壳聚糖固定化胰蛋白酶的研究

摘要：酶的固定化技术是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，酶仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。

酶的固定化技术已经成为酶应用领域中的一个主要研究方向。

经固定化的酶与游离酶相比具有稳定性高、回收方便、易于控制、可反复使用、成本低廉等优点，在生物工业、医学及临床诊断、化学分析、环境保护、能源开发以及基础研究等方面发挥了重要作用。

因此酶的固定化技术研究已成为十分引人注目的领域。

本文简要介绍了固定化酶技术的概念、制备方法(包括传统固定化技术、传统固定化技术的改进方法、新型固定化技术) 及其在化学化工、食品行业、临床医药、生物传感器和环境科学等领域中的应用现状与存在的问题,并对固定化酶技术的应用前景进行了展望。

关键词：固定化酶；制备；应用；磁性载体；定向固定固定化酶的研究始于1910年,正式研究于20世纪60年代,70年代已在全世界普遍开展。

酶的固定化(Immobilization of enzymes)是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内,仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。

与游离酶相比,固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时,又克服了游离酶的不足之处,呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。

固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃,得到迅速发展和广泛的应用,而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。

固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。

物理方法包括物理吸附法、包埋法等。

物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应,整体结构保持不变,酶的催化活性得到很好保留。

但是,由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用,因此对一些反应不适用。

化学法是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上,使用偶联剂通过酶表面的基团将酶交联起来,而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法。

