基因转染技术
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瞬时转染实验步骤
瞬时转染实验步骤全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：瞬时转染实验是一种常用的基因转染技术，可用于将外源DNA或RNA导入到目标细胞中，以研究基因表达和功能。
本文将介绍瞬时转染实验的步骤及注意事项。
一、实验前准备1.1 制备转染试剂：根据所需的转染试剂种类，准备相应的试剂。
常用的转染试剂包括有机溶剂转染试剂（如Lipofectamine 2000）、阳离子聚合物转染试剂（如Polyethylenimine，简称PEI）等。
1.2 制备转染质粒：准备含有目标基因的转染质粒。
转染质粒应进行质粒提取、纯化并测序确认。
1.3 培养细胞：细胞应在培养皿中充分培养至70%～90%的浓度，以保证转染效率。
1.4 预热培养基：将足够的培养基提前预热至37℃，以用于细胞培养和转染。
二、转染操作步骤2.1 向细胞培养皿中加入转染试剂：按照转染试剂的使用说明书，向培养皿中加入适量的转染试剂，并在无血清培养基中混合均匀。
2.2 加入转染质粒：将准备好的转染质粒溶液滴加入培养皿中，注意避免空气泡。
2.3 孵育细胞：将培养皿放置在37℃的培养箱中孵育一定时间，通常为4～6小时。
2.4 更换培养基：在转染后适当时间内更换含有血清的培养基，以保证细胞正常生长。
2.5 收获样品：根据实验设计和研究目的，选择合适的时间点收获转染后的细胞样品。
三、注意事项3.1 转染试剂浓度：转染试剂的浓度应根据实验目的和细胞类型进行优化，以达到最佳的转染效果。
3.2 转染时间和转染效率：转染时间过长或过短都可能影响转染效果，应根据实际情况进行调整。
3.3 质粒浓度和纯度：转染质粒应具有足够的纯度和浓度，以确保转染效果。
3.4 细胞密度和状态：细胞应在良好的状态下进行转染，过高或过低的细胞密度都会影响转染效果。
3.5 实验控制组：应设置适当的对照组，以进行比较和验证实验结果的可靠性。
总结：瞬时转染实验是一种常用的基因转染技术，通过适当的实验操作步骤和注意事项，可获得可靠的实验结果。
sirna转染原理
sirna转染原理siRNA转染原理。
siRNA（small interfering RNA）是一种短链RNA分子，可以在细胞内特异性地沉默基因表达。
siRNA转染作为一种常用的实验技术，被广泛应用于基因功能研究、药物靶点筛选和疾病治疗等领域。
siRNA转染的原理是通过siRNA分子的引导，将特定基因的mRNA降解，从而抑制该基因的表达。
下面将详细介绍siRNA转染的原理及其在实验中的应用。
首先，siRNA转染的原理是基于RNA干扰（RNA interference，RNAi）的机制。
当siRNA分子进入细胞内后，它会与RISC（RNA-induced silencing complex）结合，形成siRNA-RISC复合物。
siRNA-RISC复合物会识别并结合到靶基因的mRNA上，然后RISC中的核酸酶活性将靶mRNA特异性降解，从而导致该基因的表达受到抑制。
其次，siRNA转染的关键在于siRNA分子的设计。
siRNA通常由21-23个碱基组成，其中包括一个“sense”链和一个“antisense”链。
这两条链通过互补配对形成双链结构，其中antisense链与靶基因的mRNA序列互补配对，从而介导mRNA的降解。
在siRNA设计过程中，需要避免与其他基因的mRNA序列互补配对，以确保siRNA的特异性。
另外，siRNA转染的效率受到细胞内siRNA释放和稳定性的影响。
siRNA需要通过转染试剂或载体进入细胞内，然后被释放到细胞质中。
在细胞内，siRNA还需要避免被核酸酶降解，以保持其稳定性和活性。
因此，选择合适的转染试剂和siRNA转染条件对于siRNA转染的效果至关重要。
最后，siRNA转染在实验中的应用包括基因沉默实验、基因功能研究、药物靶点筛选和疾病治疗等。
