复方中药对免疫抑制小鼠免疫促进作用的研究
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复方中药对免疫抑制小鼠免疫促进作用的研究
屈新辉;刘春发;胡建新;何丹;项正兵;吴晓牧
【摘 要】目的 从细胞及分子水平,探求中药复方对免疫功能增强的作用及效能,在扶正固本、活血益气的中药中遴选出有广阔应用前景的促进免疫的中药复方.方法
50只昆明小鼠随机分成正常对照组、模型对照组与高剂量中药组、中剂量中药组、低剂量中药组.用环磷酰胺抑制小鼠免疫功能制作免疫抑制模型,观察用药后正常对照组、模型对照组与高剂量中药组、中剂量中药组、低剂量中药组血清IgG、补体C3,脾淋巴细胞表面抗原标志物CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD19+、CD49b+,脾淋巴细胞细胞因子IL-2和IFN-γ及体重和脾指数.结果 与模型对照组相比,高剂量中药组、中剂量中药组、低剂量中药组体重和脾指数、CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD19+差异无统计学意义(P＞0.05),低剂量中药组血清IgG降低[(177.19±45.66)g/L],CD49b+、补体C3及脾淋巴细胞细胞因子IL-2和IFN-γ升高[(32.43±6.31)％、(294.0±61.2)g/L、(38.44±7.82)％、(22.11±6.29)％],差异均有统计学意义(均P＜ 0.05),中剂量中药组脾淋巴细胞细胞因子IL-2和IFN-γ升高[(35.40±4.59)％、(22.26±8.84)％],差异均有统计学意义(均P＜ 0.05).正常对照组与模型对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 尽管还未能证实复方中药对特异性细胞免疫和体液免疫有促进作用,但在一定剂量范围内对非特异性细胞免疫和体液免疫有显著促进作用.
【期刊名称】《中国医药导报》
【年(卷),期】2014(011)004
【总页数】5页(P4-8) 【关键词】免疫促进;复方中药;小鼠
【作 者】屈新辉;刘春发;胡建新;何丹;项正兵;吴晓牧
【作者单位】江西省人民医院神经内科,江西南昌330006;江西省神经病学研究所,江西南昌330006;南昌大学医学院,江西南昌330006;江西省人民医院药剂科,江西南昌330006;江西省神经病学研究所,江西南昌330006;江西省人民医院神经内科,江西南昌330006;江西省神经病学研究所,江西南昌330006;江西省人民医院神经内科,江西南昌330006;江西省神经病学研究所,江西南昌330006
【正文语种】中 文
【中图分类】R285.5
免疫学是现代医学发展极为迅速的学科之一，疾病发生发展很多都与免疫功能有关，某些肿瘤患者在放疗、化疗后或一些病毒感染后致免疫性力低下，但临床增强免疫力有明显临床疗效的药物却不多见。祖国医学认为“正虚邪扰”，疾病与人体的抵抗力密切相关，并且临床处方运用扶正祛邪的法则治疗疾病，临床观察亦有疗效，许多学者研究了多种单味药对免疫功能的调节作用，尝试发现、提取、合成能调节免疫的化合物，本实验旨在从细胞及分子水平出发，探求中药复方对免疫功能增强的作用及效能，在扶正固本、活血益气的中药中遴选出有广阔应用前景的促进免疫的中药复方。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 中药的制备
复方中药（由西洋参、黄芪、枸杞、当归等多味药）组成，按总量400 g（西洋参96 g、黄芪96 g、枸杞128 g、当归80 g）称取处方各药（由江西省人民医院药剂科供应），加蒸馏水400 mL，浸泡24 h，隔水煮1 h，滤过药液，药渣再加蒸馏水适量，煮1 h，滤出药液，合并两次药液，隔水浓缩至400 mL，即每1 mL相当于1 g生药的原液，灭菌封存备用。
1.1.2 实验动物
6 周龄昆明小鼠 50 只，体重（20±2）g，雌雄各半，均购自江西中医学院。动物自由饮食、饮水，动物质量合格证号：JIDW NO.2012-0041。试验过程中对动物的处置符合2006年科技部关于对试验动物的有关规定[1]。
1.1.3 试剂与仪器
免疫抑制剂环磷酰胺（江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：12030625），为 200
mg/支的粉针剂；小鼠IgG和补体C3的ELISA检测试剂盒为西唐生物公司进口分装产品（批号分别为：1208061、1208201）；Anti-MouseCD3（PE-Cy5）、Anti-MouseCD4（FITC）、Anti-Mouse CD8 （PE）、Anti-Mouse CD19
（PE）、Anti-MouseCD49（FITC）、Anti-MouseIL-2（PE）、Anti-MouseIFN-γ（FITC）荧光抗体 （购于eBioscience Inc.San Diego，CA公司，批 号 分 别 为 E06065-1630、E00077-1630、E01036-1633、E01047-1630、E00752-1630、E02060-1630、E00862-1631）；BECKMAN COULTER流式细胞仪；酶标仪（550 型）；倒置显微镜（Leica）；光学显微镜（OLYMPUS）；红细胞裂解液（实验室制自备）；PBS缓冲液（实验室制自备）；16号小鼠灌胃针；Allegra 64R低速冷冻离心机 （BECKMAN COULTER，rmax=204 mm）；HC电子天平（0.1 g）、sarrorious 电子天平（0.001 g），300目金属筛网。
1.2 方法
