Ion torrent微生物(细菌)全基因组重测序文库构建实验方案

Ion Torrent 技术Ion Torrent已经发布了一个商业化的仪器——1个新的半导体芯片——直接将化学信号转换成数字信号。

该仪器的第一个技术应用就是进行DNA测序。

该仪器充分利用了几十年的半导体研究成果，在短短几年内就给整个的工业设计、制造和供应链基础设施带引入——1万亿美元的投资空间——迎接测序的挑战。

该挑战带来的结果就是Ion半导体测序，第一个不需要光学系统的商业测序仪，且提供了一个前所未有的测序速度，扩增规模和低成本。

该技术在几个月内将测序规模从第一代含有一百多万个微传感器的Ion 314芯片扩展到七百多万个微传感器的二代Ion 316芯片——所有的运行时间都保持在1到2个小时之内（图1）。

该测序的化学反应非常简单。

一般地，DNA聚合酶将一个核苷酸渗入到DNA 分子中就会释放出一个质子，导致局部可被检测的pH值变化。

每个Ion Torrent 半导体微孔测序芯片中含有将近一百多万个DNA分子拷贝。

Ion PGM测序仪按照一个核苷酸接一个核苷酸的微芯片流测序。

在一个特定的微孔中，如果模板DNA分子上的一个互补的核苷酸被合成，微孔就会释放出一个氢离子。

然后溶液的pH值改变并被离子传感器检测到，基本上直接将该化学信号转变为数字信号。

如果DNA链上有两个相同的碱基，检测到的电压双倍，芯片则记录两个相同的碱基。

如果模板上的下个核苷酸与微芯片流的核苷酸不匹配，则检测不到电压，也不会记录碱基。

因该法是直接检测DNA 合成，不需要扫描，摄像机，荧光等环节，几秒钟就可检测合成插入的碱基，大大缩短了运行时间。

工作流程Ion Torrent个人基因组测序仪的操作流程非常简单。

第一步是产生两端有Ion Torrent接头的测序DNA片段的文库。

这一步可以通过直接将接头固定在PCR 产上或者在设计PCR引物的时候直接在引物的5’端加上Ion的接头序列来实现。

然后，文库的片段被克隆到专门的离子微球颗粒上，再通过微乳液PCR进行扩增。

利用生物大数据技术进行基因组重测序分析的步骤基因组重测序分析是一种通过检测DNA序列来研究生物基因组的技术。

近年来，随着生物大数据技术的进步，基因组重测序分析已经成为研究生物多样性和进化的重要手段。

在本文中，我们将探讨利用生物大数据技术进行基因组重测序分析的具体步骤。

第一步：准备样本和测序仪器在进行基因组重测序分析之前，我们首先需要准备样本和测序仪器。

样本可以是任何生物体的DNA，例如细菌、真菌、植物或动物。

而测序仪器可以是Illumina、PacBio或Ion Torrent等商业化的高通量测序仪器。

根据样本的需求和研究目的，选择合适的测序仪器进行测序。

第二步：提取DNA并进行文库构建提取DNA是基因组重测序分析的关键步骤之一。

样本中的DNA需要经过特定的提取方法，例如酚/氯仿方法或商用DNA提取试剂盒，以获得高质量的DNA。

提取的DNA随后需要进行文库构建，即将DNA片段连接到测序适配体上。

文库构建的方法有多种选择，例如Illumina的TruSeq文库构建方法或NEBNext Ultra DNA文库构建方法，根据实验需求选择合适的方法进行文库构建。

