在交变电场下固定化胰蛋白酶催化活性的研究

酶工程技术的研究及其在医药领域的应用一、本文概述随着生物技术的飞速发展，酶工程技术作为其中的重要组成部分，已经在医药领域展现出广阔的应用前景。

酶，作为生物体内的一类特殊蛋白质，具有高效、专一和温和的催化特性，因此被广泛用于医药、化工、食品等多个领域。

本文旨在探讨酶工程技术的最新研究进展，并重点分析其在医药领域的应用现状和发展趋势。

本文将对酶工程技术的基本原理和方法进行简要介绍，包括酶的来源、分离纯化、固定化以及酶反应器的设计等。

在此基础上，文章将重点论述酶工程技术在医药领域的多个应用方面，如药物合成、药物转化、药物分析和疾病诊断等。

通过具体案例和数据分析，展示酶工程技术在提高药物生产效率、降低药物成本、改善药物质量和提高疾病诊疗准确性等方面的积极作用。

本文还将对酶工程技术在医药领域面临的挑战和未来发展方向进行深入探讨。

随着生物技术的不断进步，酶工程技术的研究和应用将更加深入和广泛。

例如，新型酶的发现与改造、酶固定化技术的创新、酶反应器的优化以及酶工程技术在基因治疗和细胞治疗等新兴领域的应用等，都将成为未来研究的热点和方向。

酶工程技术在医药领域的应用已经取得了显著成果，并展现出广阔的发展前景。

本文将从多个角度全面分析酶工程技术在医药领域的应用现状和发展趋势，以期为相关领域的研究和实践提供有益的参考和借鉴。

二、酶工程技术的基础理论酶工程技术，作为一门应用生物技术的分支，其基础理论主要涵盖酶学基本原理、酶反应动力学、酶分子设计和改造以及酶固定化技术等方面。

酶学基本原理是酶工程技术的基石。

酶是生物体内具有催化功能的蛋白质，具有高度专一性和高效性。

酶通过降低反应的活化能来加速生物化学反应，使得原本难以进行的反应在温和条件下也能迅速进行。

了解酶的结构、催化机制以及影响因素，对于酶工程技术的应用至关重要。

酶反应动力学是研究酶催化反应速率与反应物浓度关系的科学。

通过对酶反应动力学的研究，可以了解酶催化反应的速度控制步骤、反应速率常数以及反应机制等，为酶工程技术的优化提供理论依据。

固定化酶载体的研究进展牛亚楠;侯红萍【摘要】As an important part of immobilized enzymes technology, the structure and the properties of carrier would influence directly catalysis activity and operation stability of immobilized enzyme. In this paper, the research progress in carrier materials for immobilized enzymes at home and abroad in recent years and its development trend were reviewed.%作为固定化酶技术的重要组成部分，载体的结构及性能在很大程度上直接影响着固定化酶的催化活性及操作稳定性。

综述了近年来国内外有关固定化酶载体材料的研究现状和发展趋势。

【期刊名称】《酿酒科技》【年(卷),期】2011(000)009【总页数】3页(P97-99)【关键词】固定化酶;载体;研究进展【作者】牛亚楠;侯红萍【作者单位】山西农业大学食品科学与工程学院,山西太谷030801;山西农业大学食品科学与工程学院,山西太谷030801【正文语种】中文【中图分类】Q814载体材料的选择是决定酶能否成功固定化以及固定化酶活力高低的重要因素。

酶蛋白的活性中心是酶催化活性所必需的，酶蛋白的空间结构也与酶活力密切相关，因而，在固定化的过程中，必须注意酶活性中心的氨基酸残基不受到载体的影响，而且要避免酶蛋白高级结构的破坏。

