一种产甲烷优势菌群的筛选方法_张云茹

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产甲烷菌的分离、培养及鉴定方法

产甲烷菌的分离、培养及鉴定方法产甲烷菌是一类以产生大量甲烷气体作为能量代谢的终产物的特殊原核微生物，广泛存在于各种极端厌氧环境中。

作为自然界碳素循环中厌氧生物处理的最后一个成员，该菌与其它菌群协同作用，将大量的有机物转化成可再生能源，对自然界中的物质循环及当今社会能源危机中的能源替代问题具有极大的推动作用。

通过本实验，我们可掌握产甲烷菌等厌氧菌的分离、培养及活菌计数的一般方法，能够实时观察产甲烷菌的形态特征并了解产甲烷菌的生长特性。

摘要产甲烷菌是一类以产生大量甲烷气体作为能量代谢的终产物的特殊原核微生物，广泛存在于各种极端厌氧环境中。

通过本实验，我们可掌握产甲烷菌等厌氧菌的分离、培养及活菌计数的一般方法，能够实时观察产甲烷菌的形态特征并了解产甲烷菌的生长特性。

一、实验原理(一) 产甲烷菌厌氧微生物在自然界分布广泛，种类繁多，其生理作用日益受到人们的重视。

产甲烷菌是专性厌氧菌，对氧气非常敏感，因此，产甲烷菌的分离、培养及活菌计数的关键是提供无氧和低氧化还原电势的培养环境。

(二) 产甲烷菌的发现历史自1901—1903年巴斯德研究所的马载（Maze）第一次观察到一种产甲烷菌的微球菌（马氏甲烷球菌）以来，迄今共发现了五十多种产甲烷菌。

1974年Bryant 提出产甲烷菌这一名词，为避免这一类细菌与氧化甲烷的好氧菌相混淆。

1979年由Balch W.E.等人根据菌株间16SrRNA降解后各寡核苷酸中碱基排列顺序间相似性的大小，提出了一个新的系统分类方法，共分为3个目、4个科、7个属、13个种。

(三) 定义、性质及分布产甲烷菌（Mathanogens）是一类必须生活在厌氧生境下并伴有甲烷产生的古生菌，其形态和生理、生化特性呈现明显的多样性。

低温产甲烷复合菌系的选育及干、湿发酵的比较

低温产甲烷复合菌系的选育及干、湿发酵的比较摘要：将3个低温厌氧环境样品Y、S、Z进行干、湿发酵低温驯化，选育适宜低温干、湿发酵的稳定、高效产甲烷复合菌系。

样品Y、S、Z在（19±0.5）℃条件下进行干发酵低温驯化，分别在第6代、第7代、第6代产气基本稳定，第8代65 d总产气量分别为42.60、40.50、41.70 L，总固体（TS）产气率分别为266.25、253.13、260.63 L/kg。

复合菌系Y最适接种量为25%，甲烷含量最高为72.9%，COD去除率最高为77.17%；样品Y、S、Z在相同条件下进行湿法酸化发酵低温驯化，分别在第7代、第7代、第8代产气基本稳定，第9代55 d总产气量分别为35.48、34.52、33.78 L，TS产气率分别为221.75、215.75、211.13 L/kg；3组复合菌系稳定世代在干发酵和湿法酸化发酵中均使得沼气发酵启动期比第1代提前5 d以上。

经差异显著性分析，相同发酵方法下不同复合菌系间总产气量差异达到显著水平。

关键词：低温驯化；沼气发酵类型；总产气量；甲烷纯度；COD温度是限制低温沼气发展的重要因素，低于20 ℃时沼气发酵效率会显著下降，我国北方年平均气温为1.3 ℃，若在低温季节进行沼气发酵需人为加热保温，增加了运行成本，而使得沼气发酵难以在北方推广。

此外，湿发酵沼液量大，处置不当易造成二次污染，若干发酵替代湿发酵不仅利用秸秆解决生物质能转化问题，而且减少其焚烧所带来的空气污染[1]。

试验采用不同生境来源的样品，利用微生物对环境适应性及温度对其的选择作用在干、湿发酵中进行低温驯化，比较干、湿发酵优越性并且选育稳定、高效、适宜低温干、湿发酵的产甲烷复合菌系，为低温沼气工程提供试验参数及菌种资源。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1 样品来源样品选择厌氧污泥Y、水稻田污泥S、沼气发酵液Z。