第三步：测序数据质量控制在进行基因组重测序之前，我们需要对测序数据的质量进行控制。

质量控制的目的是检查测序数据是否具有良好的准确性和可靠性。

常见的质量控制方法包括使用FastQC软件分析测序数据的质量值、测序错误率和GC含量等信息。

根据质量控制结果，我们可以选择性地去除低质量的测序数据以提高后续分析的准确性。

第四步：测序数据比对测序数据比对是基因组重测序分析的核心步骤之一。

它的目标是将测序数据准确地与参考基因组进行比对，以鉴定基因组的变异位点和基因功能。

比对软件有许多选择，例如BWA、Bowtie2和STAR等。

在比对的过程中，质量控制的结果可以帮助我们在特定的阈值下筛选出可靠的比对结果。

第五步：变异位点检测和注释在比对完成后，我们可以开始进行变异位点的检测和注释。

ChIP-Seq文库构建方法一、样本要求1）浓度≥10ng/μL，总量≥200ng，OD260/280为1.8-2.2，若单次ChIp的量不够，建议将2-3次ChIp的DNA合并在一起2）提供DNA片段大小的凝胶电泳图，要求片段大小不超过400bp3）样品用1.5mL离心管，用Parafilm封口，冰袋保存二、流程ChIP DNA↓Qubit定量↓末端修复↓ChIP DNA片段大小选择及纯化↓加接头、纯化↓文库扩增↓纯化↓文库检测（Qubit定量、Agilent检测）三、步骤1.末端修复对ChIP DNA样品进行Qubit定量检测，将待测DNA浓度稀释为0.2ng/μL 向一支新的1.5mL LoBind管中按顺序加入下列组分ChIP DNA，10ng 50μLNuclease-free Water 29μL5×End Repair Buffer 20μLEnd Repair Enzyme 1μLTotal 100μL室温下放置20分钟2.片段选择末端修复的ChIP DNA采用Agencourt AMPure XP Kit进行两轮片段筛选。

第一轮筛选过程将＞250bp的片段富集到磁珠上，小于250bp的片段留在上清液中。

第二轮筛选使用第一轮的上清液，加入新的磁珠，将100bp以上的片段筛选出来，保留磁珠。

磁珠捕获的DNA片段大小在100-250bp之间，洗脱并富集。

步骤：第一轮筛选1）向ChIP DNA体系中加入150μL无核酸酶水，使总体积为250μL2）向样品中加入225μL Agencourt AMPure XP Reagent，上下颠倒五次混匀，瞬时离心，室温下放置5分钟3）瞬时离心，将离心管放置到磁力架（如DynaMag-2）上3min，至溶液澄清4）小心将上清转移到一支新的1.5mL离心管，留下约20μL于原来的体系中5）装有磁珠的离心管瞬时离心后，放回到磁力架上至溶液澄清，将上清液小心转移到第四步的离心管中，丢弃磁珠第二轮筛选1）向装有第一轮筛选上清液的1.5mL离心管内加入100μL Agencourt AMPure XP Reagent beads，上下颠倒混匀5次，瞬时离心，室温下放置5分钟2）离心管瞬时离心后，放置于磁力架上3min，至溶液澄清，小心除去上清3）离心管保留在磁力架上，向管内加入500μL新配置的70%乙醇，静置30s，在磁力架上颠倒离心管两次使磁珠混合，待上清澄清后，除去上清4）重复步骤3）5）离心管瞬时离心后，将离心管放置到磁力架上，用20μL枪头小心除去多余的乙醇6）将离心管留在磁力架上，室温下风干不超过5min7）将离心管从磁力架上取下，加入25μL Low TE，上下颠倒混匀5次，旋窝震荡10s8）瞬时离心，将离心管放置到磁力架上1分钟，待溶液澄清后，将上清转移至一支新的0.2mL PCR管3.接头连接和纯化3.1 接头连接和缺口修复向0.2mL PCR管中按顺序加入下列物质End-repair ChIP DNA 25μL10×Ligase Buffer 10μLIon P1 Adaptor,1:16 1μLIon Xpress Barcode X+,1:16 1μLdNTP Mix 2μLNuclease-free Water 51μLDNA Ligase 2μLNick Repair Polymerase 8μLTotal 100μL体系按照以下循环进行1轮循环扩增25℃15min72℃5min4℃Hold3.2 纯化1）体系中加入140μL（1.4倍样品体积）Agencourt AMPure XP Reagent，上下颠倒混匀5次，瞬时离心后，室温放置5min2）瞬时离心后，将离心管放置到磁力架上3min至上清澄清，小心除去上清3）离心管保留在磁力架上，加入500μL新配置的70%乙醇，静置30s，在磁力架上颠倒离心管两次，待溶液澄清后，除去上清4）重复步骤3）5）离心管瞬时离心后，将离心管放置到磁力架上，用20μL枪头小心除去多余的乙醇6）将离心管留在磁力架上，室温下风干不超过5min7）将离心管从磁力架上取下，加入25μL Low TE，上下颠倒混匀5次，旋窝震荡10s8）瞬时离心，将离心管放置到磁力架上1分钟，待溶液澄清后，将上清转移至一支新的1.5mL PCR管4.文库扩增及纯化4.1 文库扩增向上一步的1.5mL离心管中加入以下物质Platinum PCR SuperMix High Fidelity 100μLLibrary Amplification Primer Mix 5μLLigated ChIP DNA（unamplified library）25μLTotal 130μL按照一下循环进行10-15轮循环扩增95℃5min95℃15s58℃15s 10-15循环70℃1min4℃hold4.2 扩增产物纯化第一轮纯化（除去250bp以上的片段）使用1.5倍样品体积的Agencourt AMPure XP Reagent步骤：1）向PCR扩增产物中加入195μLAgencourt AMPure XP Reagent（1.5倍样品体积），上下颠倒混匀5次，瞬时离心后，室温放置5min2）离心管瞬时离心后，放置到磁力架上3分钟，至澄清，小心除去上清液3）保持离心管于磁力架上，向管内加入500μL新配置的70%乙醇，静置30s，上下颠倒混匀，待澄清后，除去上清液4）重复第三步5）离心管瞬时离心，放回磁力架，待澄清后，用20μL枪头将上清吸去6）保持离心管在磁力架上，室温风干不超过5min7）取下离心管，加入50μL Low TE缓冲液，上下颠倒混匀5次，旋窝震荡10s 8）将离心管放置到磁力架上，待溶液澄清后，将上清转移到一支新的1.5mL离心管第二轮纯化（回收100-250bp的片段）向体系内加入1.5倍体积的Agencourt AMPure XP Reagent进行二轮纯化1）向PCR扩增产物中加入75μL Agencourt AMPure XP Reagent（1.5倍样品体积），上下颠倒混匀5次，瞬时离心后，室温放置5min2）离心管瞬时离心后，放置到磁力架上3分钟，至澄清，小心除去上清液3）保持离心管于磁力架上，向管内加入500μL新配置的70%乙醇，静置30s，上下颠倒混匀，待澄清后，除去上清液4）重复第三步5）离心管瞬时离心，放回磁力架，待澄清后，用20μL枪头将上清吸去6）保持离心管在磁力架上，室温风干不超过5min7）取下离心管，加入25μL Low TE缓冲液，上下颠倒混匀5次，旋窝震荡10s 8）将离心管放置到磁力架上，待溶液澄清后，将上清转移到一支新的1.5mL离心管9）将装有DNA的离心管放置到磁力架上，保持1分钟，将上清转移至另一支新的1.5mL离心管5.文库片段检测及定量采用Agilent Test以及Qubit Qualify片段大小在100-400bp，片段浓度不低于1μL/mL需要用到的试剂盒：Ion Plus Fragment KitIon Xpress Barcode Adapters 1-16 Agencourt AMPure XP Kit DynaMag-2磁力架。