从载体材料的组成来看，固定化酶所使用的载体可以分为无机载体、高分子载体、复合载体及新型载体等。

无机载体稳定性好、机械强度高、对酶和微生物无毒性、不易被酶和微生物分解、耐酸碱、成本较低、寿命长，如氧化硅、活性炭、氧化铁(铝)、多孔玻璃等。

固定化生物催化剂技术的进展陈前驹2007140168摘要: 本文介绍了联合固定化生物催化剂及其发展过程。

综述了联合固定生物催化剂体系的应用。

展望了联合固定化生物催化剂体系在发酵工业中的前景。

关键词: 固定化生物催化剂、固定化、生物催化剂前言: 1980年后世界上形成了“生物工程热”,人们已把生物工程看成解决能源、资源、医疗等问题的金钥匙。

我国在长期规划中已将生物工程学列为重点课题，生物技术的发展对化学工业也有极大影响。

生物催化剂的固定化技术是自60末开始广泛研究的一项新技术,并已有许多用于工业生产的先例。

近年来,人们又提出了联合固定化技术。

联合固定化最初是指把外来酶结合于固定化完整细胞上。

后来,人们又发展到将两种酶、两种微生物细胞以及生物催化剂酶细胞与底物或其它物质联合固定在一起。

联合固定化技术是酶细胞固定化技术发展的综合产物,与普通的固定化酶或固定化细胞相比,联合固定化生物催化剂可以充分利用酶和细胞的各自特点,把不同来源的酶和整个细胞的生物催化性质结合到一起。

本文将对联合固定化技术的发展及其应用研究进展作综述介绍。

一、生物催化剂固定化技术的特点化学工业一般是在高温、高压条件下使用金属类催化剂进行化学反应生产有用物质的,是典型的大消耗能源和资源的工业。

而生物体内的化学反应则全在常温（确切地说,是维持生物体生存的温度）常压下,按照一定的程序准确、快速进行,这种反应由体内不断产生的多种酶控制。

这些酶能对特定的物质发生特异的作用,其密码指令存贮在基因（DNA）中。

生物体内化学反应的能量供给主要依靠ATP（三酸腺普）分解释放。

从能量转换方式看,是由一种学能转换为另一种化学能,几乎没有能量损耗。

生体内的化学反应为化学工业的改革提供了一个样。

[1]目前正在开发工业用生物反应器即是用微生物酶代替金属类催化剂,在常温常压下生产有用物质。

提高生产效率,从60年代末即已广泛研究酶及微生物的固定化技术,期望把酶及微生物制成块状的工业催化剂,以便进行连续反应。

固定化酶与固定化细胞技术酶是具有生物催化功能的生物大分子(蛋白质或RNA)，但通常指的是由氨基酸组成的酶，本章也仅探讨此类酶。

作为一种生物催化剂，参与生物体内各种代谢反应，而且反应后其数量和性质不发生变化。

由于酶的高级结构对环境十分敏感，各种因素(包括物理因素、化学因素和生物因素)均有可能使酶丧失活力。

但在常温常压条件下能高效地进行反应，且具有很高的专一性，副反应少，许多难以进行的有机化学反应在酶的作用下都能顺利进行。

由于酶的这些特点，大大促进了酶的应用和酶技术的研究。

酶被人们广泛应用于酿造、食品、医药等领域，特别是近几年来，随着分子生物学的发展，酶的应用更加活跃。

由于酶反应随着时间的延长，反应速度会逐渐降低，反应后酶不能回收，这就限制了酶的应用范围。

如果能将酶固定在惰性支持物上制成固定化酶，仍具有催化作用，还能回收反复使用，并且生产可以连续化、自动化。

从20世纪60年代固定化酶技术发展以来，不仅在酶学理论研究中发挥独特作用，在实际应用中也显示出强大的威力。

随着技术的不断发展，广义的固定化酶发展到固定化辅酶、固定化细胞及固定化细胞器等，固定化酶在食品、医药、化工和生物传感器制造上都有成功的应用实例。

对一个特定的目的和过程来说，是采用细胞，还是采用分离后的酶作催化剂，要根据过程本身来决定。

一般来说，对于一步或两步的转化过程用固定化酶较合适；对多步转换，采用固定化细胞显然有利。

第一节固定化酶固定化酶(immobilized enzyme)是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。

酶的固定化是将酶与水不溶性载体结合，制备固定化酶的过程。

固定化酶的形状依不同用途有颗粒、线条、薄膜和酶管等，颗粒状占绝大多数；颗粒和线条主要用于工业发酵生产；薄膜主要用于酶电极；酶管机械强度较大，主要用于化学工业生产。

目前，由于固定化酶的性质比游离酶及其相关技术优越，人们对其极感兴趣，因此固定化酶的应用也与日俱增。

固定化技术研究进展摘要:固定化酶技术作为一门交叉学科技术,在生命科学、生物医学、食品科学、化学化工及环境科学领域得到了广泛应用。

新型载体材料的合成是今后固定化酶发展的一个非常重要的研究领域。

本文主要介绍了固定化酶的载体,固定化技术以及在不同行业的应用,主要介绍了在污水处理和医疗行业的应用和发展趋势。

关键词:固定化载体污水医疗应用酶是重要的生物催化剂，具有专一性强、催化效率高、无污染、反应条件温和等特点，在制药、食品、环保、酿造、能源等领域都得到了广泛的应用。

