然更换缓冲液不能提高蛋白纯度，但它却在蛋白纯化方案中起着极其重要的作用。不同的蛋白纯化方法需要不同pH及不同离子强度的缓冲液。假如你用硫酸铵将蛋白沉淀出来，毫无疑问蛋白是处在高盐环境中，需要想办法脱盐，可用的方法有利用半透膜透析，通过勤换透析液体去除盐分，此法尚可，但需几个小时，通常要过夜，也难以用于大规模纯化中。新型的设备将透析膜夹在两个板中间，板的一侧加缓冲液，另一侧加需脱盐的蛋白溶液，并在蛋白溶液一侧通过泵加压，可以使两侧溶液在数小时内达到平衡，若增加对蛋白溶液的压力，还可迫使水分和盐更多通过透析膜进入透析液达到对蛋白浓缩的目的。也有出售的脱盐柱，柱内的填料是小孔径的颗粒，蛋白分子不能进入孔内，先于高浓度盐离子从柱中流出，从而使二者分离。蛋白纯化的每一步都会造成目的蛋白的丢失，缓冲液平衡的步骤尤甚。蛋白会结合在任何它能接触的表面上，剪切力、起泡沫和离子强度的快速变化很容易让蛋白失活。 2．3 离子交换色谱这是在所有的蛋白纯化与浓缩方法中最有效方法。基于蛋白与离子交换树脂间的相互电荷作用，通过选择不同的缓冲液，同一种蛋白既可以和阴离子交换树脂（能结合带负电荷的分子）结合，也可以和阳离子交换树脂结合。树脂所用的带电基团有四种：二乙基氨基乙基用于弱的阴离子交换树脂；羧甲基用于弱的阳离子交换树脂；季铵用于强阴离子交换树脂；甲基磺酸酯用于强阳离子交换树脂。蛋白质由氨基酸组成，氨基酸在不同的pH环境中所带总电荷不同。大多数蛋白在生理pH（pH6～8）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，极端的pH下蛋白会变性失活．应尽量避免。由于在某个特定的pH下不同的蛋白所带电荷数不同，与树脂的结合力也不同，随着缓冲液中盐浓度的增加或pH的变化，蛋白按结合力的强弱被依次洗脱。在工业化生产中更多地是改变盐浓度而不是去改变pH值，因为前者更容易控制。在实验室中几乎总是用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。但在工业生产中盐浓度很难精确控制，所以常用分步洗脱而不足连续升高的盐梯度。与排阻层析相比，离子交换特异性更好，有更多的参数可以调整以获得最优的纯化效果，树脂也比较便宜。值得一提的是，即便是用最精确控制的条件，仅用离子交换单一的方法也得不到纯的蛋白，还需要其他的纯化步骤。
包涵体纯化方案 缓冲液配方： 1.变性复性缓冲液 缓冲液A ：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA ①, 100mM NaCl ②,1%Triton X-100③ 缓冲液B ：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA, 100mM NaCl ，1%Triton X-100，2M 脲素④ 缓冲液C ：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA, 100mM NaCl ，1%Triton X-100 缓冲液D ：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA, 100mM NaCl ，1%Triton X-100，2M 盐酸胍④ 溶解缓冲液E ：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA, 100mM NaCl ，10mM β-巯基乙醇 /DTT ⑤，2mM 脱氧胆酸钠⑥，8M 脲素 复性缓冲液：50mM Tris-HCl (pH8.5)，100mM NaCl ，6M/4M/2M 脲素,1%甘氨酸⑦， 5%甘油⑧，0.2%PEG ⑨，1mM 氧化型谷胱甘肽，1mM 还原型谷胱甘肽⑩ 2.纯化缓冲液 Binding buffer ：50mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 10mM 咪唑，pH8.5 Elution buffer ：50mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 不同浓度梯度咪唑, pH8.5 具体实施步骤： 1.大量诱导表达的菌液7000rpm 离心10min 。弃上清，用1×PBS 重悬，洗涤菌体细胞，7000rpm ，离心10min 。再用PBS 重复洗一遍。离心后留菌体沉淀。 2.将菌体细胞用缓冲液A 重悬，液氮中反复冻融后，超声破碎。13000rpm 离心10min ，弃上清，收集包涵体沉淀。