全基因组测序实验流程英文回答：Genome sequencing is a powerful technique used to determine the complete DNA sequence of an organism's genome. It provides valuable information about the genetic makeupof an individual or a species, allowing researchers tostudy the structure and function of genes, identifydisease-causing mutations, and understand evolutionary relationships.The process of whole-genome sequencing involves several steps. First, DNA samples are obtained from the organism of interest. These samples can be collected from blood, saliva, or tissue samples. Next, the DNA is extracted and purifiedto remove any contaminants. This ensures that the sequenced DNA is of high quality and free from interference.Once the DNA is purified, it is fragmented into smaller pieces. This can be done using physical methods, such assonication, or enzymatic methods, such as restriction digestion. The resulting DNA fragments are then ligatedwith adapters, which allow for the attachment of sequencing primers.The prepared DNA fragments are then amplified using a process called polymerase chain reaction (PCR), which produces multiple copies of the DNA fragments. This step is necessary to ensure that there is enough DNA for sequencing.The next step is sequencing the DNA fragments. Thereare several sequencing technologies available, including Sanger sequencing and next-generation sequencing (NGS). Sanger sequencing, also known as capillary electrophoresis sequencing, was the first method developed for DNA sequencing. It involves the use of fluorescently labeled nucleotides to determine the sequence of the DNA fragments.NGS technologies, such as Illumina sequencing andPacific Biosciences sequencing, have revolutionized thefield of genomics. These methods allow for the simultaneous sequencing of millions of DNA fragments, resulting in amuch faster and more cost-effective process.After sequencing, the raw data is generated in the form of short DNA sequences called reads. These reads are then aligned to a reference genome or assembled de novo to reconstruct the complete genome sequence. This step requires advanced bioinformatics tools and algorithms to accurately assemble the reads.Finally, the assembled genome sequence is analyzed to identify genes, regulatory elements, and other functional elements. This can involve comparing the genome sequence to known databases, predicting gene coding regions, and studying the genetic variation within the genome.中文回答：全基因组测序是一种强大的技术，用于确定生物体基因组的完整DNA序列。