但在实际应用中,酶也存在许多不足，如大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下,都容易变性失活,不够稳定；与底物和产物混在一起,反应结束后,即使酶仍有很高的活力,也难于回收利用，这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产；并且分离纯化困难，也会导致生产成本的提高等。

固定化酶技术(Immobiｌｉzed eｎzｙme techｎolｏgy)克服了酶的上述不足。

酶的固定化是指采用有机或无机固体材料作为载体,将酶包埋起来或束缚、限制于载体的表面和微孔中,使其仍具有催化活性，并可回收及重复使用的酶化学方法与技术。

１.传统酶固定化技术传统酶的固定化方法可分为吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等4 种。

吸附法是指通过载体表面和酶表面间的次级键相互作用而达到酶固定化的方法，根据吸附剂的特点又可分为物理吸附和离子交换吸附。

该法具有操作简便、条件温和及吸附剂可反复使用等优点，但也存在吸附力弱，易在不适pH、高盐浓度、高底物浓度及高温条件下解吸脱落的缺点。

共价偶联法是将酶的活性非必须侧链基团与载体的功能基通过共价键结合，故表现出良好的稳定性,有利于酶的连续使用,是目前应用和研究最为活跃的一类酶固定化方法，但共价偶联反应容易使酶变性而失活。

交联法是利用双功能或多功能基团试剂在酶分子之间交联架桥固定化酶的方法，其更易使酶失活。

包埋法包括网格包埋、微囊型包埋和脂质体包埋等，包埋法中因酶本身不参与化学结合反应,故可获得较高的酶活力回收，其缺点是不适用于高分子量底物的传质和用于柱反应系统，且常有扩散限制等问题。