包涵体纯化蛋白复性的方法操作流程返回：包涵体复性常见问题分析与解决 包涵体的纯化和复性总结 包涵体折叠复性的方法应具备以下几个特点：较高的活性蛋白质回收率；复性产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后能够得到较高浓度的蛋白；折叠复性方法易于放大等。蛋白复性的过程通常分为以下几个步骤： 包涵体的洗涤 包涵体在溶解之前需要进行洗涤，包涵体中主要含有重组蛋白，但也有一些杂质，如一些外膜蛋白、质粒DNA等，这些杂质会与包涵体粘连在一起，可以通过洗涤去除大多数杂质，但无法将杂蛋白去除干净。 包涵体的洗涤通常选用浓度较低的变性剂，如2M尿素在50mM Tris， pH7.0-8.5，1mM EDTA中洗涤包涵体。此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。同时，因为去垢剂的洗涤能力会随溶液离子强度升高而加强，所以在洗涤包涵体时可加入低浓度的尿素或高浓度的NaCl，使包涵体的纯度达到50%以上。 包涵体的溶解 变性剂如尿素、盐酸胍，主要是通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白分子间的各种化学键，使多肽延伸。盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能溶解尿素不溶的包涵体。SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等也可以破坏蛋白内的疏水键，溶解一些包涵体蛋白质。 另外，从某些含有半胱氨酸的蛋白质中分离出的包涵体，通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键，这就还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸等。这种还原性试剂能够同半胱氨酸形成各种二硫化物中间体，也会被复性用的二硫化物置换试剂所取代。二硫键的形成和断裂是可逆的，直到最有利的蛋白二硫键形成，这个平衡才会被破坏。
分离纯化某一特定蛋白质的一般程序可以分为前处理、粗分级、细分级三步。 1.前处理：分离纯化某种蛋白质，首先要把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来并保持原来的天然状态（如果做不到呢？比如蛋白以包涵体形式存在），不丢失生物活性。为此，动物材料应先提出结缔组织和脂肪组织，种子材料应先去壳甚至去种皮以免手单宁等物质的污染，油料种子最好先用低沸点（为什么呢）的有机溶剂如乙醚等脱脂。然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆机破碎或用超声波处理破碎。植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般需要用石英砂或玻璃粉和适当的提取液一起研磨的方法或用纤维素酶处理也能达到目的。细菌细胞的破碎比较麻烦，因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一个借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。破碎细菌细胞壁的常用方法有超声波破碎，与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理等。组织和细胞破碎后，选择适当的缓冲液把所要的蛋白提取出来。细胞碎片等不溶物用离心或过滤的方法除去。 如果所要的蛋白主要集中在某一细胞组分，如细胞核、染色体、核糖体或可溶性细胞质等，则可利用差速离心的方法将它们分开，收集该细胞组分作为下步纯化的材料。如果碰上所要蛋白是与细胞膜或膜质细胞器结合的，则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚，然后用适当介质提取。 2. 粗分级分离：当蛋白质提取液（有时还杂有核酸、多糖之类）获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白与其他杂蛋白分离开来。一般这一步的分离用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白溶液。