1.1.2 底物及试剂牛粪酸化液：将9 kg干牛粪与9L水在塑料桶里混合均匀，自然酸化待pH降至6时，用KHCO3溶液将其pH调至7，装料时将TS调至8%。

鸟岛湿地土壤产甲烷菌群落对不同降水梯度的响应

鸟岛湿地土壤产甲烷菌群落对不同降水梯度的响应王霞;陈克龙;杜岩功;章妮;车子涵;暴涵;王恒生【期刊名称】《草业科学》【年(卷),期】2024(41)2【摘要】产甲烷菌在湿地CH4排放过程中发挥着重要作用,降水格局的改变已经并将持续影响湿地生态系统的结构与功能,进而对湿地CH4排放过程产生影响。

本研究以青海湖鸟岛湖滨湿地为研究对象,设置5个降水梯度处理,并利用mcrA扩增子测序技术对土壤产甲烷菌进行检测,探究鸟岛土壤产甲烷菌群落特征对不同降水梯度的响应。

结果表明,鸟岛土壤产甲烷菌群落的优势菌目为甲烷微菌目(Methanomicrobiales)、甲烷八叠球菌目(Methanosarcinales)和甲烷杆菌目(Methanobacteriales)。

FAPROTAX功能预测显示土壤中氢营养型产甲烷菌占优势,由此推测H_(2)/CO_(2)还原为鸟岛土壤CH_(4)产生的主要途径。

LEfSe分析表明,5个降水梯度共存在31个差异菌群,以增雨50%处理下差异菌群数量最多,从目水平到种水平共有10个差异菌群。

整体而言,鸟岛土壤产甲烷菌的群落多样性较为稳定,而群落结构对降水变化的响应较为敏感,部分菌群的相对丰度发生了显著变化(P <0.05)。

研究结果可为预测降水变化对鸟岛湿地土壤碳循环的影响提供一定的参考依据。

【总页数】13页(P284-296)【作者】王霞;陈克龙;杜岩功;章妮;车子涵;暴涵;王恒生【作者单位】青海师范大学生命科学学院;青海省自然地理与环境过程重点实验室;青海师范大学青藏高原地表过程与生态保育教育部重点实验室;青海青海湖湿地生态系统国家定位观测研究站;高原科学与可持续发展研究院;中国科学院西北高原生物研究所;合肥师范学院生命科学学院【正文语种】中文【中图分类】X70【相关文献】1.模拟增温对青海湖鸟岛土壤产甲烷菌群落特征的影响2.干旱和湿润地区森林土壤微生物群落对降水改变的不同响应3.不同水分条件天鹅湖高寒湿地土壤线虫群落结构对氮沉降的响应4.扎龙湿地不同群落芦苇种群数量特征及其对土壤因子的响应5.碧塔海湿地不同水分梯度下土壤真菌群落结构及功能类群研究因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

一株耐冷产甲烷菌的分离及其生长特性初步研究

一株耐冷产甲烷菌的分离及其生长特性初步研究李军;张雅南;邓娴;张文文;杨宏宇【期刊名称】《可再生能源》【年(卷),期】2012(030)002【摘要】以实验室某长期稳定运行的UASB反应器的污泥为样品来源,通过降温筛选、分离纯化,得到一株在15℃条件下生长良好的产甲烷菌株US-3,在荧光显微镜下观察其菌落发出蓝色荧光,高倍扫描电镜观察菌体为较规则球状.经正交试验对其生长特性进行研究,试验结果表明,影响该产甲烷菌株生长能力的因素按主次依次为底物种类、温度、pH值、Na+浓度,各因素最佳水平为底物甲酸钠,温度25℃,pH 值6.5,Na+浓度0.6mol· L-1.【总页数】5页(P86-90)【作者】李军;张雅南;邓娴;张文文;杨宏宇【作者单位】沈阳建筑大学市政与环境工程学院,辽宁沈阳 110168;沈阳建筑大学市政与环境工程学院,辽宁沈阳 110168;沈阳建筑大学市政与环境工程学院,辽宁沈阳 110168;中国市政工程东北设计研究总院,辽宁大连 116600;东芝电梯(中国)有限公司技术部沈阳分部,辽宁沈阳110168【正文语种】中文【中图分类】TK6;S216.4【相关文献】1.一株耐冷苯胺降解菌An7的分离和降解特性的研究 [J], 陈建梅;杨广花2.一株乙醛耐冷降解菌A27的分离鉴定和降解特性的研究 [J], 蔡志强;赵希岳;王利群;朱孝霖;李尔炀;张芸3.一株耐盐好氧反硝化细菌的分离鉴定及生长特性研究 [J], 吐尔逊阿依·吾甫尔;史应武;王纯利;马晶4.一株耐锌菌株的分离鉴定及其生长特性研究 [J], 曹礼;李晓慧;张芹辉;贾东波;孙晓杰;徐丽梅;雷玉明5.一株产低温碱性磷脂酶A1耐冷细菌的筛选及发酵条件的初步研究 [J], 付建红;唐辉桂;姚斌;石玉瑚;欧阳平凯因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

