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绪论1、细胞工程：是按照一定的设计方案，通过在细胞、亚细胞或组织水平上进行实验操作，获得重构的细胞、组织、器官以及个体，创造优良品种和产品的综合性生物工程。
按生物类型可以分为：动物细胞工程、植物细胞工程和微生物细胞工程。
按实验操作对象可以分为细胞与组织培养、细胞融合、细胞核移植、染色体操作、转基因生物等。
2、细胞培养和组织培养都属于体外培养，是指生物细胞和组织在离体条件下的生长和增殖3、细胞溶和：又称细胞杂交，是指两个或两个以上的细胞融合形成一个细胞的过程。
在自然情况下细胞发生融合的现象称为自然融合，用人工方法使细胞间发生融合称为人工诱导融合。
4、细胞核移植：是利用显微操作技术将细胞核与细胞质分离，然后再将不同来源的核与质重组，形成杂合细胞。
5、染色体工程：是把单个的染色体或染色体组转入或移出受体细胞，从而形成新的染色体组合和遗传构成。
6、胚胎工程：是以生殖细胞和胚胎细胞为对象进行的细胞工程操作，主要包括体外受精、胚胎移植、胚胎切割。
7、干细胞与组织工程：干细胞是动物体内具有分化潜能、并能自我更新的细胞，分为胚胎干细胞、组织干细胞。
8、转基因动物：是通过基因工程技术将外源的目的基因导入生殖细胞或早期胚胎，并整合到受体细胞的基因组中，经发育形成所有细胞都包含目的基因的动物个体。
将目的基因在器官或组织中进行特异性高表达的转基因动物称为动物生物反应器。
9、转基因植物：通过基因工程技术将外源的目的基因导入植物细胞后直接进行诱导培养就可以再生出转基因植株。
10、1839年施旺和施莱登建立了细胞学说。
1902年Haberlandt提出了细胞全能学说。
1907年Harrison创立了动物组织培养技术。
Okata于1962年发现仙台病毒可诱发艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞体。
第一只转基因动物是Gordon通过向小鼠的单细胞胚胎的原核注射纯化的DNA后获得。
第一章细胞工程简介第一节生物工程生物工程（生物技术）是以生物科学为基础，利用生物个体或生物器官、组织、细胞的特性和功能，设计构建具有预期性状的新物种或新品系（包括细胞系），以及与工程原理相结合进行产品加工生产的综合性技术体系。
3生物技术的内涵主要是：运用现代生物学理论与科学技术改造细胞的遗传物质，培育出人们需要的生物新品种；工业规模地利用现有生物体系，制备生物产品；模拟生物体系，以生物化学工程代替化学工程，制备工业产品；发展相应的科学理论与工程技术。
4主要技术范畴包括：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、蛋白质工程以及生化工程。
现代生物技术特征：多学科性；商业性；规模化。
5基因工程即重组DNA技术，指根据人们的意愿对不同生物的遗传基因进行切割、拼接或重新组合，再转入生物体内产生出人们所期望的产物，或创造出具有新遗传性状的生物类型的一门技术。
细胞工程细胞工程是根据细胞生物学和分子生物学原理，采用细胞培养技术，在细胞水平进行的遗传操作。
细胞工程大体可分染色体工程、细胞质工程和细胞融合工程。
1、细胞培养技术2、细胞核移植技术3、细胞融合技术13酶工程利用酶的催化作用，采用适当的生物反应器工业化的生产人类所需要的产品或是达到某一特殊目的的一种生物技术。
应用：天然酶的分离纯化及鉴定和生产酶的固化技术酶生物反应器的研制和应用14发酵工程指利用微生物的特定性状，通过现代工程技术，在生物反应器中生产有用物质的一种技术。
16蛋白质工程利用生物技术手段对蛋白质的DNA编码序列进行有目的的改造，并分离、纯化蛋白质，从而获取自然界没有的、具有优良性质或适用于工业生产条件的全新蛋白质。
17生物化学工程主要研究将生物技术的实验室研究成果转化为生产过程中的带有共性的工程技术问题。
18第二节细胞工程一、概念细胞工程（cell engineering ）是应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工程学的试验方法或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法的学科。
细胞培养相关知识点
细胞培养是指将细胞从体内或体外来源中采集到培养基中，通过提供合适的营养物质和环境条件使其在体外无限制地生长和繁殖的一种生物学实验技术。
常见的细胞培养技术包括原代细胞培养和细胞系培养。
1. 培养基：细胞培养中使用的培养基是包含多种营养物质的液体或固体培养基。
常见的培养基种类包括DMEM、RPMI-1640、MEM等，并根据细胞的类型和特殊需要进行相应的改制。
2. 细胞分离：通过一系列的操作将组织中的细胞分离出来，常用的方法有机械剪切、酶消化和离心等。