有些蛋白提取液体积较大，又不适于用沉淀或盐析法浓缩，则可采用超过滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥或其他方法进行浓缩。 3.细分级分离：样品经粗分级分离以后，一般体积较小，杂蛋白大部分已被除去。进一步纯化，一般使用层析法包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择电泳法，包括区带电泳、等电点聚焦等作为最后的纯化步骤。用于细分级分离的方法一般规模较小，但分辨率很高。 结晶是蛋白质分离纯化的最后步骤。尽管结晶过程并不能保证蛋白一定是均一的，但是只有某种蛋白在溶液中数量上占有优势时才能形成结晶。结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，而重结晶又可除去少量夹杂的蛋白。由于结晶过程中从未发现过变性蛋白，因此蛋白的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。 蛋白质分离纯化的方法： 一、根据分子大小不同的纯化方法 1、透析和超过滤 2、密度梯度离心 3、凝胶过滤 二、利用溶解度差别的纯化方法 1、等电点沉淀和pH控制 2、蛋白质的盐析和盐溶 3、有机溶剂分级分离法 4、温度对蛋白质浓度的影响 三、根据电荷不同的纯化方法
包涵体洗涤液I 50 mmol/L Tris-HCl（pH8.0） 100 mmol/L NaCl 10 mmol/L EDTA（pH8.0） 0.5% (v/v) TritonX-100 包涵体洗涤液II 包涵体洗涤液I 2 mol/L尿素 包涵体洗涤液III（pH9.0） 包涵体洗涤液I 4 mol/L尿素 包涵体溶解液 50 mmol/L Tris-HCl（pH9.0~10.0） 100 mmol/L NaCl 1 mmol/L EDTA（pH8.0） 0.5%(v/v) TritonX-100 8 mol/L尿素 5 mmol/L DTT 包涵体复性缓冲液（pH 8.0） 1× PBS 1 mmol/L EDTA（pH 8.0） 2.2.2.6 VP1重组蛋白的纯化回收 2.2.2.6.1 包涵体洗涤 按最佳条件诱导表达基因工程重组菌400 mL，离心收集菌体。冰浴中进行超声裂解，裂解后离心收集沉淀。将沉淀悬浮于9倍体积的包涵体洗涤液I中，混匀后室温放置5~10 min，4℃ 12000 r/min离心20 min，分别收集上清与沉淀。接着，再将沉淀悬浮于9倍体积的包涵体洗涤液II中，混匀后室温放置5~10 min，同样12000 r/min离心20 min后收集上清与沉淀。最后将沉淀悬浮于9倍体积的包涵体洗涤液III中，混匀后室温放置5~10 min，4℃ 12000 r/ min离心20 min后收集上清与沉淀。取少量的洗涤上清和重悬的沉淀进行SDS-PAGE电泳，检查包涵体的洗涤情况。 2.2.2.6.2 包涵体溶解 用包涵体溶解液溶解沉淀，初始体积为100 mL的诱导菌约用10 mL包涵体溶解液溶解，室温作用1~2 h，其间不断振荡。4℃ 12000 r/min离心20 min后收集上清和沉淀。取少量溶解上清和重悬的沉淀进行SDS-PAGE电泳，检查包涵体的溶解情况。 2.2.2.6.3 包涵体的复性 将溶解的包涵体上清装入已处理的透析袋内，置复性缓冲液中4℃条件下进行梯度透析，复性缓冲液中尿素浓度依次递减4.5 mol/L、3.5 mol/L、2.5 mol/L、1.5 mol/L、0.5 mol/L和0 mol/L，（ 6M 4M 2M 0M PBS H2O）换液间隔时间为10~12 h。取出透析后的蛋白溶液于4℃ 12000 r/min离心20 min，收集上清。分别取少量的上清和重悬的沉淀进行SDS-PAGE电泳，检查包涵体的复性情况。 2.2.2.6.4 SDS-PAGE电泳及电洗脱 参照分子克隆实验指南的方法配制12%的分离胶，按Bio-RAD产品说明书装好制胶板，加入分离胶（使梳子到胶面的距离约1 cm），胶面上加一层水，室温放置待胶充分聚合后吸干水份，加入配好的浓缩胶，装上梳子，胶充分聚合后拔出梳子即可上样进行电泳。收集复性后的包涵体加入等体积2×SDS上样缓冲液，混匀，煮沸5 min，12000 r/min离心2 min，取上清10 上样，同时设标准蛋白对照孔。恒压130 V电泳1~1.5 h，电泳完毕后用适量染色液