固定化胰蛋白酶的制备研究
一、背景介绍
固定化酶技术是指将酶固定在载体上，形成固定化酶，以提高其稳定
性和重复使用性。

胰蛋白酶是一种重要的消化酶，常用于医药和食品
工业中。

因此，制备固定化胰蛋白酶具有重要的应用前景。

二、制备方法
1. 固定化胰蛋白酶的载体选择：常用的载体有凝胶、纤维素、硅胶等。

其中凝胶是最常用的载体。

2. 固定化方法：包括物理吸附、共价键结合和交联等方法。

其中，共
价键结合法是最常用的方法。

3. 制备步骤：
（1）将选好的载体与活性胰蛋白酶混合；
（2）加入交联剂进行交联反应；
（3）去除未固定的胰蛋白酶和交联剂；
（4）测定固定化后的活性。

三、影响因素
1. pH值：pH值对于固定化后的活性有较大影响，一般选择pH 7.0-8.0为最佳条件。

2. 温度：温度也是影响固定化后活性的重要因素。

一般情况下，选择
40℃为最佳条件。

3. 固定化时间：固定化时间对于固定化后的活性也有影响。

一般情况下，选择1-2小时为最佳条件。

四、应用前景
固定化胰蛋白酶具有较好的应用前景。

在医药领域，可以应用于制备消化酶剂和治疗胰腺疾病；在食品工业中，可以应用于酿造、发酵等过程中的蛋白水解反应。

五、总结
固定化胰蛋白酶的制备是一项重要的技术，在医药和食品工业中具有广泛的应用前景。

其制备方法包括载体选择、固定化方法和测定固定化后活性等步骤。

同时，pH值、温度和固定化时间等因素也对其活性产生影响。

壳聚糖-精氨酸树脂固定化胰凝乳蛋白酶及其性质肖燕;王娟;周小华【期刊名称】《应用化学》【年(卷),期】2009(26)7【摘要】以具柔性亲水手臂的壳聚糖-精氨酸树脂为载体,用戊二醛交联胰凝乳蛋白酶,获得壳聚糖-精氨酸树脂固定化胰凝乳蛋白酶. 最佳固定化条件为:m(酶)∶ m(载体)=20∶ 1 000、戊二醛体积分数为1.0%、pH=5.20、30 ℃交联60 min. 固定化酶活力达850 U/g,Km为1.83 mmol/L,比游离酶增大33.6%,比交联壳聚糖固定化酶低24.0%. 壳聚糖-精氨酸树脂固定化胰凝乳蛋白酶水解时间进程曲线与游离酶基本一致,均在反应30 min达到最大速率,最适温度为70 ℃,比游离酶升高10 ℃;在75 ℃时的半衰期可达6.0 h,比游离酶提高约4.3倍;最适pH值为5.92,比游离酶向酸性偏移2pH单位. 4 ℃贮存半衰期为49 d.【总页数】6页(P780-785)【作者】肖燕;王娟;周小华【作者单位】重庆大学化学化工学院,重庆,400044;重庆大学化学化工学院,重庆,400044;重庆大学化学化工学院,重庆,400044【正文语种】中文【中图分类】O636.1;O629.7【相关文献】1.α-胰凝乳蛋白酶在相转移Fe_3O_4纳米粒子表面的固定化 [J], 吴侠;韩玉顺;曹敏花;胡长文;任玲;葛广路2.用于α-胰凝乳蛋白酶固定化的氨基超顺磁纳米凝胶光化学合成与表征 [J], 洪军;徐冬梅;孙汉文;宫培军;董黎;姚思德3.α-胰凝乳蛋白酶的固定化及其对DL-苯丙氨酸的光学拆分 [J], 刘立建4.PNIPAM/HEMA固定化α-胰凝乳蛋白酶的研究 [J], 陈元安;付建伟5.PAM/HEMA固定化α-胰凝乳蛋白酶的研究 [J], 付建伟;庄银凤;王国伟;彭颖因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

固定化壳聚糖酶膜的初步研究的开题报告
标题：固定化壳聚糖酶膜的初步研究
研究背景：
壳聚糖酶是一种能够水解壳聚糖的酶类，具有广泛的应用价值。

然而，由于壳聚糖酶具有易失活、易受污染等缺点，在工业上应用受到了一定的限制。

因此，如何提高壳聚糖酶的稳定性和重复使用性已成为一个重要的研究方向。

研究内容：
本研究旨在将壳聚糖酶固定化在膜上，从而提高其稳定性和重复使用性。

具体来说，先将壳聚糖酶与适合的载体材料混合，然后将混合物涂覆在膜上，制成固定化壳聚糖酶膜。

在这个过程中，需要对载体材料、混合物的比例、涂覆工艺等进行优化，并测试膜的稳定性和催化效率。

研究方法：
（1）筛选合适的载体材料，如聚苯乙烯、聚丙烯等；
（2）制备壳聚糖酶和载体材料的混合物；
（3）将混合物涂覆在膜上；
（4）优化涂覆工艺，如溶液浓度、涂覆时间、温度等；
（5）测试固定化壳聚糖酶膜的稳定性和催化效率。

预期成果：
通过本研究，可制备出稳定性较高、重复使用性较好的固定化壳聚糖酶膜，并研究其催化性能。

这将为壳聚糖酶在工业上的应用提供新思路和方法。

壳聚糖微球固定化胰蛋白酶的研究的开题报告
一、背景
随着生物技术和生物医学领域的发展，酶在许多应用中都发挥着重
要作用。

然而，自由酶在使用过程中面临着稳定性、重现性等问题，无
法实现长期稳定的储存和使用。

因此，固定化酶成为了一种重要的解决
方案。

固定化技术可以提高酶的稳定性，延长使用寿命，并且可以更方
便地进行回收和重复利用，实际应用和经济效益均有很大的优势。

壳聚糖是一种天然产物，由于其良好的生物相容性、生物降解性和
再生性等特点，成为了固定化酶的优秀载体。

胰蛋白酶是消化蛋白质的
一种常用酶，广泛应用于食品、医药等领域。

二、研究目的
本研究的目的是利用壳聚糖微球作为载体，固定化胰蛋白酶，并对
其进行性质和稳定性的研究。

三、研究内容和方法
（1）制备壳聚糖微球
以壳聚糖为主要原料，采用溶液交联-乳化凝胶化法制备壳聚糖微球，通过控制反应条件和调节配方，得到粒径分布较为均匀、表面光滑的微球。

