发育生物学实验

实验一小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养一、目的要求1．掌握小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养方法。

2．了解小鼠骨髓间充质干细胞的鉴定方法。

3．了解小鼠骨髓间充质干细胞定向分化和鉴定方法。

二、材料与设备1．动物：SD大鼠。

2．主要试剂：胎牛血清（FBS），DMEM--LG培养基，PBS，抗体（NSE和GFAP）。

3．主要器材与仪器：手术剪，手术镊，眼科剪，眼科镊，培养瓶，培养皿，称量瓶，刻度离心管，吹打管，注射器，倒置相差显微镜，CO2培养箱三、实验步骤1．小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal stem cells,BMSC)的分离培养:⑴小鼠BMSC的分离和原代培养：①以颈髓离断法处死小鼠。

在无菌条件下取出小鼠股骨，除去骨表面附着的组织，用PBS 清洗干净。

②用剪刀去除股骨两端，暴露骨髓腔。

无菌条件下用5ml注射器抽取PBS约3-4ml将小鼠股骨内的骨髓冲出，收集骨髓冲洗液，将收获的全部骨髓用注射器反复抽吸，以打散组织成为细胞悬液。

③收集细胞悬液约7ml并将其转入15毫升离心管中，1500r/min离心5min，弃上清液及脂肪层。

④在细胞沉淀中加入5-6ml含10%胎牛血清的DMEM一LG培养基，倒置显微镜下观察，37℃、5%CO2 培养箱中培养。

2. 带学生在电脑上观看以往的小鼠间充质干细胞免疫荧光图片。

实验二大鼠神经干细胞的分离培养一、目的要求1．掌握大鼠胚胎神经干细胞的分离培养方法。

2．了解大鼠胚胎神经干细胞的鉴定方法。

3．了解大鼠胚胎神经干细胞定向分化和鉴定方法。

二、材料与设备1．动物：孕龄约15天的Wistar或SD孕鼠2．试剂：条件培养基(DMEM/F12+20ng/mlbFGF+20ng/mlEGF+20μl/mlB27)，D-Hank’s液(NaCl 8g, KCL0.4g，Na2HPO4.12H2O 0.1g, KH2PO4 0.06g, NaHCO3 0.35g, 加水1000ml溶解，调PH 值为7.2－7.4，高压灭菌后，4℃储存备用)，0.25％胰蛋白酶（D-Hank’s液配制，过滤灭菌，-20℃储存），抗体(巢蛋白、NSE、GFAP)。

发育生物学实验指导2008-2009学年第二学期2009年4月2日实验一1原理卵巢表面为单层立方或扁平的表面上皮，上皮下方为薄层致密结缔组织构成的白膜。

卵巢实质分为皮质和髓质。

皮质含不同发育阶段的卵泡、黄体和白体，卵泡间结缔组织由低分化的梭形的基质细胞、网状纤维及散在的平滑肌纤维构成。

髓质有血管和淋巴管。

近卵巢门处有少量门细胞，其结构和功能类似睾丸间质细胞，可分泌雄激素，在FSH和LH刺激下，每个周期有一批卵泡发育，其中之一发育成熟并排卵。

卵泡的发育分为原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡四个阶段。

①原始卵泡体积小，由一个初级卵母细胞和一层扁平的卵泡细胞构成。

初级卵母细胞为圆形，直径约40μm，核大而圆，染色浅，核仁明显，胞质嗜酸性。

初级卵母细胞是在胚胎时期由卵原细胞分裂分化形成，并停滞在第一次减数分裂前期，直至排卵前才完成分裂。

②初级卵泡为原始卵泡在FSH的作用下发育形成。

初级卵母细胞增大，在靠近质膜的胞质中出现电子致密的溶酶体，称皮质颗粒。

卵泡细胞增生，由扁平变为立方形或柱状，由单层变为多层；最内一层卵泡细胞为柱状，呈放射状排列，称放射冠。

在初级卵母细胞与放射冠的卵泡细胞之间出现一层均质状、嗜酸性的透明带。

构成透明带的蛋白中，ZP3为精子受体。

③次级卵泡其内出现卵泡腔，腔内充满卵泡液；初级卵母细胞、透明带、放射冠及部分卵泡细胞突入卵泡腔内形成卵丘；卵泡腔周围的数层卵泡细胞形成卵泡壁，称颗粒层，卵泡细胞改称颗粒细胞。