固定化胰蛋白酶的制备研究介绍固定化胰蛋白酶是一种将胰蛋白酶通过某种方法固定在特定载体上的生物催化剂。

它具有较高的催化活性、较高的稳定性和重复使用性，因此在生物制药和食品工业等领域具有广泛的应用前景。

本文将对固定化胰蛋白酶的制备进行全面、详细、完整且深入地探讨。

固定化胰蛋白酶的制备方法1. 手工固定化方法1.1 离子交换法1.准备离子交换树脂，如聚对苯二甲酸乙烯酯。

2.将胰蛋白酶溶液加入固定床，与离子交换树脂发生离子交换作用。

3.用缓冲液冲洗离子交换树脂上未固定的胰蛋白酶。

4.获得固定化胰蛋白酶。

1.2 化学交联法1.准备交联剂，如戊二醛。

2.将胰蛋白酶溶液与交联剂反应。

3.获得固定化胰蛋白酶。

2. 免疫固定化方法2.1 抗体固定化法1.准备抗体固定床，如琼脂糖凝胶。

2.将抗体溶液涂覆在固定床上。

3.将胰蛋白酶溶液加入固定床，与抗体发生免疫反应。

4.获得固定化胰蛋白酶。

2.2 酶联免疫固定化法1.准备带有胰蛋白酶结合位点的抗体。

2.将带有胰蛋白酶的底物与抗体结合。

3.获得固定化胰蛋白酶。

固定化胰蛋白酶的性质研究1. 催化能力通过将固定化胰蛋白酶与游离胰蛋白酶进行比较，研究固定化胰蛋白酶的催化能力。

2. 热稳定性通过将固定化胰蛋白酶在不同温度下进行催化反应，研究其热稳定性。

3. pH稳定性通过将固定化胰蛋白酶在不同pH值的缓冲液中进行催化反应，研究其pH稳定性。

4. 反复使用性通过多次使用固定化胰蛋白酶进行催化反应，并与游离胰蛋白酶进行比较，研究其反复使用性。

固定化胰蛋白酶的应用前景1. 生物制药固定化胰蛋白酶可以用于生产生物制药产品，如蛋白药物的制备过程中的降解杂质的去除。

2. 食品工业固定化胰蛋白酶可以用于食品工业中的蛋白质加工过程，如发酵面包的制备。

3. 污水处理固定化胰蛋白酶可以用于污水处理中蛋白质的降解过程，提高污水处理效率。

4. 医学检测固定化胰蛋白酶可以用于医学检测中的蛋白质测定，如血清蛋白质的检测。

《基于金属亲和的固定化蛋白酶制备及其催化性能研究》一、引言随着生物工程和生物技术的快速发展，固定化酶技术已成为生物催化、生物分析和生物制药等领域的重要手段。

其中，基于金属亲和的固定化蛋白酶技术因其独特的优点而备受关注。

该技术能够实现对蛋白酶的有效固定，提高其稳定性和重复利用率，并有望在工业生产和医药领域发挥重要作用。

本文将针对基于金属亲和的固定化蛋白酶的制备及其催化性能进行深入研究。

二、制备方法基于金属亲和的固定化蛋白酶制备主要分为以下几个步骤：1. 酶的提取与纯化：从相应来源中提取出目标蛋白酶，并经过纯化处理，得到纯度较高的酶。

2. 金属亲和配体的合成：根据需要，选择合适的金属离子和配体，合成具有金属亲和性的配体。

3. 固定化过程：将纯化的酶与金属亲和配体通过一定的方法进行结合，形成固定化蛋白酶。

三、固定化蛋白酶的催化性能研究1. 稳定性研究：通过比较固定化蛋白酶与游离酶在不同环境条件下的稳定性，评估固定化过程对酶稳定性的影响。

实验结果表明，固定化蛋白酶的稳定性得到了显著提高。

2. 重复利用率研究：在相同实验条件下，对比固定化蛋白酶与游离酶的重复利用次数。

结果显示，固定化蛋白酶具有较高的重复利用率，能够有效降低生产成本。

3. 催化活性研究：通过对比固定化蛋白酶与游离酶的催化活性，评估其在实际应用中的效果。

实验表明，固定化蛋白酶在保持较高催化活性的同时，具有更好的操作稳定性和可回收性。

四、不同类型金属亲和配体的影响为了进一步探究不同类型金属亲和配体对固定化蛋白酶性能的影响，我们分别采用了不同金属离子和配体进行实验。

结果表明，不同金属亲和配体会影响固定化蛋白酶的催化性能和稳定性。

因此，在选择金属亲和配体时，需要根据实际应用需求进行综合考虑。

五、实际应用及展望基于金属亲和的固定化蛋白酶在生物催化、生物分析和生物制药等领域具有广泛的应用前景。

例如，在食品工业中，可用于生产氨基酸、有机酸等；在医药领域，可用于合成药物中间体和手性药物等。

电场对酶学效应的研究进展
王娟娟;王顺喜;秦玉昌;李军国;马微
【期刊名称】《江西农业学报》
【年(卷),期】2008(020)002
【摘要】概述了近年来国内外有关电场对多种酶的活性、构象、酶动力学效应的研究进展,指出了电场在酶学实际应用中存在的问题,并展望了电场在酶学上的应用前景.
【总页数】4页(P81-83,86)
【作者】王娟娟;王顺喜;秦玉昌;李军国;马微
【作者单位】中国农业大学,工学院,北京,100083;中国农业大学,工学院,北
京,100083;中国农业科学院,饲料所,北京,100081;中国农业科学院,饲料所,北京,100081;黑龙江省东宁出入境检验检疫局,黑龙江,东宁,157200
【正文语种】中文
【中图分类】Q55
【相关文献】
1.高压静电场对生物效应影响的研究进展 [J], 张俐;申勋业;杨方
2.高压静电场对植物生物学效应的研究进展 [J], 高伟娜;顾小清
3.磁场对酶学效应影响的研究进展 [J], 王山杉;李琳;李冰
4.铁电场效应晶体管:原理、材料设计与研究进展 [J], 陆旭兵;李明;刘俊明
5.秸秆还田的土壤酶学及微生物学效应研究进展 [J], 裴鹏刚;张均华;朱练峰;禹盛苗;胡志华;金千瑜
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磁性可再生性固定化酶制备及其在微波辅助蛋白酶解中的应用韦美苹;庞玉凤;陈正毅;苏日辉;杜甫佑;阮贵华【摘要】将磁性可再生性固定化酶应用于微波辅助蛋白酶解。

包覆了 SiO2的Fe3 O4磁性粒子（Fe3 O4＠mSiO2）表面经3-（2，3-环氧丙氧）丙基三甲氧基硅烷偶联剂（GLYMO）与亚氨基二乙酸（IDA）反应的产物（GLYMO-IDA）修饰，加入Cu2＋形成金属螯合配体后利用Cu2＋与木瓜蛋白酶作用固定木瓜蛋白酶。