（2）固定化胰蛋白酶
将制备好的壳聚糖微球与胰蛋白酶进行反应，使其在微球表面固定化。

（3）性质和稳定性研究
通过对固定化胰蛋白酶的工作效率、催化活性、稳定性等进行测试，比较其与自由酶的差异，并进一步探讨其在应用中的优势和局限性。

四、研究意义
胰蛋白酶的固定化研究对于优化酶催化的条件、提高催化效率和稳
定性、推动酶在医疗、生物技术等领域的应用具有重要意义。

本研究可
以为固定化技术的发展和在实际应用中的推广提供理论依据和实践经验。

2009年第2期胰蛋白酶(Trypsin )是一种蛋白水解酶(Protease )，专一作用于精氨酸、赖氨酸的羧基所形成的肽键，分子量为23800[1]。

在食品加工中，胰蛋白酶被广泛用于水解蛋白质，由于在蛋白水解液中要将胰蛋白酶分离去除，并希望提高催化效率，多次使用降低生产成本。

因此，有必要将该酶制成固定化酶[2]，目前已经将胰蛋白酶固定化于多种载体上[3、4]，但由于载体材料和形态的限制，载体的负载酶量较少，回收率不高。

壳聚糖(Chitos an )是一种天然的阳离子型多糖，其分子侧链上具有大量的游离氨基，对各种蛋白质的亲和力非常高，具有良好的生物相容性和生物降解性，安全可靠，对人类无害并且对环境无污染；同时壳聚糖具有很好的成胶性质，易于形成膜、凝胶，可加工成多种形态；此外壳聚糖具有良好的机械性能、耐热性、抗菌性等优点[5]，因此壳聚糖是性能优良的固定化酶载体。

本文选用壳聚糖为载体，以戊二醛为交联剂，首先将壳聚糖制备成微球，然后利用壳聚糖微球固定胰蛋白酶，既提高了载体的机械强度，也有利于提高固定化酶的负载酶量，提高固定化酶活力及其回收率，同时也使酶与水解产物易于分离。

1材料和方法1.1主要材料与试剂固定化胰蛋白酶的制备研究张黎明，袁永俊*，徐梦虬（西华大学生物工程学院，四川成都610039）摘要：以壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂，采用交联-吸附法对胰蛋白酶的固定化条件进行了初探。

实验结果表明：酶用量、戊二醛浓度、pH 值、温度等对壳聚糖微球固定化的胰蛋白酶活力有显著影响，最适固定化条件为：壳聚糖0.125g 、酶用量14mg ，交联剂浓度0.2%（v/v ），pH 值7.5，固定化温度35℃，交联时间2h ，吸附时间5h 。

在此条件下酶活力回收率为76.57%。

关键词：胰蛋白酶；壳聚糖微球；固定化；正交试验中图分类号：TQ925.TQ93文献标识码：A文章编号：1674-506X （2009）02-0018-0004The Study of Condition of Immobilized Trypsin on ChitosanMicrospheresZhang Liming,Yuan Yongjun *,Xu Mengqiu(School of Bioengineering of Xihua University,Chengdu,Sichuan 610039)Abstract:Immobilized trypsin was prepared with the Chitosan as matrix and glutaraldehyde as cross-linking agent through absorbing and crosslinking.The result of experiment manifested:the quality of enzyme,the concentration of the glutaralde -hyde,pH,temperature and so on conspicuously effect on the activity of immobilized trypsin on Chitosan Microspheres.The best condition of the immobilization of trypsin:The quality of chitosan is 0.125g,14mg of enzyme,the concentration of the glutaraldehyde is 0.2%(v/v),pH=7.5,the temperature of immobilized enzyme is 35℃,the crosslinking time is 2hours,the absorption time is 5hours.The activity recovery of immobilized enzyme is 76.57%.Keywords ：trypsin ；chitosan microspheres ；immobilization ；orthogonal experiment doi ：10.3969/j.issn.1674-506X.2009.02-005收稿日期：2009-02-12作者简介：张黎明（1984-），女，硕士研究生，研究方向：食品生物技术。

壳聚糖酶的特性及其固定化研究的开题报告
一、选题背景与意义
壳聚糖（chitosan）是一种重要的天然产物，具有良好的生物降解能力、低毒性且具有较好的生物相容性。