初级卵泡和次级卵泡合称生长卵泡，其周围形成卵泡膜。

卵泡膜内层有多边形或梭形的膜细胞，具有分泌类固醇激素细胞的特征；外层有胶原纤维和平滑肌纤维，膜细胞合成雄激素，雄激素进入颗粒细胞，转化为雌激素，故雌激素由两种细胞联合产生。

④成熟卵泡在LH刺激下，次级卵泡发育为成熟卵泡。

初级卵母细胞直径可达150μm。

由于卵泡液急剧增多卵泡体积显著增大，直径可超过2cm，并向卵巢表面突出。

在排卵前36～48小时，初级卵母细胞完成第一次减数分裂，形成次级卵母细胞和第一极体。

发育生物学的实验教学方法发育生物学是研究生物体从受精卵到成熟个体的发育过程的学科。

实验教学在发育生物学中起着至关重要的作用，通过实验可以直观地观察和理解生物体发育的过程和机制。

本文将介绍一些发育生物学的实验教学方法，以帮助学生更好地学习和理解这一学科。

一、观察胚胎发育过程观察胚胎发育过程是发育生物学实验教学的重要环节。

学生可以通过显微镜观察受精卵的分裂、胚胎的形态变化等。

可以使用小鼠、果蝇、斑马鱼等模式生物进行实验，这些生物的发育过程相对较短，方便学生观察和实验操作。

通过观察胚胎发育过程，学生可以深入了解细胞分裂、器官形成等发育过程的细节。

二、基因敲除实验基因敲除是一种重要的实验方法，通过敲除特定基因，可以观察到这个基因在发育过程中的作用。

学生可以选择一个感兴趣的基因，通过基因敲除技术将其敲除，然后观察敲除个体的发育过程和表型变化。

这种实验可以帮助学生深入了解基因在发育过程中的作用，并探索基因与发育的关系。

三、细胞培养实验细胞培养是发育生物学实验中常用的方法之一。

学生可以通过细胞培养实验观察细胞的分裂、分化和形态变化等。

可以选择动物细胞或植物细胞进行培养实验，通过观察细胞的生长和变化，学生可以更加直观地理解细胞的发育过程和机制。

四、基因表达实验基因表达是发育生物学中一个重要的研究方向。

学生可以选择一个感兴趣的基因，通过基因表达实验观察该基因在发育过程中的表达情况。

可以使用荧光标记等方法来标记基因的表达，然后观察标记物在胚胎或组织中的分布情况。

通过这种实验，学生可以了解基因在发育过程中的动态表达模式。

五、模型构建实验模型构建是发育生物学实验中常用的方法之一。

学生可以选择一个发育过程进行模拟，通过构建模型来观察和理解发育过程中的关键因素和机制。

例如，可以构建一个模拟胚胎发育的系统，通过调控不同因素的作用来观察胚胎发育的变化。

通过模型构建实验，学生可以更加深入地理解发育过程中的复杂性和动态性。

综上所述，发育生物学的实验教学方法多种多样，通过观察胚胎发育过程、基因敲除、细胞培养、基因表达和模型构建等实验，可以帮助学生更好地理解和探索发育生物学的奥秘。

发育生物学实验讲义主编：余雪松贾伟章李浩明2007年7月（仅供内部使用，请勿外传）前言发育生物学被公认为是当今生命科学的前沿分支学科，是研究生物体发育过程及其调控机制的一门学科。