3. 细胞传代：细胞的传代是指将细胞从旧的培养皿中转移到新的培养皿中，以保持细胞的生长状态和增殖能力。
细胞传代的方法有裂解法、胶原酶法和选择性黏附法等。
4. 培养条件：细胞的生长需要适宜的温度、湿度、pH值和气体环境。
常见的培养条件为37℃、5% CO2和95%湿度。
5. 防止细胞污染：细胞培养中常见的污染源有细菌、真菌和支原体等。
常用的防止污染的方法包括消毒培养器具和介质、使用无菌操作等。
6. 细胞检测：常用的检测方法包括细胞形态观察、细胞数量计
数、细胞活力测定、染色体核型分析和细胞分化等。
7. 细胞培养的应用：细胞培养技术在生物医学研究中有广泛的应用，如药物筛选、疾病模型建立、组织工程和基因工程等。
注：以上所列举的知识点为细胞培养的基本内容，具体的细胞培养操作方法和技巧可根据具体实验需求和细胞类型进行进一步学习。
细胞培养设计知识点细胞培养是生物学和医学领域中的一项重要技术，它是指将细胞体外培养，并为其提供必需的条件来生长、繁殖和维持特定功能。
细胞培养的设计是成功进行细胞培养实验的关键，下面将从培养基的选择、细胞传代、处理细胞的方法以及细胞培养的环境控制等方面介绍细胞培养设计的相关知识点。
一、培养基的选择培养基是细胞培养中最重要的基础，它提供了细胞所需的营养物质、生长因子和环境条件。
培养基的选择应根据具体实验目的来确定。
常见的培养基包括DMEM、RPMI-1640、MEM等，不同类型的细胞常使用不同的培养基。
此外，还需要添加适当的血清、抗生素和缓冲剂等，以确保细胞的正常生长。
二、细胞传代细胞传代是指将细胞从一种培养器皿转移至另一种培养器皿中，以维持细胞生长和细胞系的延续。
在细胞传代中，需要注意以下几个知识点：1. 细胞密度：细胞密度应适当，过低会延长细胞生长周期，过高会导致细胞死亡和凋亡。
通常，当细胞生长至80%至90%的密度时进行传代较为适宜。
2. 去除培养容器中的血清：在细胞传代前，应将培养容器中的血清彻底去除，以免对细胞的生长产生影响。
3. 使用胰蛋白酶消化细胞：胰蛋白酶可以帮助将细胞从培养容器表面解离下来，以进行传代。
消化时间和使用的浓度需要根据不同的细胞类型进行调整。
4. 倍液和重新分装：将胰蛋白酶消化的细胞与新的培养基混合后，需要进行适当的倍液和重新分装，以提供新的生长环境。
三、处理细胞的方法在细胞培养过程中，有时需要对细胞进行处理以满足实验的需要，这涉及到以下几个知识点：1. 细胞冻存：将细胞冷冻保存可以长期保存细胞，并且在需要时可以重新进行细胞培养。
在细胞冻存过程中，需要使用适合的冻存液和冷冻容器，同时控制冻结速度和解冻温度。
2. 细胞分离和纯化：当需要分离细胞亚群或纯化细胞时，可以使用特定的细胞分离方法，如离心、负选择法、正选择法等。
3. 细胞转染：将外源DNA导入细胞内，以实现目标基因的表达或基因沉默。
第一篇细胞工程的基本技术——细胞培养技术第1章细胞培养的基本知识第一节基本概念和名词细胞培养(cell culture)技术即是选用各种细胞的最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术，是广泛应用于医学研究领域的重要技术。
它起源于1885年，德国人Roux用温生理盐水在体外培养鸡胚髓板，并使之存活了数月之久，第一次获得组织块人工培养成功。
1906年，Beebe和Ewing用盖玻片悬滴培养法，以动物血清做培养基，培养狗淋巴细胞存活了72小时，并曾见到细胞生长现象。
1907年，Harrison用淋巴液做悬滴培养，使来自两栖类胚胎神经组织的神经细胞存活了若干天，还观察到神经管细胞分化成了神经元，而且向培养液中伸出了轴突，与脑、脊神经细胞在体内分化的情况很类似。
以后Carrel进行了改进，并十分注意培养中的无菌操作技术。
他用血浆包埋组织块外加胎汁的培养法，通过采用更新培养基和分离组织的传代措施，完善了经典的悬滴培养法。
1923年，他又设计了用骨化瓶培养法，以扩大组织的生存空间。
50年代，组织培养技术有了更快的发展，从改进培养操作技术、培养器皿和培养基方面进行了改进。
各种培养瓶、培养基孕育而生。
1957年Dulbecco实验室采用胰蛋白酶消化处理，使成块的组织分散成单个细胞，进行悬液培养，从而开创了细胞培养技术。
用单层细胞培养法可以建立很多细胞系(cell line)，通过单细胞分离培养法又可建立克隆细胞株(clone或cell strain)。
细胞系(cell line)系原代培养经首次传代成功后即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。
细胞株(cell strain)系通过选择法或克隆形成法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特定性质或标志的细胞群。
细胞株的这种特定性或标志必须在整个培养期间始终存在。