1.2.1 药物急性毒理试验
该复方中药各组份临床应用广泛，未见明显毒副作用，因此用小鼠灌胃最大容量0.4 mL/10 g[2]来检查药物的LD50，取20只小鼠，每次灌胃复方中药0.8 mL，2次/d，观察 15 d，无一死亡，可见 LD50＞ 0.4 mL/10 g。
1.2.2 实验分组
应用随机数字表法进行随机将动物分为5组：正常对照组、模型对照组、低剂量中药组、中剂量中药组、高剂量中药组。每组10只，雌雄各半。将需随机分组的雌雄性小鼠分别称重，按序编号记录体重结果，给每只小鼠鼠分配一个随机数，按随机数字大小升序排序，按排序后的顺序依次将小鼠分入各个剂量组 。各组体重均值再做F检验（单因素方差分析），需满足P＞0．05，如果条件不能满足，则重复以上过程，直到满足为止。随机分组结束后，分别按各组的原始编号编上实验编号。
1.2.3 小鼠免疫抑制模型
建立小鼠免疫抑制模型一次性腹腔注射环磷酰胺200 mg/kg，造模完成[3]，正常对照组注射环磷酰胺溶剂生理盐水4 mL/kg。
1.2.4 给药方法
中药治疗组于环磷酰胺造模后第2天开始用中药按小鼠体重灌胃，高剂量中药组灌中药0.04 mL/g，中剂量中药组灌中药0.02 mL/g+蒸馏水0.02 mL/g，低剂量中药组灌中药0.01 mL/g+蒸馏水0.03 mL/g，正常对照组、模型对照组均灌蒸馏水0.04 mL/g，喂服14 d。
1.2.5 实验指标的检测
1.2.5.1 体重和脾脏指数 各组小鼠称量体重，于试验结束后断颈处死，取脾脏，用电子天平称湿重，计算脾指数，脾脏指数=100%脾脏质量/体质量（g/g）。
1.2.5.2 IgG和补体C3的检测 于试验第14天摘取眼球取血，室温放置2 h后3000 r/min离心10 min将血清和红细胞迅速小心地分离，离心得血清后严格按照ELISA试剂盒说明书方法检测小鼠血清IgG和补体C3水平。 1.2.5.3 脾淋巴细胞 CD3、CD4、CD8、CD19、CD49b NK细胞、细胞因子IL-2、IFN-γ检测 第14天取小鼠脾脏研磨成单细胞悬液经筛网过滤于离心管中离心，弃上清再加入红细胞裂解液离心，弃上清后加入PBS定容至1 mL，用倒置相差显微镜进行细胞计数，调节细胞数为 1×107～10×107个， 加入标记抗小鼠 CD3、CD4、CD8、CD19、CD49b NK 细胞、 细胞因子 IL-2、IFN-γ荧光抗体抗体，4℃避光孵育30 min，PBS洗涤2次，流式细胞仪检测淋巴细胞和细胞因子指标的变化。
1.3 统计学方法
采用SPSS 19.0统计分析软件分析，所有计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验。将资料进行正态性分析和Levene法方差齐性检验，行两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐性采用LSD-t检验，方差不齐采用Tamhane法检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 体重和脾指数结果比较
正常对照组和模型对照组与各治疗组第1天的体重均值比较，差异无统计学意义（P=0.216＞0.05），表明随机分组成功。第14天的体重模型对照组比正常对照组减轻，差异有统计学意义（P=0.020＜0.05），而模型对照组与各治疗组体重比较，差异无统计学意义（P=0.126、0.904、0.796，均 P ＞ 0.05），表明小鼠免疫抑制后引起体重减轻，而各复方中药治疗组对免疫抑制小鼠体重无影响。脾指数模型对照组比正常对照组降低（P=0.0001＜0.05），而模型对照组与各治疗组比较，差异无统计学意义（P=0.967、0.255、0.941 ＞ 0.05），表明小鼠免疫抑制后引起脾指数降低，而各复方中药治疗组对免疫抑制小鼠脾指数无影响。见表1。
表1 各组体重和脾指数比较（x±s）注：与模型对照组比较，*P＜0.05组别 只数
第1天体重（g）第14天体重（g）脾指数（100×g/g）正常对照组模型对照组高剂量中药组中剂量中药组低剂量中药组10 10 10 10 10 25.21±0.87
24.25±2.20 24.90±1.81 23.98±1.42 24.88±1.45 32.66±1.62*29.75±2.98
27.95±2.49 29.61±1.50 30.05±3.02 0.91±0.11*0.61±0.20 0.62±0.21
0.75±0.36 0.62±0.29
2.2 各组抗体IgG、补体及CD19结果比较
模型对照组比正常对照组IgG显著增高（P=0.002＜0.01），C3显著降低（正态分布方差不齐t检验，P=0.011＜0.05），而低剂量中药组与模型对照组比较，差异有高度统计学意义（P=0.001＜0.01），表明低剂量中药组能显著降低免疫抑制小鼠抗体IgG的浓度，升高免疫抑制小鼠补体C3浓度。见表2。
表2 抗体、补体及B淋巴细胞表面抗原CD19结果比较（x±s）注：与模型对照组比较，*P＜0.05，#P＜0.01组别 只数 IgG（g/L） C3（g/L） CD19（%）正常对照组模型对照组高剂量中药组中剂量中药组低剂量中药组10 10 10 10 10
126.13±41.98#185.47±30.98 169.54±36.79 159.67±29.42
177.19±45.66#362.3±167.5*191.3±57.0 187.0±49.9 236.1±61.5
294.0±61.2#40.88±9.90*30.02±6.64 32.42±7.94 31.98±13.21 30.13±12.04
2.3 各组脾淋巴细胞 CD3＋、CD4＋、CD8＋、CD4＋/CD8＋结果比较