壳聚糖酶（chitosanase）可将壳
聚糖水解成低聚物和单体，是壳聚糖降解的关键酶类。

因此，壳聚糖酶
的研究对于壳聚糖的高效利用、环境保护和生物医药等领域具有重要意义。

固定化壳聚糖酶可以增加酶的稳定性和重复使用性，降低生产成本
和环境污染，提高反应效率，因此具有广泛的应用前景。

二、研究内容
本文拟就壳聚糖酶的特性及其固定化研究展开探讨，包括以下部分：
1. 壳聚糖酶的来源、结构和分类；
2. 壳聚糖酶的催化机理；
3. 壳聚糖酶的特性研究，包括最适pH、最适温度、热稳定性、催化动力学参数等；
4. 壳聚糖酶的固定化方法，包括吸附、共价结合和包埋等；
5. 固定化壳聚糖酶的特性研究，包括催化活性、重复使用性、稳定性、抗污染性等。

三、研究方法
本文将采用实验和文献综述相结合的方法，通过文献综述了解前人
的研究成果和方法，评价其可行性与优点。

在此基础上针对本研究的目标、任务和方法进行实验设计和实验操作，评估实验结果的可操作性和
可信度，最终得出科学的研究结论。

四、预期成果和意义
通过研究壳聚糖酶的特性及其固定化，可以深入了解壳聚糖酶的催化机理和特性，为其在生产实践和环境治理中的应用提供理论和实验依据。

同时，对固定化技术的比较和选择，可为生物催化的产业化提供指导。

最终，具有高活性、高稳定性的固定化壳聚糖酶的制备，将为壳聚糖的高效利用和环境保护做出重要贡献，具有经济价值和社会效益。

壳聚糖固定化酶的研究与应用摘要：介绍壳聚糖作为固定化酶载体的3种主要情况：壳聚糖直接作为固定化酶载体；壳聚糖衍生物作为固定化酶载体；壳聚糖与其他物质共同作为固定化酶载体。

壳聚糖及其衍生物等固定化酶具有酶活性高、回收率高和耐贮藏等特点。

指出壳聚糖及其衍生物在固定化酶技术领域有着广阔的应用前景。

关键词：壳聚糖；衍生物；固定化酶壳聚糖是甲壳素(chitin)脱乙酰基的产物，是由大部分2-氨基一2一脱氧一β—D-葡萄糖单元和少量N．乙酰-2一氨基-2一脱氧一β一D一葡萄糖单元以β一1，4糖苷键连接的二元线性共聚物，相对分子质量通常在几十万到上百万左右。

壳聚糖学名聚氨基葡萄糖，是一种生物相容性好、易生物降解、无毒、易得的天然功能高分子生物材料，易于制成粉、膜、多孔微珠、纤维、凝胶、纳米粒子等多种形态。

作为唯一一种碱性多糖，壳聚糖在固定化酶并保持其活性方面有独特的优点。

1 壳聚糖直接作为固定化酶载体。

壳聚糖本身是一种多孔网状天然高分子粉粒材料，耐热性好，其分子中的羟基和氨基可形成活泼界面，对蛋白质有显著的亲合力，可将酶吸附通过离子键、氢键及范德华力而与载体结合。

John等将壳聚糖研磨成粉状，与粉状胰蛋白酶混合研磨，通过吸附作用周定胰蛋白酶，结果表明：研磨时间越长，固定化效果越好。

李志国等以壳聚糖为载体，用物理吸附固定化脂肪酶，对影响固定化过程的各种因素进行考察，确定最优条件，结果表明：固定化酶的可操作性优于游离酶。

以壳聚糖为载体通过吸附制备固定化酶，酶不易失活，但酶与载体之间的结合力弱，在使用过程中酶分子易从载体上脱落，因此，多数情况下用吸附一交联法以提高其稳定性。

最常用的交联剂是甲醛和戊二醛，但更多采用戊二醛。

周纪宁采用甲醛活化交联壳聚糖固定L-天冬酰胺酶，其活力回收可达20％一25％。

岳振峰等将粉末状壳聚糖制备成微球形多孔载体，采用吸附——交联的方法进行固定化，在最佳固定化条件下，酶活力回收率为78．1％，具有较好的强度。

摘要作为功能性材料的壳聚糖、脱乙酰壳聚糖，由于其一系列独特的性质作为固定化酶载体材料已经广泛应用于酿酒工业、制糖工业、渔业、废水处理、环境污染的定点测控等研究领域。

