实验十六 酵母菌细胞形态观察及死活细胞的染色鉴别
目的要求
1. 通过观察了解酵母细胞的形态结构。
2. 掌握鉴别酵母细胞死活的染色方法。
材料
1. 菌种：酵母菌菌悬液。
2. 染料：0.1％美兰染色液。
3. 其他：显微镜、载玻片、盖玻片、滴管、试管、蒸馏水等。
原理
酵母菌细胞较大，不必染色即可用显微镜观察其形态。
用美兰染色液可对酵母细胞进行死活染色鉴别。美兰是一种弱氧化剂，氧化态呈蓝色，还原态呈无色。活的酵母细胞，因新陈代谢的不断进行，具有一定的还原能力，能将进入细胞的美兰还原，而细胞不被染色。因此，用美兰对酵母细胞染色一定时间后，无色的为活细胞，呈蓝色的则为死亡细胞。需要注意的是，一个活酵母菌的还原能力是一定的，必须严格控制染料的浓度和染色时间。
方法
1．酵母菌细胞形态的观察
取洁净的载玻片一块，用滴管取酵母菌悬滴于载玻片中央，取盖玻片一块，小心地将盖玻片一端与菌液接触，然后缓慢地将盖玻片放下，以避免产生气泡。至此，一片酵母菌水浸标本片就制成了。
先用低倍镜观察，再用高倍镜观察，观察时注意酵母细胞的形状及出芽情况。
2．死活酵母细胞的染色鉴别
取0.1％美兰液一滴，滴在一块洁净的载玻片中央，加一滴酵母菌悬液，混合均匀，染色3～5分钟后加盖玻片制成水浸标本片，镜检。
内容
1. 制片观察所给各种酵母菌的细胞形态。
2. 用美兰液对酵母菌死活细胞进行染色鉴别。
结果与思考题
1. 绘图表示所观察的各种酵母菌，注明菌名及放大倍数。
2. 用美兰对酵母细胞进行染色鉴别时，为什么要控制染料的浓度和染色时间?
实训五 酵母菌的形态观察及死活细胞鉴定
一、实验目的
1、观察酵母细胞的形态结构及出芽繁殖；
2、掌握鉴别死活酵母细胞的染色技术；
3、学会水浸制片观察酵母菌。
二、实验原理
酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，细胞一般呈球状、卵圆状、椭圆状、柱状或分枝状的假菌丝。其细胞核与细胞质有明显分化，菌体较细菌大几倍甚至十几倍，在高倍显微镜下即可观察到胞内有明显的细胞核和内含物。酵母菌的繁殖方式分为无性繁殖和有性繁殖两种。无性繁殖大多是以出芽的方式进行，也有分裂繁殖；有性繁殖则是通过接合产生子囊孢子。酵母菌的母细胞经过一系列的芽殖后，如长大的子细胞不与母细胞分离，就会形成藕节状的假菌丝，成为假丝酵母。
用生理盐水（或水-碘液染色液）制作水浸片可以观察酵母菌的形态和出芽繁殖方式。用美蓝染色液制水浸片可鉴别酵母细胞的死活状态。美蓝是一种弱氧化剂，氧化时呈蓝色，还原后呈无色。用美蓝对酵母菌进行染色时，活酵母细胞因新陈代谢不断进行，胞内具有很强的还原能力，能将进入细胞的美蓝还原，使得细胞呈无色。因此，具有还原能力的酵母活细胞为无色，而老化细胞还原能力弱，染色后呈淡蓝色，死细胞则失去还原能力，被染料染成蓝色。
三、实验材料
1、菌种：啤酒酵母或葡萄汁酵母（制成斜面培养物或液体培养物）
2、试剂：0.1%吕氏美蓝染色液、0.05%吕氏美蓝染色液、水-碘液染色液（革兰氏染液用碘液：水=1：3）、0.85%生理盐水
3、仪器及其他：显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、盖玻片、镊子、滴管、酒精灯、蒸馏水、吸水纸等
四、实验时间
2课时
五、实验步骤
（一）生理盐水浸（封）片（酵母菌的形态观察）
1、在载玻片中央加1滴无菌生理盐水（不宜用无菌水制作水浸片，否则细胞易破裂），然后以无菌操作从斜面培养基上用接种环取少量啤酒酵母菌苔与生理盐水混匀，使其分散成云雾状薄层。
2、用镊子取洁净盖玻片，先将其一边与菌液接触，然后缓慢地将盖玻片放下，避免产生气泡影响观察。
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【细菌菌落特征】 常见细菌特征性菌落