克隆(clone)系指由同一个祖先细胞通过有丝分裂所产生的遗传性状相同的细胞群体。
医学研究中泛指的体外培养包括细胞培养、组织培养和器官培养。
名词解释：细胞组织培养：细胞（组织）培养是指从生物体内取出细胞（组织），模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存、生长并维持其结构和功能的方法。
二倍体细胞株：具有二倍体染色体数的细胞株。
细胞组织培养选材：根据实验目的、观察指标确定所选组织器官。
培养选材一般来自胚胎组织的培养物；比成体组织更易生存和生长。
这主要是因为胚胎组织有更多的胚胎组织干细胞，它们具有更高的自我更新和多能分化能力。
原代培养：一般指从组织中分离在体外生长至传代之前的细胞培养。
这种培养通常是异质性，生长缓慢，但比较能代表原组织的类型并表达原组织特性。
缺点是在培养过程中会失去许多原组织的细胞。
传代细胞：原代细胞生长物或细胞系生长到一定阶段，分散成单个细胞，按一定比例接种于新的培养容器内称之传代。
传代细胞称之细胞系，可分为两类：有限细胞系和连续细胞系。
传代形成的具有各自生物特性或标志的细胞系称之为细胞株。
世代：指细胞经过一次分裂后完成后至下次分裂的过程。
细胞富集：当细胞分离纯化并不完全彻底，培养物中能达到以某种细胞为主（占绝大多数）的程度。
细胞纯化：是指从原代培养前成分混杂的异质性细胞悬液中或者从培养物中获得单一类型细胞的过程。
通过细胞分离和纯化得到细胞株或系。
传代：也称为再培养，把一瓶培养细胞全部或分成几份再培养的过程。
组织工程：组织工程是应用生命科学和工程学的原则及方法，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。
Density inhibition:密度抑制，由于细胞密度过大，培养液营养耗尽、代谢产物过多和生存空间消失所引起细胞增殖的抑制现象。
消化液：在原代细胞培养和细胞传代时，都要用消化液，最常用的是胰蛋白酶和二乙烯四乙酸二钠（EDTA），其次是一些特殊的组织细胞培养用的各型胶原酶。
在原代细胞培养中，使用消化液从组织块中分离（散）出单个的细胞；在进行细胞传代时，消化液使细胞脱离生长表面并离散成单个细胞。
第一章：细胞组织培养的三种类型？原代外植块培养：是从人或动物体内取出一小块组织，模拟体内生理环境，在保证无菌、适宜温度和营养条件下，使之生存和生长并保持其结构和功能的方法。
器官培养：指的是应用和组织培养相似的条件，培养的是器官的原基或器官的一部分或整个器官，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法。
细胞培养：是以相似的培养方法体外培养单个细胞或单一细胞群，使其在适宜条件下生长并保持细胞特性。
第二章1.体内体外的环境不一样，细胞之间的粘附是通过什么实现的？细胞的黏附是通过特异的细胞表面受体与细胞外基质分子结合实现的。
在细胞铺展之前，细胞已分泌了细胞外基质蛋白和蛋白聚糖。
细胞外基质先黏着到带电底面上，然后再通过特异的受体附着到基质上。
因此，细胞曾经生长过的玻璃或塑料表面更适合细胞附着，用基质成分，如纤连蛋白、胶原或其衍生物（如明胶）预处理培养器皿，有利于要求复杂培养条件的细胞附着和增殖。
主要有四类跨膜蛋白参与了细胞与细胞、细胞与底物的黏附。
不依赖Ca2+的细胞间黏附分子介导同种或异种细胞与细胞粘附依赖Ca2+的钙黏着蛋白参与同源细胞间的相互作用整合蛋白，介导细胞与基质之间的相互作用，是基质分子跨膜的蛋白聚糖，能和基质成分如其他蛋白聚糖或胶原相互作用，具有稳定、活化和把生长因子转运到高亲和性受体上的作用。
2.细胞外基质成分及作用？细胞外基质（ECM）由胶原、层粘连蛋白、纤粘连蛋白、透明质酸酶、蛋白多糖及膜结合生长因子（或细胞因子）等各种成分组成。
ECM能提高细胞的生存、增殖和分化能力3.概念，接触抑制：细胞在生长过程中达到相互接触时运动停止，同时细胞质膜褶皱减少，最终细胞分裂停止。
4.诱导细胞分化的条件？有助于诱导细胞分化的条件：细胞密度高细胞与细胞、细胞与基质之间作用强培养基中存在各种分化因子5.细胞信号传递的类型？体内细胞的增殖、迁移、分化、凋亡均受细胞间、细胞与基质间相互作用及营养条件和激素等信号分子的调控。
体内细胞信号传递的类型有：自分泌：由细胞自身合成并通过与自身受体结合作用于细胞自身。
内分泌：信号分子通过体内脉管系统从一种细胞转移到另一种组织细胞中发挥作用的过程同型（旁）分泌：某些细胞分泌的可溶性信号物质作用于同类型细胞。
异型旁分泌：同一细胞类型分泌的信号物质作用于不同的反应蛋白旁分泌：不通过血液而直接作用于邻近细胞的方式体内都存在这些类型的细胞信号传递方式，而在体外，在具有基本培养基的常规条件下，只有自分泌和同型分泌两种方式。