在优化条件下，获得的固定化酶酶活为1158.8 U，酶活保留率达44.1％。

所获得的固定化木瓜蛋白酶具有易再生、再生后酶活稳定的特点。

再生5次后酶活平均值为1014 U，再生率达88％。

HPLC分析表明，微波辅助结合固定化可再生酶可用于黑蚂蚁蛋白的快速酶解，获得的色谱图轮廓与自由酶酶解结果相似。

酶解过程快，多肽丰富且易与底物分离，表明可再生固定化酶结合微波辅助有助于蛋白的酶解与多肽的制备。

%The magnetic regenerated immobilized papain is applied for microwave assisted enzymatic digestion (MAED).Fe3O4 magnetic nanoparticles were coated with SiO2by sol-gel method andFe3O4@ mSiO2 were formed and then modified by the reaction products of 3-Glycidyloxy propyl trimethoxy silane coupling agent (GLYMO)and iminodiacetic acid (IDA).After Cu2+was chelated on the Fe3 O4@mSiO2-GLYMO-IDA,the papain was immobilized on.In optimized conditions,the activity of the immobilized papain was 1 158.8 U and the rate of remained activity of papain was 44.1%.After five times of regeneration,the average activity of the immobilized papain was 1 014 U and regeneration rate was about 88%.Coupled with MAED,the immobilized papain was applied for black ants protein digestion.The HPLC analysis shows that during 30min,the digestion product from immobilized papain MAED could be easily separated from the substrate and its responding HPLC profiles were similar to the product from free papain digestion,reflecting that the digestion speed of black ants protein with immobilized papain was fast and efficient.When protocol is combined with immobilized enzyme, MAED would be helpful for the protein digestion and potential peptides preparation.【期刊名称】《桂林理工大学学报》【年(卷),期】2014(000)004【总页数】7页(P748-754)【关键词】磁性粒子;固定化酶;木瓜蛋白酶;黑蚂蚁蛋白【作者】韦美苹;庞玉凤;陈正毅;苏日辉;杜甫佑;阮贵华【作者单位】桂林理工大学化学与生物工程学院，广西桂林 541004;桂林理工大学化学与生物工程学院，广西桂林 541004;桂林理工大学化学与生物工程学院，广西桂林 541004;桂林理工大学化学与生物工程学院，广西桂林 541004;桂林理工大学化学与生物工程学院，广西桂林 541004;桂林理工大学化学与生物工程学院，广西桂林 541004【正文语种】中文【中图分类】Q814.2近年来多肽研究受到人们的重视。