通过siRNA转染，研究人员可以有针对性地沉默特定基因，观察其对细胞功能和生物学过程的影响，从而揭示基因的功能和调控机制。
此外，siRNA转染还被应用于药物靶点的筛选和疾病治疗研究中，为新药的研发和临床治疗提供重要的实验依据。
转化和转染
转染和转化的区别转染的定义是“将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能”。
其中，核酸包括DNA（质粒和线性双链DNA），反义寡核苷酸及RNAi（RNA interference）。
基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究（基因表达调控，基因功能，信号转导和药物筛选研究）和基因治疗研究。
基因转染需要一定的转染试剂将带有目的基因的载体运送到细胞内。
早期的磷酸钙转染法转染效率很低，且对很多细胞株无效，因此不能满足很多科研工作的需要。
目前，最常用的转染试剂是阳离子脂质体和阳离子聚合物，它们在克服细胞屏障方面跟病毒有很相象的特征，容易透过细胞膜。
其中，阳离子脂质体在体外基因转染中有很高的效率，然而在体内，它迅速被血清清除，在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，这将导致高水平的毒性，因此，在很大程度上限制了其应用。
由于阳离子脂质体的局限性，阳离子聚合物转染试剂日益受到重视。
转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。
它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。
受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。
进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
由外来DNA引起生物体遗传性状改变的过程称为转化(transformation)。
噬菌体常常可感染细菌并将其DNA注入细菌体内，也可引起细菌遗传性状的改变。
通过感染方式将外来DNA 引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染(transfection)。
转染是转化的一种特殊形式。
基因工程:有目的的通过分子克隆技术，人为的操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程。
载体:能在连接酶的作用下和外源DNA片段连接并运送DNA分子进入受体细胞的DNA分子。
转化和转染的概念和区别
转染和转化的区别转染的定义是“将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能”。
其中，核酸包括DNA（质粒和线性双链DNA），反义寡核苷酸及RNAi（RNA interference）。
基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究（基因表达调控，基因功能，信号转导和药物筛选研究）和基因治疗研究。
基因转染需要一定的转染试剂将带有目的基因的载体运送到细胞内。
早期的磷酸钙转染法转染效率很低，且对很多细胞株无效，因此不能满足很多科研工作的需要。
目前，最常用的转染试剂是阳离子脂质体和阳离子聚合物，它们在克服细胞屏障方面跟病毒有很相象的特征，容易透过细胞膜。
其中，阳离子脂质体在体外基因转染中有很高的效率，然而在体内，它迅速被血清清除，在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，这将导致高水平的毒性，因此，在很大程度上限制了其应用。
由于阳离子脂质体的局限性，阳离子聚合物转染试剂日益受到重视。
转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组D NA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。