细菌,酵母,霉菌的形态与菌落特征观察
实验四、细菌，酵母，霉菌的形态与菌落特征观察
一、实验目的
细菌：观察食品中常见细菌的平板菌落特征，了解细菌的菌落在细菌形态学检定上的重要性 酵母菌：1.学习并掌握观察酵母菌的形态及出芽繁殖的基本方式
2.学习区分酵母的死活细胞的实验方法
3.观察酵母的平板菌落特征，了解酵母菌的菌落在真菌形态学检定上的重要性
霉菌：1.学习并掌握观察四类常见霉菌形态特征的基本方法
2.掌握青霉，曲霉的小室栽片培养法，以便更好地观察其个体形态
3.观察霉菌的平板菌落特征，了解霉菌的菌落特征在丝状真菌形态学检定上的重要性
二、实验原理
1．细菌：将单个微生物细胞或多个同种细胞接种于固体培养基表面，经适宜条件培养，以母细胞为中心，在有限空间中大量繁殖，扩展成一堆肉眼可见的有一定形态构造的子细胞群落，成为菌落。若将某一纯种细胞大量密集接种于固体培养基表面，菌体生长的各菌落连接成片，称为菌苔。各种细菌在平板上生成的菌落均具有一定特征，对细菌的分类，鉴定有重要意义，菌落主要用于微生物的分离，纯化，鉴定，计数等研究和选种，育种等实际工作中。
2．酵母菌：以出芽繁殖为主要特征的不运动的单细胞真核微生物，其细胞核与细胞质有明显分化，个体大小比常见细菌大几倍甚至几十倍，酵母菌的形态通常有球状，卵圆状，椭圆状，柱状，或香肠状等多种。酵母菌的无性繁殖主要有芽殖，裂殖与产生掷孢子和厚垣孢子。有性繁殖通过结合产生子囊孢子。酵母菌的母细胞在一系列的芽殖后若长大的子细胞与母细胞不分离，就会形成藕节状的假菌丝，称假丝酵母。 美蓝是一种无毒的弱氧化剂染料，其氧化型呈蓝色，还原型呈无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。 2
微生物实验思考题参考答案及知识要点
一．酵母菌形态观察及死活细胞鉴别
1.吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同对酵母菌死细胞数量有何影响?是分析其原因。
美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变成为无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。
美蓝浓度高了，代谢不太活跃的活细胞也会被染色，从而使观察到的死细胞较多，活细胞较少；反之，则代谢微弱的细胞也能还原美蓝，不被染色，从而使观察到的死细胞较少，活细胞较多。
二. 细菌的简单染色和革兰氏染色
1. 革兰氏染色中那一步是关键?为什么？你是如何操作的？
革兰氏染色的关键步骤是：乙醇脱色（是脱色时间）。如果脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片的厚薄，脱色是玻片晃动的快慢及乙醇用量的多少等因素的影响，难以严格规定（脱色是应当控制速度，脱色时间一般为20—30s）。
2. 固定的目的之一是杀死菌体，这与自然死亡的菌体有何不同？
自然死亡的菌体本身已经部分自溶，结构已经改变。固定杀死细菌时细菌结构是保持死亡时的状态的。
3. 不经复染这一步能否区分革兰氏阳性菌和阴性菌？
能。在酒精脱色后，不被酒精脱色而保留紫色者为革兰氏阳性菌（G＋），被酒精脱色为革兰氏阴性菌。最后一步用番红染液复染，是为了让结果更清楚。
4. 涂片为什么要固定，固定适应注意什么问题？
a 杀死细菌并使菌体黏附与玻片上；b 增加其对染料的亲和力。
固定时应注意：手持玻片，菌膜朝上，在微火过3次（手指触摸玻片反面，不烫手为宜），固定时应尽可能维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。
