实验十 酵母菌形态观察及死活细胞鉴定
一．目的要求：
1. 观察酵母菌的形态及出芽生殖。
2掌握酵母菌的死活细胞的鉴别。
3.掌握酵母子囊孢子的观察方法。
二.实验原理
1．形态观察
酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见细菌大几倍甚至几十倍。大多数酵母菌以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通过结合产生子囊孢子。本实验通过美蓝染液水浸片和水—碘液水浸片来观察酵母菌的形态和出芽生殖方法。
2.死活鉴定
本实验通过用美蓝染色制成水浸片，来观察生活的酵母形态和出芽生殖方式。美蓝是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的，用它来对酵母的活细胞进行染色，由于细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以酵母的活细胞无色，而对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，用美蓝水浸片不仅可观察酵母的形态，还可以区分死、活细胞。
3.子囊孢子
子囊孢子是子囊菌类真菌有性生殖产生的有性孢子。在酵母菌中，能否形成子囊孢子及其形态是酵母菌分类鉴定的重要依据之一。酵母菌形成子囊孢子需要一定的条件，所以对不同种属的酵母菌要选择适合形成子囊孢子的培养基。麦氏培养基（葡萄糖—醋酸钠培养基）有利于酿酒酵母子囊孢子的形成。
三.实验器材
1.菌种：酿酒酵母培养约2d的酵母合成培养基和麦氏琼脂斜面。
2.溶液或试剂：0.05%和0.1%吕氏碱性美蓝染液，革兰氏染色用碘液。5%的孔雀绿水溶液，0.5%的番红水溶液，95%的乙醇
3.仪器或其他用具：显微镜，载玻片，盖玻片等。
四.操作步骤
1.酵母合成培养基的配制
按配方称取酵母合成培养基各组分，配置3瓶60ml的培养液各装入250ml锥形瓶中，再用六层纱布封口，用牛皮纸包扎后121℃灭菌20min。灭菌后置于摇床上震荡。
2.麦氏琼脂的配制
按配方称取麦氏琼脂各组分，制成10只斜面，每只内培养液为5至10ml，按常规方法包扎后121℃灭菌20min。
实验二 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别
一、 目的要求
1. 进一步学习并掌握光学显微镜低倍镜和高倍镜的使用方法；
2. 观察并掌握酵母菌的细胞形态及其子囊、子囊孢子和假菌丝的形态；
3. 学习并掌握鉴别酵母菌细胞死活的方法；
4. 了解酵母菌子囊孢子的染色方法及假菌丝观察的压片培养法。
二、 实验材料
1. 菌种：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、热带假丝酵母（Candida tropicalis）、粟酒裂殖酵母（Sachizosaccharomyces pombe）
2. 染色液：0.1％美蓝染色液、孔雀绿染色液、沙黄染色液、95％乙醇等
3. 其他：显微镜、载玻片、盖玻片、擦镜纸、吸水纸等
三、 基本原理
酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见的细菌大几倍甚至几十倍，因此，不必染色即可用显微镜观察其形态。大多数酵母以出芽方式进行无性繁殖，有的二分裂殖；子囊菌纲中的酵母菌在一定条件下，可产生子囊孢子进行有性生殖。酵母菌假菌丝的生成与培养基的种类、培养条件等因素有关。
美蓝是一种弱氧化剂，氧化态呈蓝色，还原态呈无色。用美蓝对酵母细胞进行染色时，活细胞由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能将美蓝由篮色的氧化态转变为无色的还原态型，从而细胞呈无色；而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则由于细胞内还原力较弱而不具备这种能力，从而细胞呈蓝色，据此可对酵母菌的细胞死活进行鉴别。
四、 操作步骤
1。水浸片观察：
1）制片：在干净的载玻片中央加一滴预先稀释至适宜浓度的酵母液体培养物，从侧面盖上一片盖玻片（先将盖玻片一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上），应避免产生气泡，并用吸水纸吸去多余的水分（菌液不宜过多或过少，否则，在盖盖玻片时，菌液会溢出或出现气泡而影响观察；盖玻片不宜平着放下，以免产生气泡）。
2）镜检：将制作好的水浸片置于显微镜的载物台上，先用低倍镜，后用高倍镜进行观察，注意观察各种酵母的细胞形态和繁殖方式，并进行记录。
南京林业大学实验报告
实验四
酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别
（一）实验目的
1、观察酵母菌的细胞形态及出芽生殖方式；
2、学习掌握区分酵母菌死、活细胞的染色方法；
3、掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。
（二）实验原理
酵母菌是多形的、不运动的单细胞真核微生物。无性繁殖主要是出芽生殖。
本实验通过用美蓝染色浸片来观察生活的酵母形态和出芽生殖方式。
美蓝是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的，用它来对酵母的活细胞进行染色。
三）实验器材
1、菌种：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）培养约2d的麦芽汁斜面培养物；
2、染色液和试剂：0.1% 吕氏碱性美蓝染液；
3、器材：载玻片、盖玻片、酒精灯、擦镜纸、显微镜等。
(四）实验方法（美蓝浸片）
在载玻片中央加一滴0.1％吕氏碱性美蓝染色液，用接种环挑取少量酵母菌苔放入上述液滴里，混合均匀；
用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上；
将制片放置约3min，先低倍镜后高倍镜观察酵母形态和出芽情况，并根据颜色区别死活细胞。
（五）注意事项
1、加染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现大量气泡而影响观察；
2、盖玻片不宜平着放下，以免产生气泡影响观察。
酵母菌死活细胞区别图（10×40倍下观察）
死细胞（呈蓝色或淡蓝色） 活细胞（无色）
（六）心得体会：
在制片的时候，先将盖玻片一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上，并且要避免产生气泡。
在用美篮染色的时候，注意染色液和菌液不宜过多或过少，并且应该尽量等量而且要混匀。
实验一 酵母菌的形态观察及死活细胞鉴别
预习内容：
1. 光学显微镜的使用（参见周德庆，微生物学实验教程第3版，23-27页）
2. 酵母菌的美蓝染色观察（参见周德庆，微生物学实验教程第3版，91-95页）
预习思考题：
1. 随着物镜放大倍数的增加，视野的亮度是增强还是减弱？应如何调节？视野范围是如何变化的？
2. 制作水浸片时如何避免产生气泡？
3. 影响活菌数目的因素有哪些？染液浓度、染色时间及染色时的pH等因素对死活细胞数目比例有什么影响？
4. 如何测定酵母菌死亡率？简述其原理。
5. 标本片上的某一物象，第一次看到后如何再次找到它?
一、实验目的与要求
1. 了解普通光学显微镜的构造及原理，正确掌握使用显微镜的方法；
2. 观察酵母菌的形态及出芽生殖方式；
3. 学习区分酵母菌死活细胞的实验方法；
4. 掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。
二、实验原理
1. 酵母菌
酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍，不必染色即可用显微镜观察其形态。但由于细胞个体大，采用涂片的方法制片有可能损伤细胞，一般通过美蓝染液水浸片或水-碘液浸片法来观察酵母细胞。
大多数酵母以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。本实验通过美蓝染液水浸片和水一碘液水浸片来观察酵母的形态和出芽生殖方式，并对酵母细胞进行死活染色鉴别。
2. 美蓝染液
美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母活细胞染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，而对代谢作用微弱或死细胞，无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，不仅用此法可观察酵母细胞形态，也可用来鉴别酵母菌的死细胞和活细胞。
图1：酵母菌美蓝浸片观察3min（10×40） 图2：酵母菌美蓝浸片观察30min（10×40）