它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。
受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。
进入细胞的D NA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
由外来DNA引起生物体遗传性状改变的过程称为转化(transfo rmati on)。
噬菌体常常可感染细菌并将其DNA注入细菌体内，也可引起细菌遗传性状的改变。
通过感染方式将外来DNA引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染(transfectio n)。
植物转基因技术的原理和方法
植物转基因技术的原理和方法
1、植物转基因技术的原理
植物转基因技术是指将外源DNA片段插入到植物细胞的过程，从而改变植物的表型特征。
在植物转基因技术中，将外源DNA插入到植物细胞的过程包括以下几个步骤：
(1) DNA片段的生产和收集：DNA片段的生产和收集是通过一系列的生物技术手段来实现的，比如PCR扩增技术、染色体复制，等等。
(2)特異性克隆：特異性克隆是一种利用抗原受体系统的分子生物学技术，主要是通过聚合酶链反应的方法，将无菌的DNA片段植入到宿主细胞中，从而使改变细胞表型性状的抗原受体获得潜在的克隆特异来源。
(3) 载体特异性转染：载体特异性转染是将DNA片段植入到宿主细胞中的过程，它通常是利用哺乳动物质粒等载体将外源DNA片段植入到宿主细胞中。
(4) 转化：转化是植物细胞在受到DNA片段植入后，能够形成含有外源基因的植物的过程。
2、植物转基因技术的方法
(1) 诱导细胞抗性：植物转基因技术可以利用一些诱导剂，如多聚糖、双链RNA等，通过诱导植物细胞的自然抗性，让其增加免疫反应及抗外源性抗原的能力，从而提高转基因植物的转化效率。
(2) 共价结合技术：共价结合技术是一种利用化学方法将外源DNA植入植物细胞的技术，它通常利用某种活性稀释剂将DNA片段与
植物细胞表面形成稳定的共价结合，从而使外源DNA片段能够植入宿主细胞。
(3) 转化抗性：转化抗性是一种利用抗生素来抑制植物细胞的自然抗性，从而促进植物细胞内部外源DNA的转化。
一般常用的抗生素有青霉素和环丙沙星。
(4) 小麦内含体技术：小麦内含体技术是一种利用小麦内含体将外源DNA植入植物细胞的技术，它通常利用小麦内含体外质壁偶联（ECC）促进外源DNA的转化。
基因转染
•COS细胞
它来源于非洲绿猴肾细胞系（CV-1），能组成性表达 SV40的大T抗原。 ①细胞来源丰富； COS细胞 的特点
②细胞易于培养和转染；
③能使转染到该细胞中的带有SV40复制子 的转录载体快速扩增；
④能瞬时大量表达外源基因的产物。
由于转染质粒在COS细胞中无节制复制，最终将导致细 胞无法忍受而死亡。利用COS细胞作为外源基因瞬时表达的 受体细胞可广泛用于哺乳动物基因的表达与调控、蛋白结构 与功能分析等研究。
黄嘌呤-鸟嘌呤转移酶 （XGPRT）基因
哺乳动物细胞无XGPRT酶，不能利用黄嘌呤形成黄 嘌呤磷酸（XMP），但有鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 （HGPRT），可催化黄嘌呤形成次黄嘌呤磷酸 （IMP）。哺乳动物细胞可通过IMP生成GMP。当 用IMP脱氢酶抑制剂霉酚酸，抑制了GMP的合成， 使细胞失去合成DNA能力而死亡。 将含XGPRT基因的重组体导入真核细胞后，在转化 细胞中就能表达XGPRT酶，可在含有黄嘌呤的培养 基中通过XMP中间体补救合成GMP，使DNA合成正 常进行，加入霉酚酸后，阳性克隆因不受霉酚酸的 抑制而存活，而未转化的阴性细胞则受霉酚酸的抑 制而死亡，以此可用来筛选阳性细胞。
一、胸苷激酶基因选择标记