发育生物学不同于传统的胚胎学，它是生物化学、分子生物学、细胞生物学、遗传学等学科与胚胎学相互渗透的基础上发展形成的一门新兴的学科，是胚胎学的继承和发扬。

发育生物学同时又是一门实验的科学，正是由于发育生物学实验技术的进步才推动了发育生物学的发展。

关于发育生物学实验，国内目前尚无系统的实验教材。

考虑到我院生物科学专业本科的课程设置特点以及我院的实验条件，在编写这本实验教材时设置了相关的实验，参考有关资料进行编写。

考虑到学生用活胚胎作实验缺乏经验和实验内容尽可能多的涵盖重要的发育原理和研究方法，实验内容为生物发育模式的形态观察，以切片观察为主，同时以活的胚胎来观察发育过程并进行实验为补充。

对于部分因课时和实验条件的限制可能暂时无法开展的实验，利用教学录像等多种手段让学生了解发育生物学实验技术的发展和应用。

通过一些实验手段对生物的发育机制进行探讨。

本课程通过对几种模式动物（海胆、文昌鱼、斑马鱼、鲫鱼、蛙、鸡等）生殖和发育过程的实验观察，促进学生对发育的时空连续性变化的理解和对生命系统的敏锐认识和重视；同时掌握发育生物学重要的原理和研究实验的基本技能。

培养学生成为具有独立实验操作技能和一定分析解决问题能力的创新人才。

由于时间仓促，水平有限，在内容和方法上可能还存在不少缺点错误，欢迎批判指正，以便在今后进行实验内容的调整和改进。

余雪松贾伟章李浩明广东药学院生命科学与生物制药学院2007年7月目录实验一........................................... 海胆早期胚胎发育4 实验二......................................... 文昌鱼早期胚胎发育7 实验三 ......................................... 文昌鱼组织结构观察10 实验四 ......................................... 斑马鱼早期胚胎发育13 实验五 ........................................... 鲫鱼早期胚胎发育16 实验六 ........................................... 鲫鱼组织结构观察20 实验七 ............................................. 蛙早期胚胎发育24 实验八 ................................. 蛙的人工催产及体外跌卵实验29 实验九 ............................... 鸡卵的人工孵育和胚胎发育观察32实验一：海胆早期胚胎发育一、实验生物海胆，别名刺锅子、海刺猬，体形呈圆球状，就像一个个带刺的紫色仙人球，因而得了个雅号—“海中刺客”。

分子发育生物学国家重点实验室是我国重要的科研评台，致力于开展前沿的发育生物学研究。

为了促进科研成果的交流与共享，实验室决定开放一些课题给其他感兴趣的科研人员进行合作研究。

以下是本实验室开放的具体课题：一、课题名称：植物胚胎发育调控机制研究1.1 课题简介：植物胚胎发育是植物生命周期中一个至关重要的阶段，对植物生长发育和繁殖具有重要意义。

本课题旨在探索植物胚胎发育的调控机制，包括转录因子的调控网络、激素信号传导的作用机制等方面的研究内容。

1.2 研究内容：（1）分析植物胚胎发育关键时期的基因表达谱，筛选关键调控因子；（2）利用生化和分子生物学方法研究植物激素在胚胎发育中的作用机制；（3）通过对突变体的筛选和功能分析，阐明植物胚胎发育调控网络。

1.3 预期成果：（1）揭示植物胚胎发育的关键调控因子和调控网络；（2）阐明植物激素在胚胎发育中的作用机制；（3）构建植物胚胎发育的调控模型。

二、课题名称：动物器官发育中的信号通路研究2.1 课题简介：动物器官发育是动物生长发育过程中的重要环节，本课题旨在深入探讨动物器官发育过程中的信号通路调控机制，包括Wnt、Notch、TGF-β等信号通路的相互作用和调控机制。