6.细胞传代分为哪三个阶段？原代培养期：从体内取出组织，接种培养到第一次传代阶段（初代培养）1-4周、细胞呈活跃的移动、可见细胞分裂、形态结构和功能活动上与体内原组织相似性大、多呈二倍体核型细胞群是异质的，细胞克隆形成率很低，即细胞独立生存性差。
传代期：初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系。
在全生命期中此期的持续时间最长。
在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系。
为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存（10代内）。
一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期，即有限细胞系。
衰退期：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，细胞很难长满培养空间；细胞形态轮廓增强，色泽变暗，胞质内出现暗的颗粒样结构以及空泡状结构，胞质突起回缩，突起边缘有时可脱落；最后衰退凋亡。
第四章：1.血清的主要作用有哪些？血清是最常用的天然培养基，含有丰富的营养物质，包括大分子蛋白质和核酸等，对促进细胞生长繁殖、黏附及中和某些物质的毒性有一定作用。
提供基本营养物质：氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等，是细胞生长必须的物质。
提供激素和各种生长因子：胰岛素、肾上腺皮质激素（氢化可的松、地塞米松）、类固醇激素（雌二醇、睾酮、孕酮）等。
生长因子如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等。
提供结合蛋白：结合蛋白作用是携带重要的低分子量物质，如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等，转铁蛋白携带铁。
结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用。
提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤。
对培养中的细胞起到某些保护作用：有一些细胞，如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。
使用血清可终止胰蛋白酶的消化作用。
血清蛋白形成了血清的粘度，可以保护细胞免受机械损伤，特别是在悬浮培养搅拌时，粘度起到重要作用。
血清还含有一些微量元素和离子，在代谢解毒中起重要作用。
第五章1.概念，原代培养：指细胞分离之后至第一次传代之前的细胞培养阶段2.体外细胞培养的类型？体外培养细胞大多培养在瓶皿等容器中，根据它们是否能贴附在支持物上生长的特性，可分为贴附型和悬浮型两大类。
贴附型-贴壁培养：大多数培养细胞属于贴壁依赖性细胞。
这类细胞在体内时各自具有其特殊的形态，但在体外培养时贴附于支持物后形态上表现单一化而失去体内原有的某些特征，多呈上皮样或成纤维细胞样。
成纤维细胞型：胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质向外伸出2~3个长短不等的突起，生长时呈放射状。
除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。
培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞上皮型细胞：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。
生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。
起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。
游走细胞型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。
此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。
多型细胞型：有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。
悬浮型-悬浮培养：少数细胞在培养时不贴附于支持物上，而以悬浮状态生长，包括一些取自血、脾或骨髓的培养细胞，尤其是血液白细胞，以及一些肿瘤细胞。
细胞悬浮生长时可以呈单个细胞或细小的细胞团，胞体为圆形。
其优点是在培养液中生长，生存空间大，允许长时间生长，便于大量繁殖。
3.如何让接种细胞尽快贴壁？如何让接种的细胞尽快贴壁，是决定培养成功的关键步骤：取决于适当的生长基质表面；可降低接种后培养液对细胞的浮力，如先少补加少量培养液，待细胞贴壁后再补足营养液继续培养；注意适当的细胞接种密度，一般10的5次方个/ml 左右。