TK是核苷酸补救合成途径的一个关键酶 内源性缺陷tk的宿主细胞——小鼠LMTK—细胞 HAT选择法 • H：次黄嘌呤；补救合成三种核苷酸的原料 • A：氨基喋呤；抑制四氢叶酸合成 • T：胸苷；补救合成dTTP的原料 tk—细胞的鉴别与获得：5`-溴脱氧核糖尿苷 （BUdR）筛选
新霉素（neo）：即G418，一种氨基糖苷类抗 生素，影响80S核糖体功能核蛋白质的合成 新霉素抗性基因编码3`-磷酸转移酶降解G418 适用于所有的真核细胞
细胞sirna转染操作流程
细胞sirna转染操作流程细胞siRNA转染操作流程一、引言细胞siRNA转染是一种常用的基因沉默技术，通过引入特定的小干扰RNA (siRNA) 分子来抑制目标基因的表达。
本文将介绍细胞siRNA转染的操作流程，以及该技术的应用和优势。
二、材料与方法1. 细胞培养：选择合适的细胞系，如人类癌细胞系HeLa，细胞应保持在优良的培养条件下，并处于快速增殖期。
2. 转染试剂：选择适合的转染试剂，如lipofectamine 2000等，根据试剂说明书进行操作。
3. siRNA设计与合成：根据目标基因序列设计合适的siRNA，确保siRNA具有高效的靶向作用和沉默效果。
4. 细胞培养基和缓冲液：准备含有适当浓度的无血清培养基和缓冲液。
三、操作流程1. 处理细胞：将细胞用适量的培养基悬浮在培养皿中，使细胞密度达到合适的转染浓度，一般为60-80%的细胞密度。
2. siRNA与转染试剂复合：将设计好的siRNA与转染试剂按照试剂说明书中的比例混合，并在室温下静置一段时间使其形成复合物。
3. 转染操作：将复合物缓慢滴加到细胞培养皿中，轻轻摇晃培养皿以保证复合物均匀分布在细胞上。
4. 培养细胞：将培养皿放入培养箱中，以适当的条件（如37℃，5% CO2）培养细胞一定时间，以便siRNA能够有效进入细胞并起到沉默目标基因的作用。
5. 细胞分析：根据实验需要，在转染后一定时间内收集细胞，进行相应的实验分析，如蛋白质检测、细胞增殖实验等。
四、应用与优势细胞siRNA转染技术广泛应用于生命科学研究中，可用于研究基因功能、新药靶点筛选、疾病机制探究等领域。
该技术的优势在于操作简便、效率高、靶向性强，并且可用于多种细胞系，适用范围广泛。
五、结论细胞siRNA转染是一种重要的基因沉默技术，通过引入siRNA分子抑制目标基因的表达。
本文介绍了细胞siRNA转染的操作流程和相关应用及优势。
随着该技术的不断发展，相信它将在生命科学研究中发挥越来越重要的作用。
基因转移技术
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影响DEAE-葡聚糖的转染效率的主要因素：细胞的数 量、DNA的浓度和DEAE-葡聚糖的浓度最为重要。大 体说来，按每个直径10cm的培养皿中加入 1～10ug的 转染DNA，并使用每毫升培养基含100～400ug DEAE-葡聚糖的溶液，对于绝大多数类型的细胞，都 能得到很好的转染效率。由于DEAE-葡聚糖对有些细 胞具有毒性，因此用低浓度溶液作短时间的接触反类是将目的基因转导入体外培养的细胞或导入从 体内取出的细胞，观察目的基因在细胞中的表达，这 项技术称基因转染(gene transfection )技术。通常情 况下，该技术转入的目的基因不与细胞染色体发生整 合，而是在细胞质呈现暂时性表达，随时间推移而逐 渐减弱或消失。为了使目的基因进入细胞后能与细胞 基因组DNA发生整合、产生永久性的表达，需用病毒 载体将目的基因导入细胞，并发生整合；
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在1987年，Vlein首先报道了应用此技术将 TMV（烟草花叶病毒）RNA吸附到钨粒表面， 轰击洋葱表皮细胞，经检测发现病毒RNA能进 行复制，并以同样技术将CAT(Chloraphericol acetyltransferase氯霉素乙酰转移酶基因)基因 导入洋葱表皮细胞。现在，该技术已在烟草、 水稻、小麦、黑麦草、甘蔗、棉花、大豆、菜 豆、洋葱、番木瓜、甜橙、葡萄等多种作物上 成功。