2.2 研究内容：（1）利用转基因技术构建动物模型，研究特定信号通路在器官发育中的作用；（2）通过RNA测序和蛋白质组学等手段，分析不同信号通路在器官发育过程中的调控网络；（3）研究不同信号通路之间的相互作用及其对器官发育的影响。

2.3 预期成果：（1）深入理解动物器官发育中不同信号通路的作用机制；（2）揭示不同信号通路之间的相互作用关系；（3）为相关疾病的防治提供理论基础和实验依据。

三、课题名称：发育生物学中的表观遗传学研究3.1 课题简介：表观遗传学是近年来备受关注的一个新兴领域，本课题旨在探讨发育生物学中的表观遗传学调控机制，包括DNA甲基化、组蛋白修饰等表观遗传标记在发育过程中的作用和调控机制。

实验一低拷贝质粒的大量提取——碱法【实验原理】质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。

作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。

在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。

从宿主细胞中提取质粒DNA，是DNA重组技术中最基础的实验技能。

分离质粒DNA有三个步骤：培养细菌使质粒扩增，收集和裂解细菌，分离和纯化质粒DNA。

在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂。

所以，多数质粒粗提取物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状DNA（cccDNA）：质粒的两条链没有断裂；超螺旋开环DNA（ocDNA）：质粒的一条链断裂；松弛的环状分子线形DNA（lDNA）：质粒的两条链均断裂；线性分子质粒DNA的分子构型。

质粒DNA琼脂塘凝胶电泳模式图可分为：松弛线性的DNA；松弛开环的OC构型；超螺旋的SC构型。

由于琼脂糖中加有嵌入型染料溴化乙锭，因此，在紫外线照射下DNA电泳带成橘黄色。

道中的SC DNA走在最前沿，OC DNA则位于凝胶的最后边；道中的L DNA 是经核酸内切限制酶切割质粒之后产生的，它在凝胶中的位置介于OC DNA 和SC DNA 之间。

碱法提取质粒是Ｒ．Ｔreisman尚未发表的方法，同时也是Brinboim和Doly(1979)及Ish-Horowicz和Burke(1981)所用方法的改进。

该方法对于目前使用的所有大肠菌菌株都卓有成效，并可与随后的纯化步骤，如聚乙二醇沉淀或氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心等，一并联合使用。

【药品试剂】1、溶液I：50 mmol/L葡萄糖、 25 mmol/L Tris.Cl（pH8.0）、10mmol/L EDTA（pH8.0）。

溶液I可成批配制，在10 lbf/in2（6.895x104Pa或者是115 ℃）高压下蒸气灭菌15min，贮存于4 ℃。

发育生物学实验_北京师范大学中国大学mooc课后章节答案期末考试题库2023年1.果蝇胚胎收集完成后，经过清洗后，应该放入（）液体中进行保存，可以在-20℃保存一年。

参考答案:甲醇2.石蜡切片常用的透明剂是（）。

参考答案:二甲苯3.质粒DNA转化农杆菌感受态细胞常用的方法（）参考答案:电击转化法_热激法4.50%漂白水的作用是去除卵壳。

参考答案:正确5.在胚胎收集过程中，若要只收集中间阶段的胚胎，应该等到该时间段再更换培养皿，然后直接收集其中的胚胎。

参考答案:错误6.果蝇胚胎免疫荧光染色实验中的所有步骤都要尽量避光。

参考答案:错误7.在荧光显微镜下，DAPI染色后的物质通过紫外光的激发可以呈现蓝色荧光，荧光显微镜下可观察到被染成蓝色的细胞核。

参考答案:正确8.配制果蝇玉米培养基时，待培养基煮沸后可立即加入干酵母粉，酵母粉均匀的撒在培养基表面，充分搅拌至完全溶解。

参考答案:错误9.培养基的质地较硬且贴壁紧密，可采用倒扣转移法，即将该培养管放在新培养管的上方，轻叩新培养管的底部，让成蝇落入新的培养基上。

参考答案:正确10.果蝇成虫分头、胸、腹三部分，头部有1对大的复眼，3个单眼和1对触角；胸部有3对足，1对长于腹部末端的翅和1对平衡棒；腹部背面有黑条纹，腹面有腹片，外生殖器在腹部末端；全身还有许多体毛和刚毛。