固定化酶比游离酶具有多方面的优点。

本文以多孔壳聚糖球为载体，戊二醛为交联剂制备固定化胰蛋白酶，研究了多孔壳聚糖球载体的制备条件、固定化反应中戊二醛浓度、给酶量、pH值、温度、固定化时间对固定化胰蛋白酶活力的影响。

并进一步对固定化胰蛋白酶的性质，固定化胰蛋白酶水解鲢鱼蛋白的条件，以及鲢鱼蛋白的水解度，水解产物中可溶性蛋白得率，氮溶指数进行了研究。

通过研究确定了制备多孔壳聚糖球载体的最佳条件为：壳聚糖浓度3％，凝结液为：4％NaOH：95％乙醇(4：1)，室温处理3h。

固定化胰蛋白酶的条件为：每克载体加入交联剂(用pH值7．0缓冲液配制戊二醛)5mL，浓度为0．50％，活化温度为25℃，150rpm条件下振荡活化2h，酶液的浓度为7mg／mL(用pH 7．0缓冲液配制)，加酶量5mL／g载体，固定化温度15"C，150rpm振荡固定化24h。

在此条件下固定化胰蛋白酶活力472．39u／g 固定化酶，固定化效率42．9％。

固定化胰蛋白酶的最适反应温度范围30"C---60"C，游离胰蛋白酶的最适反应温度50"C；·固定化胰蛋白酶的最适pH值范围7．0"--'9．0，游离胰蛋白酶最适pH值范围7．0"--'7．5。