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它是目前基因转移效率较好的一种基因转移方 法， 1.可直接用不含有原核载体DNA片段的外 源基因进行转移； 2.外源基因的长度不受限制, 可达100kb ； 3.实验周期相对比较短。
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二、电穿孔法(Electroporation)
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电穿孔(electroporation)是指在高压电脉冲的作用下 使细胞膜上出现微小的孔洞。从而导致不同细胞之间 的原生质膜发生融合作用的细胞生物学过程。几乎所 有类型的细胞，包括植物的原生质体、动物的初生细 胞，以及不能用其它方法(诸如磷酸钙或DEAE-葡聚糖 法)转染的细胞，都可以成功地使用电穿孔技术进行基 因转移。此项技术具有操作简便，基因转移效率高等 优点。
影响DEAE-葡聚糖的转染效率的主要因素：细胞的数 量、DNA的浓度和DEAE-葡聚糖的浓度最为重要。大 体说来，按每个直径10cm的培养皿中加入 1～10ug的 转染DNA，并使用每毫升培养基含100～400ug DEAE-葡聚糖的溶液，对于绝大多数类型的细胞，都 能得到很好的转染效率。由于DEAE-葡聚糖对有些细 胞具有毒性，因此用低浓度溶液作短时间的接触反类是将目的基因转导入体外培养的细胞或导入从 体内取出的细胞，观察目的基因在细胞中的表达，这 项技术称基因转染(gene transfection )技术。通常情 况下，该技术转入的目的基因不与细胞染色体发生整 合，而是在细胞质呈现暂时性表达，随时间推移而逐 渐减弱或消失。为了使目的基因进入细胞后能与细胞 基因组DNA发生整合、产生永久性的表达，需用病毒 载体将目的基因导入细胞，并发生整合；
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在1987年，Vlein首先报道了应用此技术将 TMV（烟草花叶病毒）RNA吸附到钨粒表面， 轰击洋葱表皮细胞，经检测发现病毒RNA能进 行复制，并以同样技术将CAT(Chloraphericol acetyltransferase氯霉素乙酰转移酶基因)基因 导入洋葱表皮细胞。现在，该技术已在烟草、 水稻、小麦、黑麦草、甘蔗、棉花、大豆、菜 豆、洋葱、番木瓜、甜橙、葡萄等多种作物上 成功。
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它是目前基因转移效率较好的一种基因转移方 法， 1.可直接用不含有原核载体DNA片段的外 源基因进行转移； 2.外源基因的长度不受限制, 可达100kb ； 3.实验周期相对比较短。
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二、电穿孔法(Electroporation)
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电穿孔(electroporation)是指在高压电脉冲的作用下 使细胞膜上出现微小的孔洞。从而导致不同细胞之间 的原生质膜发生融合作用的细胞生物学过程。几乎所 有类型的细胞，包括植物的原生质体、动物的初生细 胞，以及不能用其它方法(诸如磷酸钙或DEAE-葡聚糖 法)转染的细胞，都可以成功地使用电穿孔技术进行基 因转移。此项技术具有操作简便，基因转移效率高等 优点。
慢病毒转染原理
慢病毒转染原理慢病毒转染是一种常用的基因转染方法，适用于长期表达外源基因的研究。
慢病毒转染原理主要是利用慢病毒载体将外源基因导入宿主细胞，并将其整合入宿主细胞基因组中，从而实现外源基因的稳定表达。
本文将从慢病毒转染的原理、步骤和应用等方面进行介绍。
慢病毒转染原理。