厌氧消化池产甲烷菌的筛选及特性研究

Ｓｐ２１ｅ．０２
厌氧消化池产甲烷菌的筛选及特性研究
金映虹，黎佳媛，王锐萍，谢秀祯，黄循吟’
（海南师范大学生命科学学院，海南海口５１５）７１８
摘要：从厌氧消化池洚Ｊ污泥中采集样品，生利用特定培养基进行厌氧培养，离筛选得到２分株茵，分别编号为ＡＢ通过特定荧光反应检测鉴定ＡＢ、．、均为产甲烷茵．利用甲醇液体培养基对
产甲烷细菌，来被称为奥氏甲烷杆菌（ｌｈｎ— 后Ｍｅａｏ —
ｂｃｌｍｌｓｉ；ａｉｕＯｅｕｋ）另一类是能够产生许多氢的ｌｓａｉ细菌，来被称为产氢产乙酸菌．９１，根后１０年孙
（ｏｎｅ）Ｓｈｇｎ对产甲烷茵的特征，以及产甲烷菌对物质的转化做了更加详细地研究ｐ１由于厌氧分离．甲烷菌的设备和技术尚不完备，对奥氏甲烷菌所做的分离研究工作并未取得重大的进展直到２世，Ｏ纪７年代中期，甲烷菌只有一个科，０产被称作甲烷杆菌科，且分成三个属，并九个种［１５年，４９０科学１．家亨格特（ｕｇｔ）次创造了严格无氧分离技Ｈｎａｅ首术，这一技术对于甲烷菌的研究具有十分重要的意义ｐ随后，．人们从各种不同的厌氧生态环境中分离
ｓｅｉｃｆｕｒｓｏｙＴｅｒｒｅｓｓｒｉａｄｓｒｉＡａｏｌｃｏｓｅｉｎｄｔｏｌｃｈｔａｅｐｃｆｏｏｃｐ．ｈｙｗｅｅｍａｋｄａｔａｎＡｎｔｎＢ．ｇｃｌｔｒＷａｄｓｇｅｏｃｌｔｔｅｍｅｈｎｉｌａｓｅｅｗｈｃｓｒｄｃｄｂｔａｎＡｏＴｅｒｓｌｓｓｏｅａｎＡｎｏｈｃｕｄｐｏｕｅｇｆｅｂｕ０ｄｙｉｈＷａｐｏｕｅｙｓｒｉｒＢ．ｈｕｔｈｗｄｔｔｅｈｓａｄＢｂｔｏｌｒｄｃａａｔｒｏｔａｓｓａ２ｃｌｖｔｎｗｉｔａｏｑｉｄｕａｄｔｅｇｓｐｏｕｔｎｏｔａｎＷａｒｈｎＡｓｒｉＳｕｔａｉｔｍｅｈｉｏｈｎｌｉｕｄｍｅｉｍ，ｎａｒｄｃｉｆｓｒｉｓｍｏｅｔａｔｎ’ ．ｌｈｏＢａ