固定化胰蛋白酶的热稳定性和pH值稳定性比游离酶有所提高。

固定化酶的Km值为9．89mg／mL，游离酶的米氏常数Km值为8．99mg／mL。

利用固定化胰蛋白酶水解鱼肉蛋白，重复4次后，其活力为初始活力的46．06％。

以20％的鲢鱼蛋白为底物，水解时间120min，温度40"C，最大水解度8．73％，可溶性蛋白得率69．55％，水解物的氮溶指数62．24％。

固定化胰蛋白酶的制备研究介绍固定化胰蛋白酶是一种将胰蛋白酶通过某种方法固定在特定载体上的生物催化剂。

它具有较高的催化活性、较高的稳定性和重复使用性，因此在生物制药和食品工业等领域具有广泛的应用前景。

本文将对固定化胰蛋白酶的制备进行全面、详细、完整且深入地探讨。

固定化胰蛋白酶的制备方法1. 手工固定化方法1.1 离子交换法1.准备离子交换树脂，如聚对苯二甲酸乙烯酯。

2.将胰蛋白酶溶液加入固定床，与离子交换树脂发生离子交换作用。

3.用缓冲液冲洗离子交换树脂上未固定的胰蛋白酶。

4.获得固定化胰蛋白酶。

1.2 化学交联法1.准备交联剂，如戊二醛。

2.将胰蛋白酶溶液与交联剂反应。

3.获得固定化胰蛋白酶。

2. 免疫固定化方法2.1 抗体固定化法1.准备抗体固定床，如琼脂糖凝胶。

2.将抗体溶液涂覆在固定床上。

3.将胰蛋白酶溶液加入固定床，与抗体发生免疫反应。

4.获得固定化胰蛋白酶。

2.2 酶联免疫固定化法1.准备带有胰蛋白酶结合位点的抗体。

2.将带有胰蛋白酶的底物与抗体结合。

3.获得固定化胰蛋白酶。

固定化胰蛋白酶的性质研究1. 催化能力通过将固定化胰蛋白酶与游离胰蛋白酶进行比较，研究固定化胰蛋白酶的催化能力。

2. 热稳定性通过将固定化胰蛋白酶在不同温度下进行催化反应，研究其热稳定性。

3. pH稳定性通过将固定化胰蛋白酶在不同pH值的缓冲液中进行催化反应，研究其pH稳定性。

4. 反复使用性通过多次使用固定化胰蛋白酶进行催化反应，并与游离胰蛋白酶进行比较，研究其反复使用性。

固定化胰蛋白酶的应用前景1. 生物制药固定化胰蛋白酶可以用于生产生物制药产品，如蛋白药物的制备过程中的降解杂质的去除。

2. 食品工业固定化胰蛋白酶可以用于食品工业中的蛋白质加工过程，如发酵面包的制备。

3. 污水处理固定化胰蛋白酶可以用于污水处理中蛋白质的降解过程，提高污水处理效率。

4. 医学检测固定化胰蛋白酶可以用于医学检测中的蛋白质测定，如血清蛋白质的检测。

内切壳聚糖酶的固定化及其酶学性质初步研究的开题报告
开题报告
一、研究背景
聚糖是一种多糖类物质，广泛存在于植物、菌类和动物组织中，对于细胞壁的构建和生理功能具有重要作用。

内切壳聚糖酶是一类能够水解聚糖链的酶，在生产和食品加工等领域中具有广泛的应用价值。

然而，由于其在反应过程中易于失活和耗损，研究内切壳聚糖酶的固定化技术及其酶学性质，对于提高其稳定性和重复使用性具有重要意义。

二、研究目的
本项目旨在通过固定化技术对内切壳聚糖酶进行修饰，研究酶固定化对其催化性质和稳定性的影响，为其在工业生产中的应用提供基础研究支持。

三、研究内容和方法
1. 酶的提取
采用超声波破细胞法从壳聚糖生产菌中提取内切壳聚糖酶，并用Gel filtration和SDS-PAGE等方法对其进行分离和纯化。

2. 酶的固定化
将纯化后的内切壳聚糖酶通过共价键、离子键和物理吸附等方式固定于不同载体材料上，如壳聚糖、凝胶、磁性纳米颗粒等。

3. 酶学性质的研究
对比未固定内切壳聚糖酶和不同固定化酶的性质差异，研究固定化方法对其酶催化活性、对底物的特异性、温度、pH和稳定性等酶学性质的影响，为其在工业生产中的应用提供基础研究支持。

四、研究预期结果和意义
通过固定化技术对内切壳聚糖酶进行修饰，研究酶固定化对其酶学性质的影响，有望提高酶的稳定性，提高其重复使用性和催化效率，为其在生产和食品加工中的应用提供基础研究支持。

同时，本研究有望为其他类似酶的固定化研究提供参考。

壳聚糖固定化胰蛋白酶亲和层析抑肽酶的条件及影响因素宋扬;赵辉
【期刊名称】《中国生化药物杂志》
【年(卷),期】1998(019)006
【摘要】利用壳聚糖固定化县蛋白酶作为亲和吸附剂从牛肺中直接分离纯化抑肽酶。

该方法在适当的温度（３５℃）、ｐＨ值（ｐＨ１．５）、离子强度（１．０ｍｏｌ／ＬＫＣｌ）以及吸附条件（１７６ＦＩＰ／ｇ）下，纯化的抑肽酶活性回收率达８３％，比活可达５０００ｋＩＵ／ｍｇ以上。

【总页数】3页(P359-361)
【作者】宋扬;赵辉
【作者单位】安徽省生物研究所;安徽省生物研究所
【正文语种】中文
【中图分类】R977.3
【相关文献】
1.壳聚糖微球固定化胰蛋白酶条件初探 [J], 张黎明;袁永俊;徐梦虬
2.改性与修饰壳聚糖亲和层析纯化抑肽酶 [J], 谢宗良;杨军峰;张元亮
3.以壳聚糖为载体亲和层析胰蛋白酶 [J], 郝毅;章杰;何泽超
4.固定化胰蛋白酶制备条件的优化及其在纯化抑肽酶中的应用 [J], 李晓丽;李辰;杨斌;李春元;王萍;王磊
5.去乙酰基壳聚糖在亲和层析纯化胰蛋白酶中的应用 [J], 孙福璋;金海洙
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