慢病毒转染的原理主要包括以下几个步骤，首先，将外源基因插入慢病毒载体中，构建成慢病毒表达载体；然后，将慢病毒表达载体转染至包装细胞中，利用包装细胞的辅助病毒蛋白包装慢病毒颗粒；最后，将包装好的慢病毒颗粒用于感染目标细胞，外源基因被整合入宿主细胞基因组中，实现稳定表达。
慢病毒转染步骤。
慢病毒转染的步骤包括慢病毒载体构建、包装细胞培养、病毒颗粒包装和目标细胞感染等。
首先，构建慢病毒表达载体时，需要选择合适的慢病毒载体和适当的启动子，将外源基因插入载体中，并经过序列分析和酶切验证。
其次，包装细胞的培养和病毒颗粒包装是慢病毒转染的关键步骤，需要选择合适的包装细胞系，转染慢病毒表达载体并培养包装细胞，最终收集包装好的慢病毒颗粒。
最后，利用包装好的慢病毒颗粒感染目标细胞，实现外源基因的稳定表达。
慢病毒转染应用。
慢病毒转染在基因功能研究、基因治疗和细胞工程等领域具有广泛的应用。
在基因功能研究中，可以利用慢病毒转染实现基因敲除、过表达和靶向修饰等，进而研究基因在生理和病理过程中的功能。
在基因治疗中，慢病毒转染可以用于治疗遗传性疾病、肿瘤和传染病等，为基因治疗提供了重要的技术支持。
在细胞工程中，慢病毒转染可以用于改良细胞系，提高细胞的表达稳定性和产量，满足生物制药和工业生产的需要。
总结。
慢病毒转染是一种重要的基因转染方法，具有稳定、高效、广泛应用等特点。
通过慢病毒转染，可以实现外源基因在宿主细胞中的稳定表达，为基因功能研究、基因治疗和细胞工程等领域提供了重要的技术支持。
因此，深入理解慢病毒转染的原理和步骤，对于开展相关研究具有重要的意义。
质粒转染过程
质粒转染过程
质粒转染是一种基因工程技术，它是将外源质粒DNA传递到细胞内，使其能够被细胞所识别和表达。
转染质粒的方法主要包括化学法、电穿孔法、病毒载体法等。
下面将对这些方法进行详细介绍。
1. 化学法
化学法是一种常见的质粒转染方法，它的原理是利用化学物质破坏细
胞膜，使质粒DNA进入细胞内。
化学法的优点是易操作且适用于多种
细胞类型，但其缺点是转染效率较低。
2. 电穿孔法
电穿孔法是一种利用电场作用使细胞膜通透的转染方法，它的原理是
使用电极在细胞上产生高压脉冲电场，使细胞膜出现短暂的孔洞，从
而将质粒DNA传输到细胞内。
该方法的优点是转染效率高，但需要专
业仪器支持。
3. 病毒载体法
病毒载体法是一种利用病毒向靶细胞传递质粒DNA的转染方法。
在该
方法中，质粒DNA被包裹在病毒粒子中，病毒粒子通过靶细胞膜的结
合和透过性进入细胞内，释放质粒DNA。
病毒载体法的优点是转染效
率高，但其缺点是安全风险较高。
总的来说，不同的转染方法适用于不同的应用场景，需要根据具体情
况进行选择。
在进行质粒转染时，还需要注意合适的质粒浓度、转染时间和细胞密度等因素，以提高转染效率和细胞存活率。
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五、主要应用
1 、用于建造疾病的动物模型和药物 、 筛选模型 2 、用于基因治疗 3 、用于异种器官移植 4 、用于改良动植物品种和生产性能 5 、用于生产药用蛋白和保健蛋白 6 、用于生产人抗体
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2.分子生物学方法 、 外源基因是否真的转入靶细胞必须用 分子杂交方法进行证实。常用的方法 有原位杂交、Southern杂交。其中主 要问题是探针的选择。
四、外源基因的表达和检测
在筛选出转化子后还需要鉴定转导 、 细胞中外源基因的表达状况。其中包 括对目的基因和标记基因的鉴定。常 用方法有原位杂交、Northern杂交、 免疫组织化学染色等，原位及 Northern杂交是检测外源基因转录出 的mRNA,后者则是检测外源基因翻 译出的蛋白质。
分子生物学技术在药理中的应用
基因转染技术
LOGO
主要内容
1 2 3 4 5
概
述
基因运载系统 转染的基本过程 外源基因的表达和检测 主要应用
一 、 概述