一种高效丙酸产甲烷菌系的驯化方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201611127341.0(22)申请日 2016.12.09(71)申请人中国科学院广州能源研究所地址 510640 广东省广州市天河区五山能源路2号(72)发明人李颖　孔晓英　孙永明　袁振宏　李连华　王忠铭　(74)专利代理机构广州科粤专利商标代理有限公司 44001代理人蒋欢妹　莫瑶江(51)Int.Cl.C12N 1/36(2006.01)C12N 1/20(2006.01)C12P 5/02(2006.01)(54)发明名称一种高效丙酸产甲烷菌系的驯化方法(57)摘要本发明公开了一种丙酸产甲烷菌系的驯化方法，所述丙酸产甲烷菌系包括丙酸氧化细菌群、互营丙酸氧化菌群、乙酸裂解产甲烷菌群、氢营养型产甲烷菌群，该方法以沼气发酵液为接种物，以丙酸钠为碳源，以生物质材料为附着载体，通过阶梯性提高培养基中丙酸钠的浓度的方法来驯化沼气发酵液来获得高效丙酸产甲烷菌系，得到的丙酸产甲烷菌系具有耐冲击性强，生物强化作用稳定性高等优点，用于提高沼气发酵性能，长期稳定地在丙酸浓度在3.0g/L以上条件下高效利用，产气率为理论产量的75％，丙酸及乙酸的利用率大于90％。

权利要求书1页说明书3页附图1页CN 106434517 A 2017.02.22C N 106434517A1.一种丙酸产甲烷菌系的驯化方法，其特征在于，所述丙酸产甲烷菌系包括丙酸氧化细菌群、互营丙酸氧化菌群、乙酸裂解产甲烷菌群、氢营养型产甲烷菌群，该方法以沼气发酵液为接种物，以丙酸为碳源，以生物质材料为附着载体，通过阶梯性提高培养基中丙酸钠的浓度的方法来驯化沼气发酵液来获得高效丙酸产甲烷菌系，该方法包括以下步骤：在氮气和二氧化碳体积比为4:1的混合气氛中，按体积比为19:1将接种物接种到丙酸钠浓度为0.5g/L的新鲜培养基中进行培养，培养温度为37℃，每24h置换新鲜的培养基，7-14天为一个培养周期，每培养10-15天后加入1-2cm长的能源草，所述能源草与新鲜的培养基的体积比为20％，此后阶梯性提高新鲜培养基中丙酸钠的浓度，直至新鲜培养基中丙酸钠浓度大于3.0g/L，经过10个周期的驯化，获得了目标产物；所述新鲜培养基配制如下：在1L水中加入400mg NH 4Cl、250mg MgSO 4·6H 2O、400mg KCl、120mgCaCl 2·2H 2O、80mg(NH 4)2HPO 4、55mg FeCl 3·6H 2O、5000mg NaHCO 3、丙酸钠，还加入CoCl 2·6H 2O、NiCl 2·6H 2O、MnCl 2·4H 2O、CuCl 2·2H 2O、AlCl 3·6H 2O、ZnCl 2、Na 2WO 4·2H 2O、H 3BO 3、Na 2SeO 3、Ma 2MoO 4·2H 2O各0.0005mg，所述丙酸钠的加入量跟相应的培养基所需的丙酸钠浓度一致，所述丙酸的浓度通过在培养基中加入相应量丙酸钠实现，pH调节至7.0。