参考答案:正确11.在冷冻切片过程中，柔软稚嫩含水分的组织选择相对较低的切片温度。

参考答案:错误12.果蝇胚胎免疫荧光染色实验中包含以下步骤（）参考答案:DAPI染色_免疫荧光染色_胚胎的收集固定13.本次实时荧光定量PCR属于下列哪种实验类型？参考答案:相对定量14.鸡的胚胎发育的第一阶段是（）参考答案:胚胎内部器官发生的阶段15.下列哪项不是实时荧光定量PCR产物的荧光标记？参考答案:GFP16.实时荧光定量PCR反应体系中，不包括下列哪项？参考答案:Oligo dT17.受精卵在输卵管中进行卵裂，约经（）的细胞分裂和分化形成一个早期的胚胎参考答案:24 h18.照蛋时胚胎卵黄囊血管向四周伸展，形似蜘蛛，俗称“小蜘蛛”。

发育生物学实验心得
我进行了一个关于显微镜下观察果蝇发育过程的实验，对于果蝇
的发育过程有了更深入的了解。

我的实验中，首先需要培育果蝇幼虫，我选择了用玉米面培养，
因为这是一种简便而且容易获取的方法。

在观察果蝇幼虫时，我使用
了高倍率显微镜，以便更清晰地观察它们的发育过程。

随着观察时间
的推移，果蝇幼虫的身体逐渐变长，内部器官也逐渐形成。

当果蝇幼
虫发育到一定阶段时，它们会形成蛹，这是它们进入蛹期的标志。

在观察果蝇的蛹期时，我发现果蝇的眼睛和触角已经初步形成，
而其它器官也在逐渐发育。

在蛹期结束后，果蝇将会开始破蛹而出，
进入成虫时期。

我在实验中观察了不同发育阶段的果蝇，从而对果蝇
的生命周期有了更全面的了解。

此外，在实验过程中还发现了一些有趣的现象，比如不同果蝇幼
虫发育速度有差异，有些幼虫会比其它的更快地发育成熟。

这些现象
让我对果蝇发育的过程产生了更多的兴趣，也让我更好地理解了发育
生物学的相关知识。

综上所述，这个实验让我对果蝇的发育过程有了更深入的了解，
同时也让我意识到了发育生物学的重要性。

通过观察果蝇的发育过程，我更好地理解了动物发育的过程，对于这一领域有了更深入的认识。

发育生物学实验合作合同甲方（委托方）：_____________________________________地址：_____________________________________________联系电话：__________________________________________法定代表人：_______________________________________乙方（承办方）：_____________________________________地址：_____________________________________________联系电话：__________________________________________法定代表人：_______________________________________为确保发育生物学实验项目的顺利开展，甲乙双方在平等自愿的基础上，根据相关法律法规及科研规范，就发育生物学实验项目的合作事宜达成如下协议：一、项目概述1.1 项目名称：发育生物学实验1.2 项目目标：通过实验研究特定生物的发育过程，探索发育机制和调控因子。

1.3 项目内容：_______________________________________（如细胞分化、基因表达调控、胚胎发育等具体实验内容）1.4 实验地点：_______________________________________1.5 项目周期：自______年___月___日起至______年___月___日止。

二、甲方的权利与义务2.1 甲方应提供项目所需的实验材料、设备或数据，并确保其完整性与真实性。

2.2 甲方有权根据项目进展对乙方的实验方案、实验操作提出建议，并有权对实验的实施进行监督。

2.3 甲方应按约定及时支付实验费用，并协助乙方解决实验过程中遇到的特殊问题。

2.4 甲方有权在项目完成后获得实验结果、数据及相关报告，且甲方对实验数据拥有使用权。