基因转染的定义： 基因转染的定义：将具生物功能的核酸转移 或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生 物功能。 物功能。 将特定的遗传信息传递到真核细胞中， 将特定的遗传信息传递到真核细胞中，这种 能力不但革新了生物学和医学中许多基本问 题的研究， 题的研究，也推动了诊断和治疗方面的分子 技术发展，并使基因治疗成为可能。 技术发展，并使基因治疗成为可能。目前基 因转移技术已广泛用于基因的结构和功能分 基因表达与调控、 析、基因表达与调控、基因治疗与转基因动 物等研究。 物等研究。 基因转染技术： 基因转染技术：将纯化的含有靶基因的质粒 DNA送入细胞内，并在细胞内表达。 送入细胞内， 送入细胞内 并在细胞内表达。
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7、微粒子轰击法（基因枪） 、微粒子轰击法（基因枪）
在真空状态下，利用粒子加速器将外面 包裹了外源基因DNA的金颗粒或钨粉微 颗粒进行加速，打入完整的细胞中，从 而使外源基因DNA得以在靶细胞中稳定 转化并有可能获得表达。实验结果表明， 用这种方法靶基因可在皮肤、肌肉、肝、 胰、胃和乳腺等细胞中表达。
、
8、 DEAE-葡聚糖和polybrene聚阳 、 、 离子法
带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多 聚体复合物和带负电的DNA分子使得 DNA DNA可以结合在细胞表面。通过使用 DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复 合体导入。DEAE－葡聚糖仅限于瞬时 转染。
9、精子载体法 、
、 用精子和NDA（吡啶核甘酸辅酶 ）-剂 孵育，可捕获得DNA。通过受精过程， 将外源性基因导入受精卵，大大简化了 转基因动物的制备过程。 这项转染方 法是近年来才发展出来应用在鱼类转殖 的最新技术，它最大有点就是简单方便。
转染与分析
植物基因转染应用过程
（一）靶细胞的准备 被用于作靶基因转染的细胞，其生长状 态如何，将直接决定了基因转染效率。 、 如为贴壁生长的细胞，一般要求在转染 前一日，必需应用胰酶处理成单细胞悬 液，重新接种于培养皿或瓶，细胞密度 以铺满培养器皿的60%为宜，转染当日， 在转染前4小时换一将近新鲜培养液。 对于悬浮细胞，也需在转染前4小时换 一次新鲜培养液。
将氯化钙、DNA和磷酸盐缓冲液混合， 形成磷酸钙微沉淀 ，附着于细胞膜并 经过细胞内吞作用进入细胞质。 该方法的转化效率通常很低。
、
3、脂质体染法 、
脂质体能在体内或体外提供运载外源性 遗传物质进入细胞的载体。脂质体介导 的基因转移的最大优势在于能在活体内 应用。
、
、
图1. 阳离子脂质体介导的转染
（二）靶基因质粒DNA的准备 靶基因质粒 的准备 用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无 必须无蛋白质， 用于转染的质粒 必须无蛋白质 RNA和其它化学物质的污染， 和其它化学物质的污染， 和其它化学物质的污染 、 OD260/280比值应在 以上。DNA的 比值应在1.8以上 比值应在 以上。 的 质量和纯度能影响某些细胞系的转染效 可以通过CsCl梯度法或标准柱层 率，可以通过 梯度法或标准柱层 析法进行纯化。 析法进行纯化。
、
聚阳离子受体介导的转染过程
5、显微注射法
、
在显微镜下，将DNA经同细胞玻璃针直 接注入细胞，该法适合于各种培养生长 的细胞，但需要一定的设备和操作技巧。
6、电穿孔法 、
电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强 电脉冲中转导分子。即 利用脉冲场将 DNA导入培养细胞。电脉冲和场强的优 化对于成功的转染很重要。