纤维素降解菌筛选及促进餐厨垃圾发酵产甲烷的研究

纤维素降解菌筛选及促进餐厨垃圾发酵产甲烷的研究纤维素降解菌筛选及促进餐厨垃圾发酵产甲烷的研究概述：随着全球人口的迅速增长，餐厨垃圾的处理问题日益凸显。

在传统的垃圾填埋和焚烧等处理方式面临资源浪费和环境污染的诸多问题之际，发酵处理成为一种可持续且环保的选择。

本研究旨在通过筛选纤维素降解菌，促进餐厨垃圾发酵过程中的甲烷产生，为餐厨垃圾资源化利用提供技术支持。

一、研究背景餐厨垃圾主要由剩余食物、果皮和厨余废弃物组成，富含丰富的有机物质，是一种潜在的能源资源。

通过发酵处理，餐厨垃圾中的有机物质可以转化为沼气，其中主要成分为甲烷和二氧化碳。

甲烷是一种重要的可再生能源，其燃烧产生的二氧化碳排放较少，对减少温室气体排放具有积极意义。

因此，开发高效的发酵处理技术，提高甲烷的产量成为餐厨垃圾资源化利用的重要课题之一。

二、实验设计本研究采用了一个综合的实验设计方案，包括纤维素降解菌的筛选、菌株培养和餐厨垃圾的发酵实验。

1. 纤维素降解菌筛选从不同环境中收集各种样品，如土壤、水体和肠道粪便等，通过分离纯化和形态观察的方法，筛选出具有纤维素分解能力的细菌。

分离出的细菌通过纤维素酶活性的测定和纤维素降解率的测定进行初步筛选，选取具有较高纤维素降解活性的菌株作为下一步实验的研究对象。

2. 菌株培养将选取的细菌菌株分别培养在纤维素质量浓度为2%的培养基中，培养条件包括温度、pH值和培养时间。

通过测定细菌生长曲线和纤维素酶活性的变化，确定适宜的培养条件。

3. 餐厨垃圾的发酵实验将收集到的餐厨垃圾样品与选取的优势菌株混合，放置于密封的发酵罐中进行发酵处理。

监测发酵过程中温度、pH值、甲烷产量和沼气组分的变化，并与传统的处理方式进行对比分析，评估筛选纤维素降解菌方式对甲烷产量的影响。

三、研究结果与讨论通过对不同环境样品的筛选，分离出多个具有纤维素降解能力的细菌菌株，其中包括纤维素分解酶活性较高的菌株。

在菌株培养方面，确定了适宜的培养条件，包括温度为37℃、pH值为7.0和培养时间为48小时。

一株甲烷利用菌的分离、鉴定和性能研究

一株甲烷利用菌的分离、鉴定和性能研究孔淑琼;佘跃惠;易绍金;魏力;黄晓武;冯志云【期刊名称】《生物技术》【年(卷),期】2010(20)3【摘要】目的:研究土壤中能利用甲烷的细菌类型及特性。

方法:运用传统的富集、分离、纯化方法得到1株甲烷利用菌,结果:该菌株在显微镜下呈球形,在液体培养基中生长72h后OD值可达到0.8左右,其最适生长温度30℃,最佳pH值7左右。

对该菌株进行了16SrDNA扩增,测序结果表明其与Pseudoxanthomonas菌属的序列相似性为93%,其生理生化特征和分子鉴定结果表明,该菌与假黄单胞菌为不同的属。

甲烷消耗气相色谱分析结论显示,120h后培养瓶中的甲烷浓度降低60%左右,说明该菌株具有较好的利用甲烷的性能。

【总页数】5页(P45-49)【关键词】甲烷利用菌;生理生化特性;16SrDNA;甲烷利用特性【作者】孔淑琼;佘跃惠;易绍金;魏力;黄晓武;冯志云【作者单位】长江大学化学与环境工程学院;中国科学院青岛生物能源与过程研究所;长江大学城市建设学院【正文语种】中文【中图分类】Q933【相关文献】1.一株柴油降解菌B-2的分离鉴定及对烷烃利用的研究 [J], 邓加聪;郑虹;林振民;黄建辉2.一株乳酸利用、丁酸产生菌的分离与鉴定及代谢特性的初步研究 [J], 刘威;朱伟云;姚文;毛胜勇3.一株正十六烷降解菌的分离鉴定及其降解性能研究 [J], 邢汉君; 吴民熙; 郭照辉; 方雅瑜; 罗容珺; 伍善东; 单世平; 冉启洋4.一株甲醇利用菌的分离、鉴定及特性研究 [J], 张建云;谷立坤;彭更;史永胜;赵维文;崔方凯;臧亚奇5.一株噬甲烷菌的分离鉴定及其消除煤矿瓦斯能力的初步研究 [J], 段学军;黄春晓因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