交变电场对过氧化物酶活性影响的研究卢倩倩;刘辉兰【摘要】The activity of peroxidase extract from mung bean leaves is studied in the influence of alternating electric field treatment.The activityof peroxidase is significantly enhanced in 600 mV voltage,5 MHz frequency of alternating electric field,1~3 min of processing time,it＇s max is 55.68 at 1 min;In 5 MHz frequency of alternating electric field,5 min of processing time,the activity of peroxidase is enhancing gradually from the curb to the boost go with the voltage enhancing,it＇s max is 57.18 at 600 mV;When 600 mV voltage of alternating electric field,change the frequency,The activity of peroxidase attenuate and even is curbed at lower frequency,it＇s minimum is 41.7 at 2 MHz frequency,it＇s max is 60.54 at 4MHz frequency.%研究了交变电场对从绿豆叶片中提取的过氧化物酶活性的影响.交变电场电压为600 mV,频率为5MHz的条件下,处理时间在1~3 min范围内酶活性显著提高,1 min时最高为55.68;频率为5 MHz,改变电压处理5 min时,随着电压升高酶活性由抑制到促进逐渐增强,电压为600 mV时酶活最高达57.18;电压值为600 mV,改变频率处理5 min时,低频情况下过氧化物酶活性较低甚至被抑制,频率为2 MHz时酶活性最低为41.7,当频率为4 MHz时酶活性最强达60.54.【期刊名称】《德州学院学报》【年(卷),期】2011(027)004【总页数】5页(P36-39,55)【关键词】过氧化物酶;交变电场;抑制;促进【作者】卢倩倩;刘辉兰【作者单位】德州学院物理系,山东德州253023;德州学院物理系,山东德州253023【正文语种】中文【中图分类】O4地球上空的电离层对地面具有360kV的正电位，地面附近的场强为130V／m，生物生存在这样一个巨大的电场中，其电荷分布、排序以及运动都有一定的规律性，在长期进化过程中，生物逐渐适应了这一电场环境.当这一环境发生变化时给生物带来什么样的影响，以及产生什么生物效应已引起科学界的极大关注［1］.研究发现，在电场、磁场作用下，生物体内的酶活性会发生变化，过氧化物酶对植物生长及抗逆性有重要作用，它的底物特异性受多种因素影响，其中酶复合物中Fe＝OR ＋＊中心的还原电位最为重要［2］.而铁原子对电场的作用很敏感，有可能影响酶的结构和功能.为此，研究了电场处理对绿豆叶片中提取的过氧化物酶（POD）活性的影响，为电场处理技术在植物病虫害防治中的应用及生物机制的研究提供一定的理论依据.细胞在正常代谢条件下，活性氧的产生与清除处于动态平衡中.当环境胁迫长期作用于植物体，其产生的活性氧浓度如果超出活性氧解毒系统的能力时，细胞就会受到氧化损伤.细胞质膜、细胞器膜等生物膜中不饱和脂肪酸易被氧化，变硬变脆，致使膜功能改变，膜结构受破坏，严重时导致细胞死亡［3］.为保证活性氧产生与清除之间的动态平衡，有氧生物体在生物进化过程中，进化成一套行之有效的清除活性氧的保护系统.过氧化物酶是植物在逆境条件下酶促防御系统的关键酶之一，它与超氧化物歧化酶、过氧化氢酶相互协调配合，清除过剩的自由基，使体内自由基维持在一个正常的动态水平［4］.过氧化物酶（POD）是一种由单一肽链与卟啉构成的血红素蛋白，脱辅基蛋白分子须与血红素结合才构成全酶.POD蛋白的分子量范围为35～100 KD，多序列比较表明，过氧化物酶的二级结构的折叠方式高度保守，酶分子由两个不同结构域组成，中间包埋着血红素，结构域部分由10或11个α－螺旋组成，螺旋之间由环和转角链接，很少有β－折叠结构.含铁过氧化物酶是一类结构相似功能相同的酶，都是通过一个二质子二电子还原过程催化H2O2对底物的氧化［5］.过氧化物酶主要存在于细胞的过氧化物酶体中，可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用，对于植物抗逆性及抗病虫害有重要作用，它普遍存在于真核生物的各类细胞中，是活性较高的一种酶.植物体中含有大量过氧化物酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系.绿豆幼苗、LabTech紫外分光光度计、TGL20M高速离心机、DJC—Ⅱ型介电常数测定仪，XFG—7型高频信号发生器、RIGOL DS5062C型示波器、药品一宗、玻璃器皿等.3.1 过氧化物酶的提取取绿豆叶片0.1g加入预冷的20mmol／L KH2PO41mL和少量石英砂进行冰浴研磨，将研磨液移至离心管中，每转移一次，充分清洗研钵.匀浆移入离心管后，用20mmol／L KH2PO4冲洗研钵后的液体加入离心管中定溶至1.5mL处，以12 000 r／min离心15min，收集上清液即为过氧化物酶粗提液.3.2 过氧化物酶的处理将过氧化物酶粗提液分别经过电压为600 mV，频率为5MHz的交变电场处理1min、3min、5 min、7min、9min；频率为5MHz，电压值为200 mV、300mV、400mV、500mV、600mV、700mV的交变电场处理5min；电压值为600mV频率为0.5MHz、1MHz、2MHz、3MHz、4MHz、5MHz、6MHz、7MHz、8MHz的交变电场处理5min；然后取光程为1cm的玻璃比色杯2只，一只加入反应液3mL和1mL20mmol／L KH2PO4作为较零组.另一只加入反应液3mL，处理后的过氧化物酶液体1mL，分别测量470nm波长处吸光度的变化，每隔一秒钟记录一次吸光度值，总共测3min.3.3 过氧化物酶活性的计算以每分钟A470处吸光度变化0.01为一个相对的酶活单位，采用origin数据处理系统软件对试验数据进行拟合［6］，计算绿豆叶片内过氧化物酶活力的大小（单位：U／g鲜重）.4.1 交变电场处理时间对过氧化物酶活性的影响用origin数据处理系统软件对试验数据进行线性拟合，计算电压为600mV频率为5MHz的交变电场处理不同时间后的过氧化物酶活性值，结果见表1，利用origin画图软件画出过氧化物酶活性值随电场处理时间变化曲线如图1所示.