（二）基因转移的病毒的方法 病毒作为基因转移是基因递送良好的工 病毒载体的优点有：（ ：（1） 具，病毒载体的优点有：（ ）在转化 、 的细胞中传播重组的DNA分子作为稳定 的细胞中传播重组的 分子作为稳定 的遗传成分；（ ）可能将有缺陷的或 的遗传成分；（2） ；（ 突变的基因置于病毒调节信号的控制下 以进行研究；（ ；（3） 以进行研究；（ ）能将克隆的基因作 为病毒微染色体的一部分 ，并能进行 分离；（ ；（4）转移效率较高。 分离；（ ）转移效率较高。其主要缺 点是病毒载体对外源基因的最大容纳量 只有2500bp。目前常用的病毒载体有 只有 。 下列几种。 下列几种。
受体介导的基因转移
直接注射法 磷酸钙共沉淀法 脂质体染法
分类
显微注射法 电穿孔法
微粒子轰击法 DEAE-葡聚糖和 polybrene聚阳离子法 精子载体法
1、直接注射法 、
将含有DNA的溶液直接注射到肌肉，以 引起邻近的细胞摄入DNA链进行表达， 在肌细胞中，基因表达可持续数月。
、
2、磷酸钙共沉淀法 、
（2） 基因缺陷型受体细胞的选择性 以基因缺陷型细胞作为靶细胞，将正常 、 基因导入基因缺陷型靶细胞后，使用选 择性培养基进行筛选。 （3） 基因共转染技术 将目的基因表达 载体DNA和标记基因表达载体DNA混合 后共同转移到靶细胞中，分别使用标记 基因和目的基因对应的选择剂进行两次 筛选，最后得到复合转导的转化子。
4、受体介导的基因转移 、
依靠受体介导的细胞内吞途径以转移外 源基因。受体介导的基因转移方法是在 质粒DNA和某种特异的多肽（配体）之 间形成复合体，而这种多肽能为细胞表 面的受体所识别。如若将DNA在体内运 送至肝内，可以选将DNA和能与肝细胞 受体特异结合的去唾液酸糖蛋白质偶
、
联，以便通过细胞内吞过程而被摄入， 这种DNA大部分被肝脏所摄取。应用该 、 方法转移的外源基因在活体内的表达持 续时间较短，在评估实际应用前境上还 在一些问题。
基因转染方法
方法分类
转染
通过生化或者 物理方法将目的 基因导入真核细 胞中 。
感染
通过病毒介导 ，用基因组中携 带有克隆目的片 断的病毒来感染 靶细胞。
二 、 基因运载系统
将某一特定的靶基因传递到靶细 胞，需要应用某一基因运载系统， 目前将这一系统概括为两大类： 非病毒方法和病毒方法
（一）非病毒方法
在目前的技术状态下，基因转染效率很难 、 达到100﹪。故必须首先将转导细胞和未转 导的细胞加以区分。这样的新技术发展很 快，常用的转导细胞筛选方法： 1.利用基因表达产物筛选法 （1） 标记基因筛选法 在载体上引入一个标记 基因，或同时导入标记基因，在转染后的 适当时间选用合适剂量的选择培养基，筛 选标记基因表型，那些已导入外源基因的 细胞将存活下来。
2、DNA病毒载体 、 病毒载体
主要有腺病毒相关病毒载体，疱疹病毒 载体。这一类是利用病毒载体介导的基 因转移，以其高转染率和良好的靶向性 成为肿瘤基因治疗的有效方法。对DNA 病毒载体的研究是当前基因治疗研究中 的重点领域。
、
病毒载体转染过程
三、转染的基本过程
靶细胞的准备
靶基因质粒DNA的准备 的准备 条件应参考所使用的试 剂和方法进行优化。 剂和方法进行优化。靶基因被导入细胞 、 一般在转染后48小时 小时， 后，一般在转染后 小时，靶基因即在 细胞内表达。根据不同的实验目的，48 细胞内表达。根据不同的实验目的， 小时后即可进行靶基因表达的检测等实 如若建立稳定的细胞系， 验。如若建立稳定的细胞系，则可对靶 细胞进行筛选， 细胞进行筛选，根据不同基因载体中所 含有的抗性标志选用相应的药物， 含有的抗性标志选用相应的药物，最常 用的真核表达基因载体的标志物有潮霉 素（hygromycin）和新霉素 ） （neomycin ）
1、逆转录病毒载体 、
、 逆转录病毒为RNA病毒，它们的基因组 编码在一条单链RNA上，病毒进入细胞 通过逆转录作用，病毒RNA即转变为双 链DNA分子，DNA进入细胞核并整合在 细胞染色体中，这种整合的病毒称为原 病毒。在原病毒的两端各有一长末端重 复序列（LTR）,LTR内侧还有为复制所 必需的其他顺序，包括包装信号。目前 常用的逆转病毒载体有CMV和SV。