课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

《土壤中分解尿素的细菌的分离与计数》
➢实验目的 从土壤中分离分解尿素的细菌并计数
培养基中以尿素为唯一氮源，只有能合成脲酶的微生
➢实验原理 物才能分解尿素，缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿
素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所 以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。
➢实验材料 小铁铲、培养皿、试管、移液管、锥形瓶等
（二）制备培养基 实验组：制备选择培养基 （尿素为唯一氮源的培养基）
筛选出能够分解尿 素的细菌
对照组：制备完全培养基 （牛肉膏蛋白胨培养基）
与选择培养基做对照， 检测选择培养基是否具 有选择作用
➢实验步骤——【3】样品稀释与涂布
判断选择培养基是否 具有筛选作用
选择培养基 完全培养基
➢实验步骤——【3】样品稀释与涂布
（3）测真菌数：一般用102、103、104稀释液
第一次做该实验时，可以将稀释的范围放宽一点，如可 以将103 ~ 107分别涂布到平板上培养。保证获得菌落数 在30～300之间、适于计数的平板
➢4】微生物的培养与观察
培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌：30～37℃培养1～2d 放线菌：25～28℃培养5～7d 霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。
➢实验步骤 实验结果
实验流程：
土壤取样 制备培养基 样品稀释涂布平板 微生物的培养与观察
菌落计数
（一）土壤取样 从富含有机物、潮湿、酸碱度适中的土壤中取样。铲 去表层土3cm左右，取样，将样品装入事先准备好的
信封中。 铁铲和信封都要灭菌
“微生物的天然培养基”
数量最大、种类最多
大约70%—90%是细菌 细菌适宜在富含有机质，酸碱度接近中性的潮湿土壤 中生长，绝大多数分布在约3~8cm的土壤层。

缺点： 不能区分死菌与活菌（数值偏大）； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；
计算公式： 每毫升原液含菌数=400×104×每小格平均菌体数×稀释倍数
2.间接计数法（活菌计数法-菌落） （1）常用方法：稀释涂布平板法。 （2）原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的 一个菌落是由一个活菌繁殖而成的。
培养基类型 实验组 以尿素为唯一
氮源的培养基
是否接种 目的
分离尿素
是
细菌
结果 只生长尿素细菌
对照组 牛肉膏蛋白胨
是
判断该培养基 生长多种微生物
培养基
有无选择性
二、研究思路 （一） 筛选菌株 （二）统计菌落数目 （三）设置对照
（二）统计菌落数目
1、显微镜直接计数： 利用血球计数板(血细胞计数板），在显微镜下计算一定容积里 样品中微生物的数量。
不加有机碳源 不加氮源 加入青霉素 加高浓度食盐 不加C、N源 石油是唯一碳源
自养微生物 固氮微生物 酵母菌和霉菌 金黄色葡萄球菌
自养固氮菌 能消除石油污染的微生物
4、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：
①从物理性质看此培养基属于哪类？ 固体培养基
②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？ 碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素
4、课题目的 ①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 ②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
二、研究思路
（一） 筛选菌株 （二）统计菌落数目 （三）设置对照
（一）筛选菌株
1、 科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶 PCR是一种在体外DNA复制的技术，此项技术要求使用耐高温 （930C）的DNA聚合酶。
3、例如： ①判断培养基中是否有杂菌污染：

去3cm表层土）。
2.制备培养基：
制备两种培养基： 牛肉膏蛋白胨培养基（完全培养基）—对照组 尿素为唯一氮源培养基（选择培养基）-实验组
将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨 培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养 基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以 作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选 择作用。
大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征 大肠杆菌的菌落呈黑色,有或无金属光泽
六.结果分析与评价
（一）培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是 否筛选出菌落
对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明 培养基没有被杂菌污染；
牛肉膏蛋白胨培养基(完全培养基)中菌落数目 明显多于选择培养基，说明选择培养基已筛选出一 些菌落。
因此，还需借助生物化学方法对分离的细菌 作进一步的鉴定。(筛选后必鉴定)
五、课外延伸
1、对分离的菌种作进一步的鉴定，还 需要借助 生物化学 的方法。
2、在细菌分解尿素的化学反应中，细 菌合成的 脲酶 将尿素分解成了 氨 。 氨会使培养基的碱性 增强 ，PH 升 高 。因此，我们可以通过检测培养 基 pH 变化来判断该化学反应是否发 生。
以防被
致病微生物
感染，实验
后一定要洗手。
当堂训练
1.使用选择培养基的目的是（ C ） A.培养细菌 B.培养真菌 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加
以区别
2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分
别是( D )
A.CO2和N2 C.CO2和尿素
B.葡萄糖和NH3 D.葡萄糖和尿素
（二）统计菌落的数目
采用什么方法可以统计每克土壤样品中究 竟含有多少这样的细菌呢？

课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数研究思路（一）筛选菌株1、尿素是一种重要的氮肥，农作物（能，不能）直接吸收利用，而是首先通过土壤中的细菌将尿素分解为，这是因为细菌能合成。

2、PCR技术中使用的耐高温的酶是，它是从中分离出来的。

科学家能从中把筛选出来是因为，这样也适用于实验室中微生物的筛选，原理是_ 。

点评：生物适应一定环境，环境对生物具有作用。

所以通过配制选择培养基、控制培养条件等选择目的微生物。

〖本课题使用的培养基——见旁栏资料〗〖思考1〗在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是，提供氮源的的是，琼脂的作用是。

〖思考2〗该培养基对微生物（具有，不具有）选择作用。

如果具有，其选择机制是。

3、选择培养基是指特定种类的微生物生长，同时其他种类微生物生长的培养基（二）统计菌落数目1、在统计菌落数目时，常用来统计样品中活菌数目的方法是。

除此之外，也是测定微生物数量的常用方法。

【补充】显微镜直接计数是测定微生物的方法。

公式：观察到的红细胞平均数∶观察到的细菌平均数＝红细胞含量∶细菌含量2、统计菌落数目的理论依据是：当样品的稀释度足够时，_ 。

通过统计，就能推测出样品中大约含有多少活菌。

因此，恰当的是成功地统计菌落数目的关键。

3、．为保证统计结果准确，通常将都涂布在平板上，培养后再选择的平板进行计数。

4、在设计实验时，一定要涂布至少个平板作为重复组，才能增强实验的说服力和准确性。

在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果，结果，意味着操作有误，需要重新实验。

〖思考3〗统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的计算方法是_ 〖思考4〗第位同学的结果接近真实值。

你认为这两位同学的实验需要改进的操作是第一位同学需；第二位同学_ 。

5、统计的菌落数比活菌的实际数目。

因为当两个或多个细胞时，平板上观察到的只是菌落。

因此，统计结果一般用来表示。