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筛选到 4 个产能持续稳定产甲烷的优势菌群，为产甲烷菌群的人工培养提供了一定的参考。
1 材料与方法
1． 1 材料 1． 1． 1 实验材料
1 号污泥样品取自重庆啤酒厂厌氧消化池，2 号污泥样品取自重庆污水处理厂，3 号、4 号污泥取自重庆光大集团不同污水处理池，5 号污泥样品取自重庆理工大学家属区化粪池。 1． 1． 2 培养基
（ 1． School of Pharmacy ＆ Bioengineering，Chongqing University of Technology，Chongqing 400054； 2． Institute of Engineering Thermophysics； Chongqing University，Chongqing 400030，China）
比较发现在相同的发酵时间内 2 号污泥样品的甲烷产量较 1 号的高很多，2 号样品驯化体系中氧气含量比 1 号低。在驯化前 6d 2 个样品中氧气含量逐渐下降，2 号样品中几乎检测不到氧气谱峰。第 8d 检测时 1 号污泥样品中氧气含量上升，产甲烷量迅速降低，表明体系中即使少量的氧气进入对产甲烷菌的代谢活动用明显的影响。因此在驯化和测样过程中要将整个体系密封好，严格控制氧气。
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将灭菌培养基 20mL 加入到 100mL 的无菌三角瓶中，用可调电炉加热至沸腾后通入氮气 3 ～ 5min 以去除培养基中的溶解氧，（以培养基中刃天青的颜色变化判断，无氧时刃天青无色），之后按 2% （ V / V）的比例迅速加入称量好的固体 Na2 S，用 4 层透明胶带密封瓶口。 1． 2． 3 产甲烷菌群的驯化筛选
由图 4 可知，3 号和 5 号样品产甲烷较多且产量逐步上升，最高分到 45 mL 和 36 mL，4 号样品产量很少，且呈产量逐步降低的趋势。 2． 4． 2 第二轮驯化结果
在第一轮驯化的基础上，更换新鲜培养基对 3、4、5 号样品进行第二轮驯化，第二轮驯化液为 40mL 培养基和 10mL 驯化后菌液的混合液。
第三轮驯化过程中，1 号和 2 号样品菌群迅速适应环境，环境中更早呈现无氧环境，利于产甲烷菌群的生长，CH4 产量持续增高。结果表明：经过三轮驯化，1 号和 2 号样品可以完全在人工培养基中生长，产甲烷量持续稳定，驯化获得成功。 2． 4 产甲烷菌群的筛选方法的验证
采用 2． 3 所述的方法，对 3、4、5 号污泥样品进行驯化。驯化液包括培养基 20mL，污泥样品 20mL。 2． 4． 1 第一轮驯化结果
用 1． 2． 3 的方法对 3 号、4 号、5 号样品进行驯化。
2 结果与分析
2． 1 第一轮驯化结果图 1 为 1 号和 2 号污泥样品第一轮富集驯化过程中沼气
甲烷含量随时间的变化。从图中可以看出 1 号污泥样品在发酵的 1 ～ 6d 内甲烷产量呈逐渐上升的趋势，第 6d 后由于体系进入少量氧气，甲烷产量下降。在相同的发酵时间内 2 号污泥样品产生的气体中甲烷含量则一直呈上升趋势。
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生物技术
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一种产甲烷优势菌群的筛选方法
张云茹1 ，刘逸轩1 ，沈庆涛1 ，王永忠2
（ 1．重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆 400054； 2．重庆大学工程热物理研究所，重庆 400030）摘要：目的：用简便易行的产甲烷优势菌群的筛选方法，筛选出能够人工培养的且高效产甲烷的复合微生物。方法：用乙酸钠除氧培养基驯化富含产甲烷菌的厌氧活性污泥，逐渐增加驯化体系中培养基和菌液的比率，使驯化体系中微生物菌群适应人工培养条件。结果：筛选出 4 个产甲烷优势菌群。筛选出的 1 号、2 号、3 号、5 号菌群在培养 7d 后均产甲烷量分别达到 46mL、 38mL、51mL、38mL，在短时间内 4 个菌群产甲烷量能持续稳定上升。结论：验证表明建立的方法筛选高效产甲烷菌群简便易行，为沼气工作者提供了一定的参考。关键词：产甲烷菌；筛选；驯化；乙酸钠；优势菌群
第一轮的驯化，产甲烷高峰出现得更快，而且持续时间也相对较长； 1 号样品在前 5d 中的 CH4 产量明显比 2 号样品要高，到第 5d 1 号和 2 号样品甲烷产量分别达到 63 mL 和 54mL，均超过系统气体总量的 50% 。但是 2 号样品 CH4 产量相对 1 号样品持续稳定。结果表明驯化过程增强了菌种产甲烷的能力。
按同样的方法，第三轮驯化在三角瓶中注入 40mL 无菌培养基和 10mL 经第二轮驯化的培养液。逐渐加大驯化液中培养基和培养液的比率，直至用人工培养基对产甲烷菌群能成功培养传代，并能保证持续稳定的产甲烷量为驯化成功。 1． 2． 4 产甲烷菌群的筛选方法的验证