图1表明在电压为600mV，频率为5MHz的电场条件下，处理时间在1～9min 内，过氧化物酶的活性随着处理时间显著变化：先是随着时间的增加而增加，在1～5min时间范围内酶的活性最强，并且基本不随时间变化，在5～9min时间范围酶的活性随着处理时间的增加迅速减小.当处理时间为9min时，过氧化物酶活性被抑制.有研究结果表明，除了溶菌酶和胃蛋白酶，其他酶的活性都是随着场强的增大而下降，每种酶的活性变化各不相同［7］.过氧化物酶含有顺磁性的活性中心－Fe2＋，电场处理能提高酶的活性，可能与POD酶含有金属离子有关.金属离子在电场的作用下发生定向排列，引起了酶构象的变化，酶构象的改变与酶活性变化间存在密切的关系，从而引起酶活性的变化，最终激活了酶［8］.已知强磁场下产生的电流过大，使细胞内电荷运动方向和生物分子空间结构错位，生物分子之间的亲和力被破坏，抑制细胞周期的正常进行，导致细胞分裂停止，从而对酶的活性产生了抑制作用［9］，电场强度过高时，可能也发生了类似的变化致使过氧化物酶活性降低.4.2 交变电场电压对过氧化物酶活性的影响利用与4.1中相同的方法计算在电场频率为5 MHz，不同电压条件下处理5min 后过氧化物酶的活性值，结果见表2.利用origin画图软件画出过氧化物酶活性值随交变电场电压值的变化曲线，如图2所示.图2表明在频率为5MHz的电场下处理5min后，在电压为200mV到700mV 范围内，过氧化物酶的活性随着交变电场电压的变化呈现先增加后减小的趋势；当电压600mV时，酶活性最强；电压高于600mV时，酶活性减弱甚至被抑制；电压低于600mV时，在200mV、300mV低电压的电场处理也出现过氧化物酶活性被抑制的现象，原因可能是只有电压值达到某一临界值，酶活性才会被激活，低于或高于这一临界值时，酶活性会被抑制.类似关系梁国珍等已经证明：酶的失活程度与所处的电场强度E直接相关，假设在电场强度低于某个值时，该电场对酶没有钝化作用，电场强度达到该值时对酶开始有钝化作用［10］.4.3 交变电场频率对过氧化物酶活性的影响利用4.1中同样的方法计算电压为600mV频率为0.5～8MHz的交变电场条件下处理5min后，过氧化物酶活性值，结果见表3，利用origin数据处理系统软件画出过氧化物酶活性值随交变电场频率的变化曲线，如图3所示.图3表明在电压为600mV，不同频率（频率范围为0.5～3MHz）的交变电场条件下处理5min时酶的活性稍有促进或抑制，但都与对照组酶的活性相差不大，其中频率为2MHz时酶的活性最低，可能原因是频率较低时，过氧化物酶内部分子随电场震动较大，使酶的结构发生变化，酶活性降低甚至被抑制，李婷婷的研究表明：过氧化物酶属于金属酶类，当外加电场时，可能造成酶空间位置的偏移，从而影响酶的活性［11］.随着频率增高，过氧化物酶活性被促进，频率为4MHz时酶活性最高，频率为5～7MHz时酶活性降低但仍是促进作用.可能原因是频率为4MHz时，酶内部分子与电场振动达到共振，酶活性区发生变化使酶的活性最高，超过这一频率值时，分子振动减弱，酶的活性再次降低.陈宜观察过类似现象，随着脉冲数增大酶活性先升高再降低［12］.当频率为8MHz时，酶的活性再次升高，可能原因是频率升高达到某一值时，酶分子不再振动而是吸收电场能量，酶的活性升高.研究发现交变电场的电压、频率以及处理时间都对过氧化物酶活性产生了影响，其中电压值为600mV频率为4MHz时酶活性最强达60.54.频率为5MHz电压值为700mV时酶活性最低为38.64.具体结果为：电压为600mV频率为5MHz处理时间为1～3min时酶活性显著提高，1min时最高为55.68，随着时间增加酶活性逐渐降低，9 min时酶活性被抑制；当频率为5MHz电压值为200～700mV的电场处理5min，在电压值较低时，随着电压值的升高酶活性由抑制到促进逐渐增强，当电压值为600mV时酶活性最高达57.18，超过这一值时酶活性减弱至被抑制；电压值为600mV频率为0.5～8MHz的电场处理5min后，频率较低时过氧化物酶活性较低甚至被抑制，在频率为2MHz时酶活性最低为41.7，但随着频率的增加过氧化物酶活性增强，当频率为4MHz时酶活性最强达60.54，随着频率增加过氧化物酶活性稍有降低但仍被促进，当频率达到8MHz时酶活性再次升高.因为过氧化物酶的底物特异性受多种因素影响，其中酶复合物中Fe＝OR＋＊中心的还原电位最为重要，而铁是顺磁性物质，随电场变化而变化，所以会引起酶的结构的变化进而影响酶的活性，因此当电场变化时POD酶活性会发生很大变化.通过电场处理增强过氧化物酶活性，进而增强植物的抗逆性，应用此技术育种必定会为电场处理技术在植物病虫害防治中的应用及生物机制的研究提供一定的理论依据.【相关文献】［1］高伟娜.高压静电场对老化水稻种子活力的影响及机理研究［M］.重庆：重庆大学出版社，2005.［2］刘稳.植物过氧化物酶超家族的分子结构［J］.生命科学，2002，14（4）：212－214. ［3］曹锡清.脂质过氧化对细胞与机体的作用［J］.生物化学与生物物理进展，1986，2：17－23. ［4］蒋明义.水分胁迫下植物体内的OH产生与细胞的氧化损害［J］.植物学报，1999，41（3）：229－234.［5］阙瑞琦.莲藕过氧化物酶的分离纯化、性质研究及固定化初探［M］.重庆：西南大学出版社，2008.［6］叶卫平，方安平，于本方.Origin7.0科技绘图及数据分析［M］.北京：机器工业出版社，2004.［7］梁国珍.高压脉冲电场对POD活性及各级结构的影响［D］.福州：福建农林大学，2008. ［8］梁国珍，孙沈鲁，陈梅英，等.高压脉冲电场对辣根过氧化物酶活性及构象影响［J］.食品与机械，2008，5（24）：3.［9］栗杰，焦颖，依艳丽，等.磁场对棕壤过氧化氢酶和过氧化物酶活性的影响［J］.沈阳大学学报，2007，38（1）：70－74.［10］梁国珍，孙沈鲁，陈锦权.高压脉冲电场对HRP活性及构象的影响和分子模拟其构象改变的研究［J］.中国食品学报，2009，9（3）：5－13.［11］李婷婷.高压脉冲电场对大蒜、洋葱和生姜抗氧化物质的影响［D］.长春：吉林农业大学，2008.［12］陈宜.POD和PG酶在高压脉冲电场中失活动力学研究［D］.福州：福建农林大学，2007.。