“Iontorrent微生物（细菌）全基因组重测序文库构建实验方案”清晨的阳光透过实验室的窗户，洒在略显拥挤的操作台上，我的思绪开始像电流一样流转，10年的方案写作经验让我对每一个细节都了如指掌。

就让我们一起探索这个关于Iontorrent微生物（细菌）全基因组重测序文库构建的实验方案吧。

我们要明确实验的目的：通过Iontorrent平台，对微生物（细菌）进行全基因组重测序，以获取更准确、更全面的基因组信息。

那么，就是具体的步骤了。

一、实验材料与仪器1.材料：微生物（细菌）样本、DNA提取试剂盒、磁珠、PCR试剂、测序试剂盒等。

2.仪器：Iontorrent测序仪、离心机、PCR仪、磁珠分离器、凝胶成像仪等。

二、实验步骤1.样本处理：将微生物（细菌）样本进行适当的预处理，如离心、洗涤等，确保样品的纯净度。

2.DNA提取：使用DNA提取试剂盒，按照说明书操作，提取微生物（细菌）的基因组DNA。

3.DNA定量：利用纳米滴技术或紫外可见分光光度计，对提取的DNA进行定量，以确保DNA的浓度和纯度。

4.DNA片段化：将提取的DNA进行片段化处理，使其成为适合测序的片段大小。

5.文库构建：将片段化的DNA与测序适配器连接，通过PCR扩增，构建测序文库。

6.文库质检：利用凝胶成像仪，对构建的文库进行质检，确保文库的质量。

7.测序：将质检合格的文库上机测序，使用Iontorrent测序仪进行测序。

8.数据分析：将测序得到的原始数据进行质控、比对、组装等分析，得到微生物（细菌）的全基因组序列。

9.结果验证：对测序结果进行验证，如通过PCR、一代测序等方法，确保测序结果的准确性。

三、注意事项1.实验过程中，要注意无菌操作，避免样本污染。

2.操作过程中，要严格按照说明书进行，确保实验的准确性。

3.测序数据的质量控制和分析是关键步骤，要密切关注每个环节，确保结果的可靠性。

4.实验过程中，要随时记录实验数据和操作过程，以便后续的数据整理和分析。

这里为您介绍二代测序的相关流程和应用。

随着人类基因组工程的完成，对于低花费的测序技术的需求促进了高通量二代测序技术的发展。

这些新的测序平台允许进行高通量测序，具有广泛的应用：全基因组从头测序或者重测序目标序列重测序转录组分析微生物组研究基因调控研究NGS序歹y二代测序仪器有很多种组合，在通量、片段长度、准确度、每一轮测序成本、每百万碱基对测序成本、初始成本、规格和技术方面存在存在差异。

从规格和初始成本的角度而言，二代测序仪器可轻松地分类为更窄的范围，也就是所谓的“台式测序仪”和高通量仪器。

台式测序仪使得任何实验室都可以像使用real-time PCR —样，自己进行测序。

这些仪器可以和一些靶标序列富集技术相结合，用在一些临床的应用中，其中：选定的靶标基因用于深度分析，以检测稀有的突变，或者检测多样样本中（比如癌症样本）中的突变。

目前，这些仪器的通量在10 Mb到Gb之间，但是随着硬件，软件和试剂的持续改善，通量也在稳步增加。

高通量测序仪非常适合于大量的，基因组范围的研究，每次测序能测定600 Gb的序列。

一些这样的高通量和高精度的平台，能测定的片段长度相对较短，这对于高重复性的序列和未知基因组的从头测序就可能成为问题。

与此相反，也有一些仪器能测序的片段较长（达到2500 bp ），但是其精度和测序能力（90 Mb）要低很多。

还有一些测序能力位于两者之间的仪器（~800 bp，700 Mb）。

因此，应用决定了哪一种仪器是最合适的。

有一种新的方法被称作“纳米孔测序”。

这种技术中，根据一个DNA链通过一个合成的或者蛋白纳米孔道所引起的电流的改变，可以确定通过这个孔道的碱基。

这理论上可以仅用一步就测序一个完整的染色体，而不需要生成新的DNA链。

DNA测序二代DNA测序的工作流程如下：DNA样本制备文库构建和验证文库分子大规模平行克隆扩增测序二代测序DNA羊本的质量控制首先，评价基因组DNA勺质量是非常必要的（完整性和纯度）。

ion torrent测序原理
Ion Torrent测序技术基于单核苷酸添加和释放（Single-
nucleotide addition and release）的原理。