中图分类号： Q89； Q93 － 33 文献标识码： A doi： 10． 3969 / j． issn． 1004 － 311X． 2011． 02． 051
A Method of Screeing Preponderant Methanogenic Bacteria
ZHANG Yun － ru1 ，LIU Yi － xuan1 ，SHEN Qing － tao1 ，WANG Yong － zhong2
本文报道了一种产甲烷优势菌群的筛选方法，用该方法
收稿日期： 2010 － 12 － 16；修回日期： 2011 － 02 － 24 资助项目：重庆市科技攻关项目（ “具有高效破壳与集气性能的内循环自热式沼气反应器”，2009AC6056）资助作者简介：张云茹（ 1977 －），女，硕士，讲师，从事农业固体废物的处理研究。
0 引言
沼气发酵是一个微生物协同作用的过程，由多种产甲烷细菌与非产甲烷细菌相互作用、相互制约共同完成。产甲烷菌是沼气发酵微生态系统中食物链末端的一群成员。在厌氧条件下，产甲烷细菌利用非产甲烷细菌的中间产物和最终代谢产物作为营养物质和能源而生长繁殖，最终产生大量甲烷和二氧化碳等［1］。
在除氧培养基中用注射器注入 1 号、2 号污泥样品 20mL 密封，于恒温培养箱中 37℃ 静止培养，开始第一轮驯化。定时检测产甲烷量的变化。每轮驯化每个样品均设 3 个重复。
当样品产甲烷量持续上升或急剧下降时，用注射器从第一轮的驯化液中吸取 15mL 注入 25mL 除氧乙酸钠培养基，同条件进行第二轮驯化。
从图 5 可以看出，3 号和 5 号样品产甲烷量直线上升，在培养至第 7d 甲烷产量分别为 52mL 和 38mL，4 号样品甲烷产
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号和 5 号样品中的菌群能在人工培养
沼气中气体浓度用气相色谱仪检测，主要技术参数为：色谱柱填料为苯乙烯高分子多孔小球，柱长 2m，载气为 N2 ，流速为 25mL / min，TCD 检测器，电流为 80mA，柱箱温度为 50℃ ，汽化室 80℃ ，检测室温度分别为 120℃ ，柱前压力 0． 13Mpa，进样量为 0． 5mL。 1． 2． 2 培养基的除氧
乙酸钠培养基含微量元素、维生素混合液基详见参考文献［20］，所加维生素液中盐酸吡哆醇用盐酸硫胺代替，维生素 B12 用片剂，浓度不变。 1． 1． 3 仪器
SD － 3000B 气相色谱仪； SKP － 02B 恒温培养箱； XFS － 280 高压灭菌锅。 1． 2 方法 1． 2． 1 气体分析检测方法
Abstract： Objective： An easily new method was presented to select preponderant mixed methanogenic bacteria which could produce methane efficiently and be coutrled in defined medium． Method： Anaerobic activated sludge rich in methanogenic bacteria was domesticated in anaerobic medium with sodium acetate as its sole carbon source． During the domestication the ratio of the medium and the bacilli was gradually increased enable the microorganism to adapt to the artificial culture conditions． Result： 4 preponderant methanogenic bacteria were obtained by the way and named methanogenic bacteria（ MB） 1，MB2，MB3，MB5． The methane yield of 4 dominant microorganisms reached 46mL，38mL，51mL，38mL separately after culturing 7 days in artificial medium． and could increase continuously and steady． Conclusion： The new method of selecting methanogenic bacteria was verified to be feasible and easy and provide some reference material for biogas － research worker． Key words： methanogenic bacteria； screen； domestication； sodium acetate； dominant microorganisms