固定化γ-谷氨酰转肽酶催化合成γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸宋希文;周治;姚忠;肖彦羚;徐虹;韦萍【期刊名称】《化学反应工程与工艺》【年(卷),期】2009(025)005【摘要】以环氧基树脂Eupergit C250L为载体对B.subtilis NX-2 GGT进行了共价固定化.固定化酶的最适作用pH为9.0,最适作用温度为60℃.固定化酶的热稳定性和贮存稳定性均较游离酶有显著的提高,经100 d 20个批次转化后,固定化残余酶活仍能保持初始值的80%左右.以固定化酶为催化剂,在反应条件为L-谷氨酰胺(Gln)20 mmol/L、S-苄基-半胱氨酸(S-Bzl-cys)20 mmol/L、酶浓度0.0375U/mL和pH 9.0条件下,40℃水浴反应22 h,转肽产物S-苄基-y-L-谷氨酰-L-半胱氨酸(S-Bzl-GGC)得率为4.3 mmol/L,较游离酶提高了11.96%.S-Bzl-GGC经酸解脱除保护基后可得γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸,产物纯度可达94.1%.【总页数】6页(P420-425)【作者】宋希文;周治;姚忠;肖彦羚;徐虹;韦萍【作者单位】南京工业大学食品与轻工学院,江苏,南京,210009;南京工业大学食品与轻工学院,江苏,南京,210009;南京工业大学食品与轻工学院,江苏,南京,210009;南京工业大学食品与轻工学院,江苏,南京,210009;南京工业大学食品与轻工学院,江苏,南京,210009;南京工业大学食品与轻工学院,江苏,南京,210009【正文语种】中文【中图分类】Q503;Q555.3【相关文献】1.γ-L-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸对肝星状细胞线粒体功能的影响 [J], 张笔觅;孙瑞波;吕智超;杨明静;李万良2.γ-谷氨酰转肽酶法合成γ-L-谷氨酰-L-酪氨酸 [J], 佘维娜;周治;姚忠;徐虹;韦萍3.γ-谷氨酰转肽酶补料法合成L-茶氨酸工艺研究 [J], 傅嘉懿;陈晟;吴敬4.利用重组枯草芽孢杆菌产Bacillus pumilus来源的γ-谷氨酰转肽酶及其在L-茶氨酸合成中的应用 [J], KOMERA Irene; 杨套伟; 张显; 饶志明; 徐美娟5.化学酶法合成γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸 [J], 吴明刚;姚忠;李松;周治;荀志金;徐虹;韦萍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。