4.细胞封存和复苏中需要注意的事项？当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。
如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。
复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。
为使细胞复苏时存活率最高，最佳的冷冻条件是尽可能地降低细胞内的晶体形成，减少细胞内水凝固所形成的高浓度溶质对细胞造成的低温损伤。
缓慢冷冻，使细胞内水分离开细胞，但不可太慢以避免冰晶形成；用亲水的低温保护剂排除水分；在尽可能低的温度下保存细胞，降低高浓度盐对冰中蛋白质变性的影响；快速复苏，减少细胞内晶体形成，以及细胞内残余的冰溶解时可溶性成分的产生。
细胞低温保存的关键，在于通过0~20℃阶段的处理过程。
在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。
细胞浓度：以较高浓度冻存细胞，细胞的存活率似乎更高。
冷冻液：在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。
冷冻速率：大多数培养细胞以-1℃/min的速度冷冻存活率最高；当温度达-25 ℃以下时，可增至-5~-10 ℃/min；到-100 ℃时，可迅速浸入液氮中复苏：冻存细胞应尽可能快的进行复苏，以减少升温过程中细胞内冰晶的生成。
可在盛有温水的桶中或水浴中进行。
冻存细胞较脆弱，要轻柔操作。
复苏后缓慢稀释细胞悬液，因为快速稀释可降低存活率。
尤其是DMSO 突然稀释会给细胞造成严重的渗透性损害，使细胞存活率降低近半。
大多数细胞不需要离心，贴壁细胞只需次日换液，悬浮细胞进行稀释即可；对DMSO敏感的细胞复苏后必须离心。
第六章:食道黏膜上皮细胞的培养属于未角化的复层扁平上皮，基底层细胞具有分裂增殖的能力，增殖后的细胞逐渐分化。
操作：（1）将食道黏膜组织放入HBSS中，在解剖显微镜下仔细分离黏膜与黏膜下组织，将黏膜剪成约1mm3组织块。
（2）按1块/cm2的密度将组织块放入培养皿中，上皮面朝下。
（3）组织块贴壁后，加入适量培养液，在培养箱中静置培养。
（4）贴壁1~3天后，补充培养液，以后每隔2~3天换液1次。
生长特点：植块培养3d后，细胞从组织块边缘迁出。
1周后，细胞向外迁移扩展，并逐渐分化，细胞的形态逐渐趋向正常食管黏膜上皮细胞的形态学特征。
靠近组织块的细胞体积小，类似基底细胞。
远侧的细胞扁平，为分化的上皮细胞。
2周后，细胞开始出现凋亡形态。
3周后，近侧的细胞减少，甚至消失。
剩余的发部分细胞呈分化状态。
鉴定：角蛋白免疫组化染色：阳性反应。
电镜观察：细胞表面有大量的微绒毛，胞质内含有丰富的角蛋白丝，细胞间有桥粒等连接结构。
第七章:1.概念：干细胞（stem cell）是一种具有自我更新、高度增殖以及多种分化潜能的未分化细胞。
2.概念：胚胎干细胞（ES细胞）是一种高度未分化细胞，它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞3.概念：成体干细胞是指存在于组织中的未分化细胞，该种细胞能够自我更新并能够分化形成组成该类组织的细胞，包括间充质细胞、造血干细胞、神经干细胞等4.干细胞和肿瘤细胞的相似性?自我更新；产生分化程度不同、表型特征不同、增殖潜能不同的细胞，以及构成组织；激活抗凋亡途径；迁移和转移。
5.概念：诱导多能性干细胞：是将经过筛选的限定的转录因子转入体细胞，经过重编程使体细胞转变为类似于胚胎干细胞的多能性干细胞。
第九章：1.概念：细胞活力：在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力2.细胞计数的方法？当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。
计数结果以每毫升细胞数表示。
血细胞计数板计数法电子计数仪计数法步骤（１）将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。
（２）将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。
（３）静置3 分钟。
（４）10×镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。
然后按下式计算：细胞数/ml＝4 大格细胞总数/ 4×10000注意悬液中细胞数目不低于104/ml，分散良好，否则影响计数准确性；盖片下不能有气泡；镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。