该技术通过在DNA模板与
合适的引物、荧光标记和离子检测器中进行PCR扩增和DNA合成，在合成
一条长串DNA的同时检测出每一位碱基的序列信息。

具体步骤如下：
1.准备DNA样本并将其断裂成片段。

2.将DNA片段通过PCR扩增形成一个DNA模板，该模板上的DNA每一
位碱基上需要配对一个反向互补的引物。

3.将模板置于一台Ion Torrent测序器中，在模板上添加一种特殊的
试剂，这种试剂含有一种核苷酸，并且只允许在特定碱基上添加一个碱基。

当这个碱基添加到模板上之后，会释放出一个氢离子并造成一个微弱的电
位变化。

4.通过控制微小的电位变化，Ion Torrent测序器可以检测出新添加
的碱基的种类和位置，也就是测序结果。

一旦这个新碱基被检测出来，就
将它们切割掉，并继续在该位点上重复此过程，直到测序完成。

5.利用计算机对这串测序结果进行分析，并将它们与已知的基因组序
列进行比较，以确定DNA中任何变异或SNP的存在。

全基因组重测序原理
全基因组重测序是一种通过高通量测序技术对一个个体的完整基因组进行全面测序的方法。

它可以揭示个体的所有基因组变异，包括单核苷酸多态性（SNPs）、插入缺失（Indels）、结构变异和基因组重排等。

全基因组重测序的原理基于高通量测序技术，如Illumina测序、Ion Torrent测序等，通过将DNA样本分离成小片段，然后使用测序仪对这些片段进行测序，最终将这些片段拼接成完整的基因组序列。

在全基因组重测序中，首先需要提取DNA样本，然后将DNA样本打断成小片段。

接下来，这些小片段会被连接到测序适配器上，并进行PCR扩增，形成一个文库。

随后，这个文库会被加载到测序仪中进行测序，产生大量的短序列读段。

这些读段会被拼接成完整的基因组序列，并且通过与基因组参考序列进行比对，可以识别出个体的基因组变异。

全基因组重测序的原理是基于高通量测序技术的快速、准确和经济的特点，可以实现对个体基因组的全面测序。

它在研究人类遗传学、疾病基因组学、进化生物学等领域具有重要的应用价值，可以为个性化医学、疾病诊断和治疗提供重要的信息。

随着测序技术
的不断发展和成本的不断降低，全基因组重测序将在未来得到更广泛的应用。

全基因组重测序流程小伙伴们！今天咱们来唠唠全基因组重测序这个事儿的流程。

这流程听起来可能有点复杂，不过只要跟着大概的步骤走，其实也没那么难啦。

首先呢，得有样本的采集呀。

这个样本呢，可以是各种各样的生物组织或者细胞啥的。

但是呢，采集的时候可得小心点儿哦！要保证样本的质量，要是样本质量不好，后面可就麻烦咯。

我觉得在采集样本的时候，最好能多采集一点，以防万一嘛。

当然啦，具体采集多少还得根据实际情况来定。

提取好DNA之后呢，就是要对DNA进行定量和质检啦。

这一步为啥要做呢？就是要看看咱们提取出来的DNA质量咋样，量够不够。

要是DNA的量太少或者质量不好，那后面的测序可就不准确了。

这一步啊，我觉得可以多检查几遍，确保万无一失。

然后就是构建测序文库啦。

这个环节可以根据实际情况自行决定一些参数啥的。

构建文库的过程中呢，要按照试剂盒的说明来操作，不过也不要太死板啦，有时候根据经验稍微调整一下也未尝不可。

小提示：在这一步可别太着急，一步一步稳稳地来很重要哦！再接下来就是测序啦。

测序的仪器有好多不同的类型，要根据自己的需求和预算来选择合适的仪器哦。

这一步就像是把咱们之前准备好的东西交给一个超级精密的机器去解读一样。

测序的时候要注意仪器的参数设置，这个很重要！为什么呢？因为这会直接影响测序的结果呀。

测完序之后呢，就会得到一大堆的数据啦。

这些数据就像是一堆乱麻一样，需要我们去整理和分析。

这个数据分析可不容易呢，不过现在有好多软件可以帮助我们。

我们要从这些数据里找到我们想要的信息，就像在大海里捞针一样。

刚开始看这些数据的时候可能会觉得头大，但是别担心，慢慢研究就会有收获的。

最后呢，就是结果的解读和验证啦。

这一步要特别注意！要把得到的结果和我们之前的预期或者已有的知识进行对比，看看是不是合理。

如果有不合理的地方，可能就需要重新检查前面的步骤啦。

小提示：别忘了最后一步哦！。